岡 山 医 誌 (1992) 104, 763∼775
難治性喘 息におけ る好 中球 の
役割 に関す る研究
第1編
好 中 球 か ら のLeukotrienes産
生 能 及 びsuperoxide産
生 能 に 関 す る 検 討
岡 山大 学 医学 部 第 二 内科 学 教 室(指 導:木 村 郁 郎 教 授)
清
水
一
紀
(平成4年4月20日
受稿)
Key words:難
治性 喘 息,好 中球,ロ イ コ ト リエ ン,ス ーパ ー オ キサ イ ド
緒 言 気 管 支 喘 息 に お け る 病 態 は, IgE抗 体 を 介 し て 肥 満 細 胞 ・好 塩 基 球 系 が ヒ ス タ ミ ン を 遊 離 す る い わ ゆ る ア トピー の 反 応 系 が 古 くか ら知 ら れ て い る.し か し 特 異 的IgE抗 体 の 存 在 や 好 酸 球 増 多,ヒ ス タ ミン 遊 離 な ど を 認 め ず,前 者 と は 異 な っ た 病 態 と考 え ら れ る喘 息 も 日常 多 く経 験 す る.こ の 様 な 喘 息 は 教 室 の 一 連 の 研 究 に よ り,中 高 年 に 発 症 し重 症,難 治 性 喘 息 に 進 展 し1), し か も そ の 肺 胞 洗 浄 液 中 に は 好 中 球 が 増 加 して い る こ と2),好 塩 基 球 のIgGレ セ プ ター が 増 加 し,反 応 好 塩 基 球 が 増 加 して い る成 績3)等 か ら, か か る 中 高 年 発 症 型 喘 息 の 難 治 化 に 好 中 球 及 び IgG系 の 免 疫 反 応 が 関 与 す る 可 能 性 が 想 定 さ れ て い る1).一 方, 1979年 にSamuelssonら がslow react
ing substance of anaphilaxis (SRS-A)の 本 態 を 解 明 し,そ の 特 異 構 造 よ り ロ イ コ ト リエ ン (Leukotrienes, 以 下LTs)と 命 名 し た4).こ のLTsは 現 在, SRS(も し くはSRS-A)作 用 を持 つ ペ プ チ ドLTs (LTC4, LTD4, LTE4) 5) と 強 力 なNCA活 性 を持 つLTB4 6) 7)が知 ら れ て お り,そ れ ら が 好 中球8),好 酸 球9)-12)を 中 心 と し た 顆 粒 球 よ り産 生 さ れ る こ と も 判 明 して い る. さ ら に,気 道 粘 膜 剥 離 性 病 変 に よ る気 道 過 敏 性 亢 進 が 喘 息 の 重 症 化 に 関 与 す る報 告13)や,気 道 粘 膜 に 好 酸 球 と共 に好 中 球 の 浸 潤 が 認 め られ る14)こ と な どか ら,好 中 球 の も つ プ ロ テ ア ー ゼ や エ ラ ス タ ー ゼ,活 性 酸 素 な ど の 組 織 障 害 性 を有 す る 化 学 伝 達 物 質 の 関 与 が 示 唆 さ れ る.そ こ で,喘 息 の 重 症 化 に お け る 好 中球 の 役 割 を知 る 目 的 で, 喘 息 患 者 好 中 球 か らのLTs及 びsuperoxide(以 下O2-)産 生 能 を検 討 し興 味 あ る 成 績 が 得 ら れ た の で 報 告 す る. 対 象 と 方 法 1. 対 象 対 象 は,岡 山 大 学 第2内 科 呼 吸 器 外 来 に 通 院 あ る い は 入 院 中 の 気 管 支 喘 息 患 者99例(18∼73 歳,平 均41.6±16.3歳;男 性58例 女 性48例)を 選 ん だ.そ の う ち 吸 入 ア レ ル ゲ ン のIgE RAST ス コ ア や 即 時 型 皮 内 反 応 が 陽 性 の もの62例,そ れ ら が 陰 性 の もの は,37例 で あ っ た.ま た,重 症 度 別 で は 日本 ア レ ル ギ ー 学 会 の 重 症 度 分 類 に て 軽 ・中 等 症 に 相 当 す る58例 と重 症41例 で あ り, 病 型 診 断 時 か ら過 去1年 間 に プ レ ドニ ゾ ロ ン (PSL)換 算5mg/日 以 上 を 内 服 し て い る ス テ ロ イ ド依 存 性 難 治 性 喘 息 は29例 を 占 め て い た.か か る 喘 息 患 者 の 採 血 は 非 発 作 時 に お こ な い,少 な く と も 採 血 前 或 は 採 血 後6時 間 以 内 に 発 作 を 認 め た 症 例 は 検 討 か ら 除 外 し た.な お 対 照 に は 健 常 人18例(21歳 ∼60歳,平 均31.3±10.4歳; 男 性13例 女 性5例)を 選 ん だ. 763
764 清 水 一 紀 2. 方 法 1) 好 中 球 分 離 方 法 ヘ パ リ ン 化 静 脈 血35mlを 肘 静 脈 よ り採 取 し, 6%デ キ ス トラ ン4mlを 加 え て 室 温 に1時 間 静 置 後, HISTOPAQUE(R)とPERCOLL(R)を 5.625:1の 割 合 で 作 成 し た 比 重1.085溶 液 と HISTOPAQUE(比 重1.077)を4mlず つ 重 層 し た シ リ コ ン 化 遠 沈 管 に,得 ら れ た 白 血 球 を5ml ず つ さ ら に 重 層 し, 4℃ で120G, 20分 間 遠 沈 し て 好 中 球 分 画 を得 た.そ の 純 度 はHinkelmann 液 に よ る染 色 で 平 均97%で あ り,混 入 細 胞 の 大 多数 は 好 酸 球 で あ っ た.ま たtoluidine blue染 色 に よ る細 胞 生 存 率 は95%以 上 で あ っ た.こ の 細 胞 浮 遊 液 に 蒸 留 水2mlを 添 加 し低 張 処 理 に て 赤 血 球 を 溶 血 させ た 後,同 量 の1.8%食 塩 水 を 加 え て 等 張 に も ど し た.こ う し て 得 ら れ た 好 中 球 分 画 を4℃ で150G, 10分 間 遠 沈 後, LTs測 定 用
と し てTris buffer(ヒ トア ル ブ ミン, Ca++, Mg++添 加, pH 7.38)に て7×106PMNs/mlに 細
胞 数 を 再 調 整 し,ま たO2-測 定 用 に は Krebs ringer phosphate buffer (KRP, pH 7.40) 5×
105PMNsと し た. 2) LTs産 生 能 の 測 定 先 ず 前 述 の 方 法 で 得 た 好 中 球 分 画1mlを 遮 光 し た 試 験 管 内 に 移 し, Calcium ionophore A23187 (Cal)を5μg加 え て37℃, 15分 間 反 応 さ せ た.そ の 反 応 液 に4倍 量 の 氷 冷 し た99.5%エ タ ノ ー ル を加 え てLTsを 抽 出 後,窒 素 ガ ス に て 置 換 後 密 封 し測 定 時 ま で-80℃ で 保 存 し た.次 に,遠 沈 し た エ タ ノ ー ル 混 合 液 の 上 清 を con-centrator TC-8(大 洋 化 学 工 業 社 製)に て 蒸 留 濃 縮 し, 10%ア セ トニ ト リル500μlで 再 度 溶 解 した の ちC18 ODSカ ー ト リ ッ ジ カ ラ ム を用 い て 精 製 を 行 っ た.カ ー ト リ ッ ジ カ ラ ム に よ る精 製 法 は 以 下 の ご と く行 っ た.す な わ ち 検 体1ml に つ き0.25mlの2M塩 酸 を解 凍 し た 保 存 検 体 に 加 え た 後 よ く混 和 し, 3000rpm 30分4℃ で 遠 沈 し得 た 上 清 を,前 処 理 と し て メ タ ノー ル2ml, 水2mlを 通 し た カ ー ト リ ッ ジ カ ラ ム に 注 入 し, そ の 後,水5ml,ヘ キ サ ン2ml, 10%エ タ ノー ル5mlの 順 に 通 した 後,ギ 酸 メ チ ル3.5mlに て 回 収 し た.こ れ をevapolatorに て 蒸 留 濃 縮 し た 後, 50%ア セ トニ ト リル500μl/mlで 溶 解, HPLC 用 マ イ ク ロサ ン プ ル チ ュ ー ブ に 入 れ, 3000rpm 30 分4℃ で 遠 沈 後 上 清 を 再 度HPLC用 マ イ クロ チ ュ ー ブ に 入 れHPLC用 の 検 体 と し た.こ の う ち 150μlをTSK-GEL ODS-120T (東 ソ ー 社 製) カ ラム を用 い た高 速 液 体 ク ロマ トグ ラフ ィー (High performance liquid chromatography, HPLC, Waters社 製)に 注 入 し た. LTsの 溶 出 は ア セ トニ ト リル ・水 ・メ タ ノ ー ル ・酢 酸 の 混 合 液 (pH 5.6)を 用 い, UV280nmに て 検 出 し た. 各LTsの 同 定 は,合 成, LTC4, LTB4の ピ ー ク に 相 当 す る 溶 出 時 間 で 判 定 し,そ の 分 画 を分 取 し て モ ル モ ッ ト回 腸 を用 い たbioassay法 に よ り そ の 収 縮 能 を 検 討 し た. LTsの 定 量 は,既 知 量 の 合 成LTC4, B4で 得 られ た 溶 出 曲 線 の ピ ー ク の 高 さ と面 積 を 測 定 し注 入 量 と 比 較 し た結 果,各LTsと も ピ ー ク の 高 さ の 方 が よ く相 関 す る こ と か ら, Fig. 1のLTC4の 標 準 直 線 に 示 す ご と き各 標 準 直 線 か ら 算 出 し,好 中 球 分 画7× 106個 当 りのLTs産 生 能 と し て 表 現 し た. 3) O2-産 生 能 の 測 定 教 室 の 方 法 に 準 じて15)以下 の 如 く行 っ た.す な わ ち,ま ず65μMの 酸 化 型 チ トク ロー ムCを 含 むKRPに 前 述 の 好 中 球 分 画0.5mlを 加 え て37℃ で5分 間 反 応 させ,次 い で10μg/mlの コ ン カ ナ バ リ ンA20μlと ジ メ チ ル ス ル フ ォ キ シ ド(DMSO) に 溶 解 し た20μg/mlの サ イ トカ ラ シ ンD20μlを, 最 終 反 応 液 量 が2.0mlと な る よ うに 同 時 に 添 加 し た.か か る反 応 に よ り産 生 さ れ たO2-で 還 元 さ れ る チ ト ク ロ ー ムCの 吸 光 度 の 変 化 を double
Fig. 1 Standard line of leukotriene C4. Am ount of leukotriene C4 was measured by peak height of elution curve.
難 治 性 喘 息 にお け る好 中球 の役 割
765
beam spectro-photometer UV-210A(島 津) を 用 い てUV550nmで 測 定 し,好 中球 分 画106個 当 りのO2-産 生 能 と し て 表 現 し た.
4) 統 計 学 的 検 討
成 績 の 数 値 はLTsに つ い て は7×105個, O2-で は106個 当 りの 産 生 量 をmean±SDO2-で 表 現 し, 有 意 差 の 検 定 は, student's testを 用 い, Pvalue はP<0.05を 有 意 と し た. 結 果 1. HPLCに よ るLTsの 同 定 と定 量 喘 息 患 者 の 好 中球 分 画 をCalで 刺 激 す る と Fig. 2の 実 線 で 示 す 溶 出 曲 線 が 得 ら れ た.次 い で,同 一 検 体 に 合 成LTC4, LTD4, LTB4を 加 え る と,破 線 の ご と く各LTsの 溶 出 時 間 に 一 致 し た 位 置 に ピ ー ク の 増 加 が み られ た こ と か ら, 対 応 す る検 体 の ピ ー クが 各LTsと 判 定 さ れ た. さ らに,検 体 のLTC4あ る い はLTD4に 相 当 す る ピ ー ク の 分 画 を採 取 してbioassayを 行 っ た 結 果, Fig. 3 (A) (LTC4分 画)の ご と く モ ル モ ッ ト回 腸 の 収 縮 が み ら れ,抗SRS-A剤 で あ るFPL55712の0.1μg/mlで 完 全 に 収 縮 が 回 復 し た.な お,合 成LTD4に よ る収 縮 もFig. 3 (B) の ご と く同 様 の 態 度 を示 し た こ とか ら,か か る 分 画 は 平 滑 筋 収 縮 能 を 有 す る こ と が 確 認 され た. 2. LTC4回 収 率 試 料 に3H-LTC4を 加 え,各 分 画 の 放 射 活 性 を RIA法 に て 測 定 し 回 収 率 を 確 認 し た. con centratorに よ る 蒸 発 濃 縮 で は,完 全 乾 固 し た 状 態 で は 平 均26.4%の 回 収 率 で あ っ た の に 比 し, 不 完 全 で や や 液 状 な 状 態 で は 平 均88.6%の 回 収 率 で あ っ た.ま た,カ ー ト リ ッ ジ カ ラ ム の 処 理 方 法 が 水,エ ー テ ル, 80%エ タ ノー ル の 順 に よ る 方 法 で は 平 均84.8%で あ っ た の に 比 し,水, ヘ キ サ ン, 10%エ タ ノー ル,ギ 酸 メ チ ル の 順 に よ る処 理 で は 平 均95.6%で あ っ た. 3. LTs産 生 能 に お け る 至 適 濃 度 と反 応 時 間 好 中 球 分 画 か らLTsを 産 生 す るCal刺 激 の 至 適 濃 度 を 検 討 す る た め,最 終 濃 度 が2.5μg/ml, 5μg/ml, 7.5μg/ml, 10μg/ml, 12.5μg/mlと な る よ う にCalを 添 加 した と こ ろ, LTC4, LTB4と も5μg/ml, 7.5μg/mlで 最 大 の 産 生 能 を 示 し た (Fig. 4).ま た,反 応 時 間 はFig. 5の ご と く LTC4は15, 20分, LTB4は15分 で 最 大 の 産 生 能 を 示 し た. 4. 気 管 支 喘 息 及 び健 常 人 末 梢 血 好 中 球 のLTs 産 生 能 好 中 球 分 画 のCal刺 激 に よ るLTs産 生 能 を 検 討 す る と, LTC4は 健 常 人 が6.4±6.9ng/7× 106PMNsに 比 し て,喘 息 患 者 で は23.1±20.0ng と推 計 学 的 に 有 意 に 高 い 産 生 能 を示 し た(p< 0.01).ま た, LTB4は 健 常 人1.2±1.3ngに 比 し, 喘 息 群 が5.0±4.8ngと 高 い産 生 能 を示 した (p<
Fig. 2 Elution curve of leukotrienes by HPLC. The arachidonic acid production from neutrophil-rich fraction stimulated by Cal was shown by solid line. The peak of broken line by the same sample in-cluded with authentic leukotriene C4, D4 and B4 were estimated by the elution time of each leukotrienes production.
Fig. 3 Contraction of guinea pig ileum by (A)
the fraction of leukotriene C4 from
neutrophil-rich fraction stimulated by
Cal. and (B) authentic LTD4 (10ng).
These contractions were disolved by
766 清 水 一 紀
Fig. 4 Effect of the Cal concentration on LTC4 (•Z) and LTB4 (•œ) production from n eutrophil-rich fraction. Each point rep-resents the mean•}SD of six different experiments. 0.01) (Fig. 6). 次 に,喘 息 の 各 病 態 間 で のLTs産 生 能 の 検 討 を 行 つ た.ま ず 吸 入 ア レ ル ゲ ン のIgE RASTま た は,即 時 型 皮 内 反 応 が 陽 性 群 のLTC4は19.6± 17.6ng, LTB4は4.2±4.2ngで あ っ た が,そ れ ら が 陰 性 群 のLTC4は26.2±23.4ng, LTB4は 5.5±5.2ngで あ り,両 群 間 のLTs産 生 能 に は 有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た(Fig. 7). さ ら に 喘 息 群 を重 症 度 別 に 比 較 す る と, LTC4, LTB4と もに 軽 ・中 等 症 群 と重 症 群 間 に 有 意 差 は 認 め られ,なか っ た(Fig. 8). 次 に 難 治 性 喘 息 群 と非 難 治 性 喘 息 群 と で 比 較 し た 結 果,非 難 治 群 がLTC418.8±18.8ngに 比 し難 治 群 はLTC437.3±33.8ngと 有 意 に 高 値 を 示 し た(p<0.01).一 方, LTB4は 非 難 治 群4.4± 4.5ng, 難 治 群5.2±.2ngと 両 群 間 に 差 は 認 め ら れ な か っ た (Fig. 9).
Fig. 5 Time course of LTC4 (•Z) and LTB4 (•œ) production from neutrophil-rich fraction stimulated Cal (5ƒÊg/ml). Each point represents the mean•}SD of six different experiments. さ ら に,難 治 性 喘 息 に お け る ス テ ロ イ ドの 影 響 を検 討 す る た め に,プ レ ドニ ゾ ロ ン(以 下PSL) 換 算10mg/日 未 満 群(PSL<10mg)と10mg/日 以 上 の 群(PSL≧10mg)に お け る好 中球 か ら のLTs 産 生 能 を比 較 検 討 し た が,LTC4, LTB4と も に 両 群 間 に 有 意 差 は 認 め られ な か っ た(Fig. 10). 5. 末 梢 血 好 中球 のO2-産 生 能 次 に,好 中 球 分 画 のO2-産 生 能 を 検 討 し た と こ ろ,Fig. 11の ご と く健 常 人 と 喘 息 群 間 に 有 意 差 は 認 め られ な か つ た.さ ら に,喘 息 群 の う ち 吸 入 ア レ ル ゲ ン のIgE RASTま た は 即 時 型 皮 内 反 応 が 陽 性 と陰 性 群 間 の 検 討 で も,同 様 に 有 意 差 は 認 め られ な か っ た(Fig. 12).ま た,重 症 度 別 で は,軽 ・中 等 症 群 と 重 症 群 間,並 び に 非 難 治 群,難 治 群 で は い ず れ も有 意 差 は 認 め られ な か っ た (Fig. 13, 14). さ ら に ス テ ロ イ ド剤 の 影 響 を,難 治 性 喘 息 群 の う ち でPSL 10mg/日 未 満 と そ れ 以 上 の 群 に つ い て 比 較 す る と,未 満 の 群 は7.40±0 .90nmolと, 10mg/日 以 上 の 群 の5.10±1.60nmolに 比 し て
難治 性 喘 息 に おけ る好 中球 の 役 割
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Fig. 6 A production of leukotriene C4 and B4 from neutrophil-rich fraction of bron-chial asthma and healthy subiects by
Cal. O2-産 生 能 が 推 計 学 的 に 有 意 に 高 か っ た(p< 0.01) (Fig. 15).ま た,こ のPSL 10mg/日 未 満 群 は 非 難 治 群 と比 較 し て も 高 く,有 意 差 が 認 め ら れ た(p<0.05). 6. LTsとO2-の 相 関 健 常 者 及 び 気 管 支 喘 息 患 者 に お け るLTC4, LTB4の 相 関, LTC4とO2-の 相 関, LTB4とO2-の 相 関 はTable 1に 示 す ご と く,健 常 人 で は各 々 の 項 目で 相 関 が 認 め ら れ な か っ た が,喘 息 で は LTC4とLTB4の 間 に 相 関 係 数=0.24226, LTB4 とO2-の 間 に は 相 関 係 数=0.47204の 相 関 が 認 め ら れ た(p<0.05). 考 察 気 管 支 喘 息 の 発 症 に はIgE抗 体-肥 満 細 胞-ヒ ス タ ミ ン に よ る 機 序 が 広 く知 ら れ て い る が,近 年 成 人 の 特 に 中 高 年 発 症 の 難 治 性 喘 息 はIgE以 外 の 抗 体 を 介 して 好 酸 球,好 中 球 な ど の 炎 症 細 胞 か ら産 生 放 出 さ れ る 種 々 の 化 学 伝 達 物 質 に よ っ て 発 症 す る こ と が 想 定 さ れ て い る.そ こ で 著 者 は 喘 息 患 者 の 好 中 球 の 役 割 を 明 らか に す る 目
的 で,各 種 刺 激 に対 す るロイ コ トリエ ン及
びO2-産 生 能 を検 討 した.そ の結 果,喘 息患 者 の 好 中
球 分 画 はCal刺
激 に よ るLTs産
生 能 が健 常 者
よ りも亢進 してお り,し か も難 治性 喘 息ほ どそ
の傾 向 は著 明 であ った.さ らに好 中球 の重 要 な
化 学 伝達 物 質 の ひ とつ で あ り,組 織 障 害 的 に作
用 しう るO2-産 生 能 もPSL
10mg以 下 の難 治群
で は その 産生 能 が 亢進 しで いた.
Fig. 7 A production of leukotriene C4 and B4 from neutrophil-rich fraction of bron-chial asthma by Cal. The production of LTs was compared with type of bron-chial asthma. ロ イ コ ト リエ ン(LTs)は, 1979年 にSamueles sonら に よ り発 見 さ れ た5-リ ポ キ シ ゲ ナ ー ゼ 系 ア ラ キ ドン酸 代 謝 産 物 で,強 力 な 平 滑 筋 収 縮 作 用5) 16)及び 血 管 透 過 性 作 用17) 18)を持 ち,か つ て SRS (SRS-A)と い わ れ た ぺ プ チ ドLTs類5) (LTC4, LTD4, LTE4)と, NCA活 性 を持 つ LTB4 6) 7)とが あ り,顆 粒 球8) -12) 19) 20)や肺 組 織21)な どに よ り産 生 さ れ る こ とが 判 明 して い る. Weller ら は 好 中球 か ら産 生 さ れ るLTB4はLTC4の6 倍9), Borgeatら は10-25倍22)と 報 告 して い る が, 今 回 の 検 討 で はLTC4の 産 生 が 多 い 症 例 もLTB4
768 清 水 一 紀
Fig. 8 A production
of leukotriene
C4 and B4
from neutrophil-rich
fraction
of
bron-chial asthma by Cal. The production
of
LTs was compared
with severity
of
bronchial
asthma
due
to definit
of
Japanese Allergology
Sociesies.
の 産 生 が 多 い 症 例 も あ り,一 定 の傾 向 を認 め な か っ た. ま た,喘 息 患 者 好 中 球 か ら のLTs産 生 能 を 検 討 す る場 合,好 酸 球 の 混 入 を考 慮 し な け れ ば な ら な い.本 検 討 に お い て も,分 離 さ れ た 好 中 球 分 画 中 に は 低 率 な が ら好 酸 球 が 混 入 し て い た. か か る好 酸 球 か ら のLTC4の 産 生 能 に つ い て, Kayら は 好 中球 に 比 べ て3か ら5倍, LTB4は 逆 に1/3な い し1/5倍 と し11), Wellerら もLTC4 は 約10倍, LTB4は1/109)と 報 告 し て い る.今 回 の 検 討 で は, LTC4は 好 中 球 の2.5-75倍(平 均 21.3倍)と 症 例 に よ りば ら つ き が 大 き い も の の か な りの 産 生 能 を有 して お り,今 回 示 し た 成 績 に 好 酸 球 由 来 のLTC4が 一 部 含 ま れ て い る こ と は 否 定 で き な か っ た. ま た, LTB4に つ い て は 好 酸 球 か らの 産 生 は 殆 ど認 め ら れ ず,好 中 球 由 来 と考 え られ た が,そ の 産 生 能 に つ い て は 著 者 の 検 討 結 果 と同 様,喘 息 患 者 好 中 球 か らのLTC4, LTB4産 生 能 と も健 常 人 に 比 し亢 進 を 認 め た と一 致 す る報 告23) 24)と, LTC4の み 産 生 能 の 亢 進 を 認 め た もの のLTB4産 生 能 は 健 常 人 と差 が な い とす る報 告25)が あ る.こ れ に 関 し て,5-リ ボ キ シ ゲ ナ ー ゼ 活 性 が 喘 息 患 者 顆 粒 球 で は 亢 進 して い る と の 報 告26)や,抗 ア レ ル ギ ー 剤 で あ る ア ゼ ラ ス チ ン ハ イ ド ロ ク ロ ラ イ ドのLTs産 生 抑 制 効 果 はLTC4, LTB4と も同 程 度 認 め ら れ る22) 27)こと な どか ら,好 中 球 が 活 性 化 さ れ た 場 合 は, LTA4か らLTC4へ の 変 換 酵 素 で あ る グ ル タ チ オ ン-S-ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ が 特 異 的 に 活 性 化 さ れ な い 限 りLTC4, LTB4と も産 生 が 亢 進 す る も の と考 え ら れ る.し か し,重 症 難 治 群 と非 難 治 群 と の 検 討 で は, LTC4産 生 能 の み 亢 進 しLTB4は 有 意 差 を認 め な か っ た こ とや, 発 作 時 にLTC4産 生 能 は 亢 進 す る がLTB4は 変 化 を認 め な い と い っ た 報 告25)な ど,喘 息 の 病 態 の 相 違 に よ りLTC4とLTB4の 解 離 を 認 め て お り, 今 後 酵 素 レ ベ ル の 検 討 が 必 要 と 思 わ れ る. 一 方,活 性 酸 素 は フ リー ラ ジカ ル で あ るSuper
oxide anion, Hydroxy radical,非 ラ ジ カ ル で Fig. 9 A production of leukotriene C4 and B4 from neutrophil-rich fraction of bron-chial asthma by Cal. The production of LTs was compared with severity of bronchial asthma due to definit of in-tractable asthma.
難 治性 喘 息 に お け る好 中球 の役 割
769
Fig. 10 A production of leukotriene C4 and B4 from neutrophil-rich fraction stimulated by Cal. The production of LTs was compared with asthmatics of PSL (<10 mg/day) and PSL (•†10mg/day) asth-matics.
あ るHydrogen peroxide, Singret oxygenな どが 知 ら れ て お り,貪 食 後 の 細 胞 内 殺 菌 の 主 役 を担 っ て い る が,他 方 組 織 障 害 に 働 き種 々 の 病 態 に 関 与 す る こ とが 注 目 され て い る28).炎 症 像 に お け るO2-の 役 割 は,ラ ッ トの カ ラ ゲ ニ ン 浮 腫 をscavengerで あ るsuperoxide dismutase
(SOD)が 抑 制 す る こ と29)か ら も 明 らか で,呼 吸 器 疾 患 に お い て も成 人 呼 吸 窮 迫 症 候 群30)や 特 発 性 間 質 性 肺 炎31) 32),ブ レ オ マ イ シ ン肺 臓 炎33)な どの 病 態 に お い てO2-の 関 与 が 考 え ら れ て い る 事 や,高 濃 度 の 酸 素 吸 入 に よ り肺 損 傷 を起 こ す 報 告34)な どか ら 活 性 酸 素 の 組 織 及 び 細 胞 障 害 性 は 明 らか で あ る.し か し,こ れ ら の 疾 患 群 は 明 ら か な 形 態 変 化 を 示 す も の で あ り,気 管 支 喘 息 の よ う な 機 能 的 変 化 を特 徴 とす る 疾 患 にO2-の 関 与 は 想 像 し 難 い 感 が あ る.し か し,好 酸 球 を 中心 と し た 古 典 的 ア レル ギ ー 性 炎 症 の 考 え方 は, 新 し い 化 学 伝 達 物 質 の 発 見 や ミ ク ロ の 分 野 で の 進 歩 に よ り変 遷 し,気 管 支 喘 息 に お い て も粘 膜 剥 離 性 変 化 が 存 在 す る こ とが 証 明13) 35)され て い る. 難 治 性 喘 息 患 者 好 中球 か ら のO2-産 生 能 亢 進 と い う今 回 の 結 果 は,慢 性 気 道 閉 塞 性 疾 患 患 者 に お け るO2-と 気 道 過 敏 性 とが 相 関 す る報 告36)や, 喘 息 患 者 のO2-産 生 能 は 健 常 人 よ り亢 進 し て お り し か も気 道 過 敏 性 が 亢 進 し て い る 喘 息 の 方 が O2-産 生 能 が 高 か っ た との 報 告37)な どか ら考 え合 わせ て,気 道 に 浸 潤 し た好 中 球 か ら発 生 す るO2-が 喘 息 の 組 織 的 変 化 を起 こ し,そ の 結 果 気 道 過 敏 性 の 亢 進 を 誘 導 し て 喘 息 の 重 症 化 に 至 る と い っ た 推 論 が 成 り立 つ.し か し,O2-と と も に 重 要 な 活 性 酸 素 で あ る H2O2を 反 映 す る chemiluminescence法(CL法)で は,全 血 法 で の 実 験 系 で は 喘 息群 のCLは 亢 進 して い る が38), 好 中球 分 画 を 使 用 し た 実 験 系 で は 健 常 人 と差 が な い39)な ど,ま だ 不 明 な 点 も 多 く残 さ れ て い る. こ の よ う に 難 治 性 喘 息 の 病 態 下 で は,好 中 球 が 活 性 化 さ れ て い る こ とが 考 え られ る が,そ の
Fig. 11 Superoxide
production
from
neutrophil-rich fraction
of bronchial
asthmatics
and healthy subjects stimulated
by Con
A using
a Cytochrome
C reduction
method.
770 清 水 一 紀
Fig. 12 Superoxide production from neutrophil-rich fraction of bronchial asthmatics stimulated by Con A using a Cyto-chrome C reduction method. The pro-duction of superoxide was compared with type of bronchial asthma.
活 性 化 機 構 に 化 学 伝 達 物 質 の 影 響 が 考 え られ る. LTB4は 好 中 球 遊 走 因 子 で あ り,か つO2-産 生 能 を 亢 進 させ る40)こ と も知 られ て い る が,今 回 の 検 討 で 健 常 人 で は 認 め ら れ な か っ たLTB4産 生 能 とO2-産 生 能 の 相 関 が 喘 息 群 に お い て 認 め られ た こ と よ り,O2-産 生 にLTB4は 重 要 な 役 割 を担 っ て い る も の と推 測 さ れ る.さ ら にLTB4以 外 に も,PAF刺 激 に よ り好 中 球 が 活 性 化41)さ れ, O2-産 生42)やLTB4産 生 が 起 こ る43)こ とや,そ の 他 のC5a, IL-844)な ど好 中 球 を 活 性 化 す る 化 学 伝 達 物 質 が 新 た な 化 学 伝 達 物 質 や,組 織,細 胞 障 害 性 物 質 の 産 生 とい っ た 炎 症 の 増 幅,長 期 化 を 起 こ し,喘 息 を 重 症 化 に 至 ら しめ る も の と考 え ら れ る.む ろ ん,O2-はscavengerの 存 在 や xanthineoxidase(XOD),金 属 イ オ ン な ど様 々
な要素28)によ り,ま たLTsは
そ の感 受 性 に よ り
影響 され る45)た
め,好 中球 活 性化 とその組 織 障害
性,及 び重 症 化 は 単純 に結 び付 け られ る もの で
は ない.し か し,ア トピー 性 疾 患 でO2-産 生能
が 亢 進 して い るこ と46)や,軽症 喘 息 にお いて も気
管 粘 膜 上 皮の剥 離 が 認め られ た との 報告47)などが
増 えつ つ あ り,ア レル ギ− 炎 症 にお け る好 中球
の気 道組 織 障 害 作 用 に も注 目す る必要 が あろ う。
かか る観 点 か ら,将 来 臨床 応用 され るで あ ろ う
SODの
よ うな好 中球 に対 す る治 療 的 アプ ロー チ
が,喘 息 の 重 症難 治化 の一 治療 法 と して 有 用 と
な る可 能 性 が あ る.
Fig. 13 Superoxide
production from
neutrophil-rich fraction of bronchial asthmatics
by
stimulated
by Con A using
a
Cyto-chrome C reduction
method.
The
pro-duction
of superoxide
was compared
with severity of bronchial asthma due to
definit of Japanese
Allergology
Soci-eties.
結
論
難 治性 喘 息 にお け る好 中球 の 役 割 を明 らか に
す る 目的 で,末 梢 血好 中球 を精 製(≧95%)し,
難治 性 喘 息 に お け る好 中球 の 役割
771
+Fig
. 14 Superoxide production from
neutrophil-rich fraction of bronchial asthmatics by
stimulated by Con A using a
Cyto-chrome C reduction method. The
pro-duction of superoxide was compared
with severity of bronchial asthma due to
definit of intractable asthma.
Cal刺 激 を加 え た 際 のLTs産 生 能 をHPLCに て 定 量 し,同 時 に チ ト ク ロ ー ムC還 元 法 に よ る superoxide産 生 能 も 測 定 し以 下 に 示 す 結 果 を え た. 1. Cal刺 激 で は 健 常 人 に 比 し喘 息 群 でLTC4, B4の 産 生 能 が い ず れ も有 意 に 亢 進 して お り(P< 0.01),特 に 重 症 難 治 群 で は 非 難 治 群 に 比 し LTC4の 産 生 能 が 著 明 に 亢 進 し て い た(P< 0.05).
2. Con A刺 激 に よ るsuperoxide産 生 能 は, 健 常 人 と 喘 息 群,非 難 治 群 と難 治 群 と も差 は 認 め られ な か っ た が, prednisolone (PSL) 10mg/
Fig. 15 A production of superoxide from neutrophil-rich stimulated by Con A. The production of superoxide was compared with asthmatics of PSL (<10 mg/day) and PSL (•†10mg/day) asth-matics.
Table
1 Correlation
between leukotrienes
production
and superoxide production
from neutrophil-rich
fraciton in bronchial asthmatics
and healthy subjects.
772 清 水 一 紀 日未 満 群 で はPSL10mg以 上 群 に 比 し有 意 に 高 値 を 示 し た(P<0.01). 3. か か る 喘 息 群 のsuperoxideとLTs産 生 能 の 間 に は, LTC4とLTB4及 び, LTB4とsuperox ideの 間 に 相 関 を 認 め た. 以 上,難 治 性 喘 息 の 病 態 に は,気 道 反 応 局 所 に 多数 出 現 す る 好 中 球 を は じ め とす る 炎 症 細 胞 か ら産 生 さ れ るLTs, superoxideな ど の 化 学 伝 達 物 質 の 役 割 が 重 要 で あ る と思 わ れ た. 稿 を終 え るに あ た り御 指 導 な らび に 御 校 閲 を賜 わ った恩 師 木 村 郁 郎 教 授 に深 謝 す る と と もに,終 始 懇 切 な る御 指 導 と御 助 言 を い た だ い た 高橋 清 講 師 に 感 謝 の 意 を表 す る. 尚 本 論 文 の 要 旨 は 第35回 日本 ア レル ギー学 会 総会 (1984年 京 都)に お い て発 表 した. 文 献 1) 木 村 郁 郎:気 管 支 喘 息 − 中高 年 発 症 型 難 治 性 喘 息 を 中心 に−.老 人科 診 療 (1983) 4, 378-385. 2) 竹 山 博泰,谷 崎 勝 朗,細 川正 男,多 田 慎 也,中 村 之 信,原 田 寛,佐 藤 利 雄,木 村 郁 郎:気 道 細 胞 反 応 か ら み た 気 管 支 喘 息 の 病 態 に 関す る研 究 − 気 管 支 肺 胞 洗 浄 法 に よ る検 討 −.ア レ ル ギー(1980) 29, 875-881. 3) 松 岡 孝:気 管 支 喘 息 患者 好 塩 基球 の 免疫 グ ロブ リン レ セプ ター とIgG抗 体 の 作 用 機 作 に関 す る研 究.第 1編 重 症 難 治 性 喘 息 に お け るIgG抗 体 の役 割 に 関 す る検 討.岡 山 医 誌 (1986) 98, 525-535.
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