博 士 （ 工 学 ） チ ャ チ ャ イ カ ノ ン ヌ ッ チ
学位論文題名
声‑Mannanase from Bacillus sztbtilis and clonlngoftherelatedgeneS
（枯草菌のロ―マンナナーゼ及び関連する遺伝子のクローニング）
学位論文内容の要旨
近年 農産廃棄物などの未利用/ヾイオマス資源を有効に利用する方策が考慮されて い る。 特に 熱帯 に位 置す る諸 国で はその多くが廃棄されているのが現状で、このよ う な一 次産 品の 廃棄 物を 家畜 の飼 料などへ転換し、利用するための方法が検討され て いる 。農 産廃 棄物 には セル ロー スと共にキシランやマンナンを含むへミセルロー ス が多 く含 有さ れて おり 、こ れら をヘミセルラーゼによって酵素的に低分子のオリ ゴ 糖な どへ 分解 する こと で、 飼料 の質的向上および付加価値の向上が期待される。
他方 、製 紙工 業に おい て、 ヘミ セルラーゼは環境問題からバルプの漂自過程に一 部 利用 され始めている。用いられる酵素にはセルラーゼを含まないp．マンナナーゼ と キシ ラナ ーゼ など のへ ミセ ルラ ーゼの みが 利用 され る。
上記 のような観点から本論文では、p．マンナナーゼに注目し、マンナンを分解す る 微生 物を検索し、p．マンナナーゼとキシラナーゼを生産するが、セルラーゼを生 産 しな い細 菌を 分離 した 。こ の細 菌から3‑マンナナーゼを精製し、その性質を決定 し た。 一方、p．マンナナーゼおよびキシラナーゼをコードする遺伝子のクローニン グ に成 功し た。 また 、親 株で は発 現していないセルラーゼ遺伝子も同時にクローニ ン グし 、そ れら の構 造を 明ら かに した。さらに応用的見地から本菌株の酵素を用い て パル プの 漂白 が可 能で ある こと を明ら かに した 。
本論 文は これ らの 経緯 をま とめ たもの で、 全8章よ り構 成さ れている。各章の概 要は以下の通りである。
第1章は序 論で あり 、p・マ ンナ ナーゼ研究の現状と問題点および本研究の目的に ついて述べた。
第2章では 、熱 安定 性の 比較 的高 いp．マンナナーゼ高生産菌をタイの土壌より分 離し、分類学的検討からBacillus subtilis 5H株と同定した。本菌株は培地中にセル ラーゼを生産せず、p ‑マンナナーゼとキシラナーゼを生産していることを見出した。
さ らに 培養条件を検討し、p・マンナナーゼおよびキシラナーゼ生産のための至適条
件を決定した。
第3章で は、 本菌株 から6． マン ナナ ーゼ を精製し、その性質を決定したことにつ い て述 べた 。本 菌の 培養 液か ら3段 階の カラ ムク ロマ トグ ラフ イー で効 率的に精製 で きた 。p．マ ンナナーゼの分子量は38，000であり、60℃，pH6.5の条件で最大の活 性 を示 した 。ま たpH 6.5、45℃以 下で 安定 であった。本酵素に対する金属イオンの 影 響 を 調 べ た と こ ろ 、 本酵 素はHg2十 、Ag゛、Fe3゛で活 性が 完全 に阻 害さ れた 。 第4章で は、 本菌株 のp・マ ンナ ナー ゼ遺 伝子をクローニングしたことについて述 べ た。 ショ ット ガン 法を 用い て大 腸菌 で作 製し、遺伝子ライブラリーから得られた 陽性クローンは、p・マンナナーゼ活性を示した。塩基配列を決定したところ、p．マ ン ナナ ーゼ 遺伝 子は362アミノ酸をコードする、1，086bpのオープンリーデイングフ レーム(ORF)に存在した。本遺伝子から推定される分子量38，006のアミノ酸配列は、
他のBacill us属から得られているp，マンナナーゼのアミノ酸配列を高い相同性を示し た。
第5章で は、 前章で作製した遺伝子ライブラリーから親株では発現しないセルラー ゼ 遺伝 子を クロ ーニ ング し、 その 構造 を明 らかにしたことについて述べた。陽性ク ロ ーン が保 持す るプ ラス ミド の挿 入断 片の 塩基配列を決定した結果、セルラーゼ遺 伝子は分子量55，420の501アミノ酸をコードする1，503bpのORFにコ｀ードされてしゝ た 。大 腸菌 によ って 発現 させ た酵 素は ガラ クトマンナンには作用せず、コンニヤク グ ル コ マ ン ナ ン お よ びカ ル ボ キ シ メ チ ル セ ル ロ ー ス に 対 し 、 活 性 を 示 す 分 子 量 55，000の酵素蛋白質に翻訳され、ついで分子量35，000の酵素にグルコマンナンに強 い活性を示す酵素に修飾されることを明らかにした。
第6章で は、Bacillus subtilis 5Hが生産するキシラナーゼをコードする遺伝子を PCR法 を 用 い て ク ロ ー ニン グ し た 。 染 色 体DNAよ り 増幅 したDNA断 片を 含む 形質 転 換 株は キシ ラナ ーゼ 活性 を示 した 。塩 基配 列を決定した結果、キシラナーゼ遺伝子 は213アミノ酸をコードする639bpのORFにコードされていた。
第7章では、Bacillus subtilis 5H株の培養液および精製したp．マンナナーゼおよび キシラナーゼを用いたバルプの漂白について検討した。先にキシラナーゼを精製し、
そ の性 質を 明ら かにした。パルプの脱色試験において、p・マンナナーゼおよびキシ ラ ナー ゼ処 理し たパ ルプ はそ れぞ れ白 色度 が30〜38％上昇した。また親株の培養液 を 用い ても 漂白 活性 を示 した こと から 、本 菌株の生産する酵素がパルプの漂白に有 効であることを示した。
第8章では、総括では、以上の研究結果を要約するとともに、Bacillus subtilis 5H 株の生産する酵素の将来の利用の可能性について論述した。
学位論文審査の要旨 主 査 教授 木下晋一 副 査 教授 高井光男 副 査 教授 棟方正信 副査 助教授 大井俊彦
学位論文題名
p― h/Iannanase from上 を CZZZ勿 SS銘 ろ fZZぬ andClonlngoftherelatedgeneS
（枯草菌のグーマンナナーゼ及び関連する遺伝子のクローニング）
近年農産廃棄物などの未利用バイオマス資源を有効に利用する方策が考慮され ている。このような一次産品の廃棄物を家畜の飼料などへ転換し、利用するための 方法が検討されている。農産廃棄物にはセルロースと共にキシランやマンナンを含 むヘミセルロースが多く含有されており、これらを酵素的に低分子のオリゴ糖など へ分解することで、飼料の質的向上および得られるオリゴ糖の生理作用などが期待 されている。
他方、製紙工業において、ヘミセルラーゼは環境問題からバルプの漂自過程に一 部利用され始めている。用いられる酵素にはセルラーゼを含まないp‑マンナナーゼ と キ シ ラ ナ ー ゼ な ど の ヘ ミ セ ル ラ ー ゼ の み が 利 用 さ れ て い る 。 上記のような観点から本論文は、p‑マンナナーゼに注目し、マンナンを分解する 微生物を検索し、p‑マンナナーゼとキシラナーゼを生産するが、セルラーゼを生産 しない新たな性質を持った細菌を分離することに成功した。この細菌からロマンナ ナーゼを精製しその性質を決定した。一方、p‑マンナナーゼおよびキシラナーゼを コードする遺伝子のクローニングに成功した。また、親株では発現していないセル ラーゼ遺伝子も同時にクローニングし、それらの構造を明らかにした。さらに実用 的見地から本菌株の酵素を用いてバルプの漂白が可能であることを明らかにした。
本論分は以下の8章から構成されている。
第1章は序論であり、p‑マンナナーゼ研究の現状と問題点および本研究の目的を 述べた。
第2章では、熱安定性の比較的高いp‑マンナナーゼ高生産菌を分離し、分類学的 検討からBacillus subtilis 5H株と同定した。本菌株は培地中にセルラーゼを生産せ
ず 、p‑マ ン ナ ナ ー ゼと キシ ラナ ーゼ を生 産して いる こと を見 出し た。 さら にp‑マ ン ナ ナ ー ゼ お よ び キ シ ラ ナ ー ゼ 生 産 の た め の 至 適 条 件 を 決 定 し た 。 第3章 で は 、 本 菌 株か らpマン ナナ ーゼ を精製 し、 その 酵素 学的 な性 質を 決定 し たことについて述べた。
第4章 では 、本 菌株 のp‑マン ナナー ゼ遺 伝子 をク ロー ニン グし 、そ の構造を決定 し たこと につ いて 述べ た。 塩基 配列 から 、p‑マン ナナ ーゼ 遺伝子 は362アミノ酸を コ ードす る、1，086bpのオ ープ ンリ ーデ イングフレーム上に存在していることを明 らかにした。
第5章 では 、前 章で 作製 した 遺伝子 ライ ブラ リー から 親株 では 発現 していないセ ル ラーゼ 遺伝 子を クロ ーニ ング し、 その 構造を明らかにした。セルラーゼ遺伝子は 分 子量55，420の501ア ミノ 酸を コー ドす る1，503bpのORFに コー ドさ れていた。大 腸 菌によ って 発現させた酵素はガラクトマンナンにiま作用せず、コンニヤクグルコ マ ンナン およ びカルボキシメチルセルロースに対し、強い活性を示す分子量55，000 の 酵素蛋 白質 に翻訳され、ついで分子量35，000の酵素にグルコマンナンに強い活性 を示す酵素に修飾されることを明らかにした。
第6章 では 、B． subtilis 5Hが生産するキシラナーゼをコードする遺伝子をPCR法 を 用いて クロ ーニ ング した こと につ いて 述べた。塩基配列を決定した結果、キシラ ナ ー ゼ 遺 伝 子 は213ア ミ ノ 酸 を コ ー ド す る639bpのORF上 にコ ード され てい るこ と を明らかにした。
第7章では、．B． subtilis 5H株の培養液、および精製したp‑マンナナーゼおよびキ シ ラナー ゼを 用い たバ ルプ の漂 白に つい て検討した結果について述べた。先に親株 からキシラナーゼを精製しその性質を明らかにした。パルプの脱色試験の結果から、
本 菌株の 生産 するp‑マ ンナ ナー ゼお よぴ キシラナーゼはバルプの漂白に有効である ことを示した。
第8章は総括であり、本研究結果を要約するとともに、B． subtilis 5H株の生産す る酵素の将来の利用の可能性について論述した。
これを要するに、著者は分離同定したB． subtilisの生産するp‑マンナナーゼおよ び キシ ラナ ーゼ の性 質と それら の遺 伝子構造を明らかにし、これら酵素の応用的な 見 地か らバ ルプ の漂 白に 非常に 有効 であることを見出したものであり、酵素化学お よ び 生 物 工 学 の 分 野 の 研 究 の 進 展 に 貢 献 す る と こ ろ 大 な る も の が あ る 。 よっ て著 者は 、北 海道 大学博 士（ 工学）の学位を授与される資格あるものと認め る。
