群 溶連菌 脂 質 関す 研究

1 9 6 金沢大 学 十 全 医学 会 雑 誌 第9 0巻 第1号 1 9 6‑^{2 1 3 (19 81})

A 群溶 連 菌^の 脂質^に関 す^る研 究

〔^Ⅰ〕溶 連 菌^の脂質^{組 成}

金沢大 学 医学 部 薬理学 教 室 (主 任^: 正 印 達 教 授)

北 島 耕 作

(昭 和^{5 6}年1月2 6日受 付)

鼠ey ^{w o r}ds H e m ol_{y tl C S}tr ep t^{O C O C C}i, li_pid c o m p^{o s}itio n_,fat t y ^{a c}id p^atte r n, pho spholi_pids

, gl_yc oli_pids･

A 群 溶 連 菌^に抗 腫 瘍 作用^のあ る^こと が見^いだ さ れて か ら, 抗 腫 瘍 性 格 連薗^につ い て多くの研 究が行な わ れ

た^{l ) 2 )}. こ のう ち, A 群 溶連 菌^にはス ト レプトリ ジ^ンS

お よ び^{ス トレ}プトリ ジ^ン 0 を産 生す る菌, ス トレプト リ ジ^ンS のみ を産 生す る商お よ び^{ス ト レ}プ ト リ ジン

0 のみ を産 生す る菌^の3 種 類が知ら れて いる が, ス ト レプ ト リ ジ^ン S を産 生す る溶 連 菌^のみ が抗 腰 痛 作 用 を示し. その他^の溶連 菌や緑 色 連 鎖 球 菌^には抗 腫 瘍 作 用が 認 め ら れ な^いと報 告さ れて いる^{1 卜 3)}.

一方, 細 菌^の

リ^ン脂質や糖 脂 質^の組 成ほ菌^の種 類に よ^{っ て}著 し く 異な り, これ ら^の脂 質 組 成と細 菌^の生 物 学 的性 状との

間^に は密 接な関係^のあ る^こと が指 摘さ れて いる^{4 州} .こ の こと か ら. 連 鎖 球 菌^の抗 腫 瘍 作 用と リ^ン脂 質お よ び 糖 脂 質^の組成^の関係^{につ い て}考 査を行う た め, ま ず生 物 学 的性 状^の異な る連 鎖 球 菌4 株^{につ い て ,} 脂 質 組 成

に関 する実験を行な^っ た.

本 論 文^では抗 腫瘍 性でス トレプトリ ジ^ンS(S L S) 産 生 態を有す る溶 連 菌S^u 菌と Bla ckm o r e 菌お よ び^ス トレプトリ ジン 0 (S L O) 産 生 能を有し抗 腫 瘍 性^のな い C 2 0 3 U 歯 並びに ス トレプトリ^ジン産生 能を欠き抗 腫瘍 性^のな^い緑 色 連鎖 球 菌を用^{い て} , リン脂 質 ∴糖 脂 質お よ び中性 脂 質^の組 成な ら び^{に こ}れ ら脂質^の脂 肪 酸 構 成^{に つい て}定 性 定 量 実験を行な^っ た^.

材 料お よ び方法 1 . 連鎖球 菌

教 室 保 存^の A 群 溶 連 菌Su 株 (3 型. S L S お よ び S L O 産 生 株, 以下Su 菌と略 記),B la ck m o r e 株 (11 型,S L S 産 生 株^{, 以}下B la ck m o r e 菌と略記) ,C 2 0 3 U 株 (C 2 0 3 S 菌の変 異 種,S L O 産生株. 以下C 2 0 3 U 菌

と略 記) お よ び緑 色 連 鎖 球 菌9 0 を使 用し た^3I. 2^. 連 鎖 球 菌^の培 養

連 鎖 球 菌^の培 養には W o od ら^の合 成 培 地^{8 1}を使用 し た^. 合 成 培 地^の組 成は B^{a cto tr}y p to n e 20g ,Ba cto ye a st e xtr a ctl Og ,K H2P O.5g , ブド ウ糖1g^, 精 製 水

1 L ^で, 1 0 % N ^aH C O3で p汀を 7 .3に調製し た^のち,1 20

℃で2 0 分 間 滅 菌し た も^のを用^いた^.連 鎖 球 菌^の合成培 地によ る培 養 液2 0 0 m⊥を 1 0 エ^の合 成 培 地に接種し.37

℃で 1 2 時 間 培 養し た^の ち, 低温下 ^で 連 続 遠^jL^､ (1 0,0 0 0^rp^{m ,}100 鵬^/ 分) して集 菌し^, 菌 体を 生 理食 塩 水^で2 回 洗 浄し た.

3^. 連 鎖 球 菌脂質^の抽 出

連 鎖 球 菌^の脂 質は FoI^cb ら^の方 法^{9 )に}よ^って抽 出し た^. す な わ ち^, ほ^ゞ2 0g の連 鎖 球 菌を 2 0 倍量の ク^ロロ ホ ル ム ^･ メタ^{ノー ル} (2^:1,Ⅴ/ V ) ^で室 温^で2 回抽出し た^のち^,抽 出液^に1 / 5 量^の生理食塩 水を加えて混和し^, 4 ℃^に放 置して混液が二層に分 離してか ら^, 水溶 性物 質を含む 上 層 を除 去し, 脂 質を含む下 層を ^{ロ ー} タ リ

ー ･ エ バ ボ レ ^ー ク ^ー を用^{い て}窒 素 気 流 下^に 4 0 ^{℃ で}濃 縮し^て油 状 物 質 ( 総 脂 質) を得た^. こ の総 脂 質(収量^: 2 0 0‑ 2 5 0^mg/ 2 0g) を 1 0 0^Ⅲl⊥の ク^ロ ロ ホル ム ^･ メ タ/

‑ ル に溶 解し, 使用 す る ま^で‑ 2 0 ℃ に保 存し た^.

Studie s o n the L i_pids of Gro up A H e m ol_{y t}ic Str ep t^{o c o c c}i. [Ⅰ] ^{L i}pid C o m p^{o s}itio n of H e m ol_{y t}ic Str ep t^{o c o c c}i. Ko u s aku E itaj^{im a, De}p^{a r}tm e nt of P ha r m a c olog y(^{D ir e cto r :} Pr of. S . S hoin)^{, Scho ol of M edicin e, K a n aza w a U niv e r si t y ･}

A群 溶連 菌^の脂 質に関す る研 究 _{1 9 7}

4^. 連 鎖 球 菌 脂 質^の薄層ク^{ロ マ} トグ ラ^フィ ^ー

1) . クロ マ トプレ ^ー ト の作 製

クロ マ トプ^{レ ー} ト は S t^ahl の方 法^{1 0 )に}よっ て作 製し た. す な わ ち^, 2 5g の シリカゲ^ルH (M e r ck) を 70 mL の精製 水^に浮 遊さ せ た も^のを ガラ ス板 ( 20 ^×20c Ⅲ)

に載せて シリ^カゲル の薄 層 ( 厚さ^: 0^･2 5m m, 0^･5m mお よ び 1^.0 皿mの3 種 類) ^を作り,

一夜 室 温で乾 燥 後, 薄 層を 1 10 ℃^で30 分 間 加 熱し^て活 性 化し,放 冷 乱 実 験

に用^いた. な お, 厚さ 0^.5 ^m お よ び 1^.Om mの薄 層は分 離し た脂 質を回 収す る^{の に}用^いた･

2)^. 展開 溶 媒

展 開溶 媒液^{と して}次^の5 種 類を用^いた. すな わ ち,

溶 媒 A^: ク ^{ロ ロ} ホ ル ム ･ メ タ ^{ノ ー ル ｡} 水 (6 5^:2 5^:4,Ⅴ/ V)^{1 1 )}; 溶 媒B^: ジ イソプチ ルケ トン ^･酢 酸^｡ 水(8 0:5 0:1 0,Ⅴ/ V)^{1 2 }};溶 媒C: ク^{ロ ロ} ホ ルム ^･ ア

セ ト ン ^･ メ タ ノ ^ー ル ^･ 酢 酸^｡ 水

(65^:35^:1 1^:4^:1 ふ Ⅴ/ V)^{1 3 }};溶 媒D: 塩 化^{エチ レン ｡ メ} タノ ^ー ル( 98^:2,Ⅴ/ V)^{1 4 }};溶 媒E: ^ヘ キサ ン ^｡ エチ ルエ

ー テル ^･酢 酸 ( 7 0:3 0:2,Ⅴ/ V)^{1 5 )} を用 意し た.

3 )^. 発 色 試 薬

展開 分離さ れ た分 画^の検 出^のた め, 次^の7 種 類^の発 色試薬を用^いた^.

(1) ^{ヨ ー ド}試 薬 ( 2 % ^エタノ ^ー ル溶 液, 脂 質^の 検

出)^{1 6 )},(2) リ^ンモリ ブ デ^ン酸試 薬 (1 0 % ^エタノ ^ー ル

溶液, 脂 質^の検 出)^{1 6),} ( 3 ) D it tm e r ‑ ^{Le ste r} 試 薬 (A 液: 4 0^.1 1g の三酸 化^モリ ブデンを 25 N 硫 酸1 エに

加 熱 溶 解し た もの. B 液: 粉 末^モリ ブ デ^ン1^.7 8g を A 液500 mエに加熱 溶 解し た も^の.A 液1 容,B 液1 容^に水

2容を加え る^. リ^ン脂 質^の検 出)^{1 7 )},( 4) ^アンスロ ン試

薬(^{アンスロ ン}0.5g とチオ尿 素1 0g を66 % 硫 酸1 ￡^に 溶か し たも^の. 糖 脂 質お よ び^{ス テ ロ ー ル}頬^の検 出)^{1 8)},

(5)^{ニ ンヒ ド}リ^ン試 薬 (^{n ‑} ブ タノ ^ー ル で飽 和し た 水^に0.2 % に溶か し た も^{の. ア ミ ノ}基の検 出)^{1 6 ),} ( 6 ) Dr age ndo rff試 薬 (A 液^:塩 基 性 硝 酸^{ビ スマ ス}

1.7g を 2 0 % 酢 酸1 0 0 ml に溶 解し た も^の. B 液^{: ヨ ウ} 化カ リウム の4 0 % 水 溶 液^. A 液2 0 mエ^, B 液5^山お よ

び水7 0m⊥ を混 和^して使用. コリ^ンの検 出)^{1 6 )}(7 ) ^ア

ンチ モ ン試 薬(三 塩化^アンチ モ ン2 5g を^{クロ ロ ホル ム}

75g に溶 解し た も^の . ス テ^{ロ ー} ル類^の検 出)^{t 6 ).}

ヨ ^ー ド試 薬お よ び D it tm e r‑ ^{Le ste r 試 薬をク ロ マ}

ト プ レ ^ー ト に噴霧し た場 合は そのま ^ゝで発色さ せ, そ の他の試薬を噴 霧し た場 合は^{プ レ ー} トを 11 0 ℃で加 熱 して発 色さ せ た.

4 )^. 連 鎖 球 刺 旨質^の分離お よ び検 出

二次元蒋 層クロ マ トグラフ ィ ^ー で連 鎖 球 菌 脂 質^の成 分を調^べた.

欄

. 厚さ 0^.2 5m mの ク^ロ マ トプ^{レ ー} ト の ^一

隅 ( 両 端か ら 2^.5c m) ^に1 5 ^‑ 20 mg の総 脂質を^マイ ク

ロ ピペ _ッ ト で点 状^{に ス}ポッ トし た^のち, 溶媒A で 1 5

c 皿展 開し た^. 展開 後. クロ マ トプ^{レ ー ト}を 9 0 度 回転さ せてか ら, 溶 媒B で1 5^{c Ⅲ}展 開し た^. 溶媒を除い て か ら, ヨ ^ー ド試 薬を プ レ ^ー ト に噴 霧し てス ポ ット の位 置 を確 認し たのち. その他^の試 其を噴 霧して脂 質^の種類 を調^べ た^{Ⅰ9 )}.

展 開 溶 媒A お よ び B を用^いる 二次 元 薄 層クロ マ ト グ^{ラ フ} ィ ^ー によ^っ て連鎖 球菌^のリ^ン脂 質と糖 脂 質は個

々 の成 分^に分 離さ れ た が, 中性 脂 質^の分離が不 充 分^で あ^ったの で,展 開 溶 媒D お よ び E を用^いる 二次 元 薄 層

ク^ロマ ト グラ フ ィ ^ー で連 鎖球 菌^の中性 脂 質^の種 類を調

べた^{2 0 ).} な お沖性 脂 質^の成分を同定 する た めに コ レ ス

テ ロ ^p ル (Me r ck), コ レス テ ^{ロ ー} ル^｡ パル ミ テ ^ー ト

(S igm a), パ ル ミ チン酸, モ ノパ ル ミ チン. ジ^バ ル ミ チ ン, トリ^{パ ル ミ チ ン} (P L ^‑ Bio che mic als) な ど を 標準 物 質と して用^いた.

5) ^. 連 鎖 球 菌脂 質^の分取 薄 層ク^{ロ マ} トグ ラフィ ^ー

連鎖 球 菌^のリン脂 質, 糖 脂 質^の加 水 分 解産 物^{をペ ー}

パ ^ー ･ クロ マ トグラフ ィ ^ー で調べた りt 各脂 質^の脂 肪

酸 構 成を ガ^スク^{ロ マ ト}グ ラ^フィ ^ー で調^べる た めに. 総 脂 質^の各成 分を ^一 次 元薄 層ク^{ロ マ} ト グラ フ _ィ ^ー で分 離 ^･精製し た^{1 0).}

厚さ0 ^.5^{m 皿}ま た は1 m mの薄 層 ( 20 ^×2 0c Ⅲ) ^{の 一} 端 か ら 2^.5c mの所^に総 脂 質1 0 0 喝ま た は 2 00 喝を線 状に スポッ トし, 展 開溶 媒A を用い て1 7 c m展 開し,ク^{ロ マ} トプレ^ー トを充 分^に乾燥し た^のち, ヨ ^ー ド試 薬を噴霧 し^{て ス ポ}ッ ト の位 置を確め た^. つ い で, 脂 質を含むシ リ^カゲ^ルを プレ ^ー トか ら か き と りt ク^{ロ ロ}ホ ル ム ^■ メ･

クノ ^ー ル( 2:1 ,Ⅴ/ V) ^で脂 質を抽 出し た^. リ^ン脂 質^に

つ い て は同 様な操 作を 2 ^‑ 3 回 線り返し た. ま た, 展 開溶 蝶A を用^いる ^一 次元薄 層ク^ロ マト グラ フ ィ ^ー で

分 離し た糖 脂 質に つい て, さ らに展 開溶 媒C を用^いる

一次 元 薄 層^クロ マ ト グ^{ラ フ} ィ ^ー を 2 ^‑ 3 固 練り返し た^.

中性 脂 質^は展 開 溶 媒E を 用^いる ^一 次元薄 層ク ^{ロ マ} トグラフ ィ ^ー で分 離し たのち^,展 開 溶媒D ま た は E を 用^いる ^一次元薄 層ク^{ロ マ ト}グラ フィ ^ー によ^っ て各 脂 質 画 分を精 製し た^. な お^{, 一} 次元薄 層^クロ マ トグラ フィ

ー で分 離し た リ^ン脂 質ま た は糖 脂 質は.展 開 溶 媒A お よ び B を 用^いる二次元薄 層^{クロマ ト}グラ フィ ^ー によ^っ て, ま た, 中 性 脂 質^の成 分は展 開 溶媒D お よ び E を用

いる 二次 元 薄 層^{クロ マ ト}グラ フィ ^ー によ^っ て,そ れ ぞ れの脂 質 画分が単 ^一であ る か否か を調べた^.

5. ベ^ー パ^{ー ･} ク^ロマ ト グ ラ^フィ ^ー に よ る 脂質 水 解 雇 物^の同 定