博 士 （ 歯 学 ） 中 村 順 一 朗
学 位論文題名
Signaling pathwayslnduCedbylipoproteinSderiVedfrom A りc 砂尻硲ケ冗ロs 口 ff 〃口アz 勿所 andasyntheticlipopeptide （FSL ‐ 1 ） innormalhumangingiValfibroblaStS
（ 正常 ヒ ト歯 肉 線 維芽 細 胞に お ける Mycoplasma salivar 勿 所由来 リポタンパク質ならぴに合成リポベプチド（FSL ―1 ）誘導のシグナル経路）
学位論文内容の要旨
【 目的】 Mycoplasma salivar ium由 来リポタン バク質(LPsal)はヒト正常歯肉線維芽細 胞(HGF)にinterleukin‑6 (IL‑6)、IL・8の 産生ならび に細胞間 接着分子intercellular adhesion molecule‑l (ICAM‑1)の発現を誘導する。Mycoplasma salivar iumの細胞膜に存 在 す る44 kDaの りポ タ ン パク 質 の活 性 部 位はN末 端 リポ ペプ チド部分 であり、 その構 造 はS‑(2，3―bisacyloxypropyl) CGDPKHPKSFI'EWVD‑である。本研究では、その構造を もとに合成したりポベプチドS―（2，3−bisacyloxypropyl) CGDPKHPKSF (FSL‑1)ならびに LPsalこよるMitogen‑activated protein kinase (MAPキナーゼ）、転写因子activator proteinー ´
1 (AP―1） な ら び にnuclear factor‑KB (NF‑KB)の 活 性 化 に つ い て 検 討 し た 。
【 方 法 】HGFは10%ウ シ 胎 児 血 清 を 含 む ダ ル ベ ッ コ 改 変 イ ー グ ル 培 地(DME)で コ ン フルエントに達するまで培養した。
Mycoplasma salivarium ATCC 23064は10%ウマ血清、1ワ。．酵母抽出液ならびに1%L‐ arginineを含むPPLO培地で培養した。
LPsalはTriton‑X 114による二相分離法によって、Mycoplasma salivar ium細胞から抽 出した。
コ ンフルエ ントに達し たHGFにLPsal（最 終濃度40 yg/ml)あ るいはFSL・1（最終濃度 50 ng/ml)を 加 え 、O、15、30、60分 間 イン キ ュ ベー ト した後 、SDSサンプ ルバッフ ァ ーで処理した。次に、リン酸化ならびに非リン酸化p38、stressーactivated protein kinase/c‑
Jun N‑terminal kinase (SAPK/JNK)ならびにextracellular‑signal regulated kinase l/2 (ERK 1/2)に 対 する 抗 体 を用 い 、Westem blotting法を 行うこと により、 経時的にMAPキナー ゼ の活性化 を調べた。 なお、検 出は化学 発光法を 利用したECLキットを 用いた。ま た、
LPsal刺 激 に よ るHGFのIL‑6産 生 誘導 活 性 に及 ぽ すSB203580 (p38の阻 害 剤） な ら び
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Iこ 、 PD98059 (ERKl/2を 活 性 化 す るMEK‑1の 阻 害 剤 ） の 影 響 をenzyme−linked immunosorbent assay (ELISA)法で調べた。
転 写 因 子AP‑1な ら び にNF‑KBの 活 性 化 は 、HGFをLPsalも し く はFSL‑1で0、1、2、 4時 間刺 激後 、mini‑extract法 で核 夕ン パクを抽出し、AP−1もしくはNF‑KBの認識配列 を持っオリゴヌクレオチドを用いてelectrophoretic mobility gel shift assay (EMSA)で測定 し た。 なお 、検出 され たパ ンド の特 異性 は過 剰量 の非 標識 オリ ゴヌ クレオチドを加え ることによルシグナルが消失することで評価した。
IKBのり ン 酸 化 はHGFにLPsalを 加 え 、O、30、60分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た後 、SDS サ ンプ ルパ ッファ ーで 処理 した 。次 に、 リン酸化ならびに非リン酸化IKB‑aの抗体を用 いてWestem blotting法で調べた。
【 結 果 】HGFのLPsalも し く はFSL‑1刺 激 に よ りSAPK/JNKな ら び にp38の 活 性 化 が 誘導 され 、刺激 後30分で 最大 に達 し、60分 でも ほぽ その レベ ルを 維持していた。な お 、活 性化 されて いな いSAP1く ノJNKな らびにp38は無 刺激 でも パン ドが検出され、か つ 経時 的な 変化が 見ら れな かっ た。ERKl/2，は無刺激でも活性化されており、LPsalも し く はFSし1刺 激 に よ る 活 性 化 の 程 度 は 増 強 さ れ る こ と が な か っ た 。 ´ LPsalも し く はFSL‑1のIL‑6産 生 誘導 活 性 はSB203580で 阻 害 さ れ た が 、PD98059で はほとんど影響を受けなかった。
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HGFのLPsalも し く はFSL‑1刺 激 に よ りAP‑1な ら び にNF‑KBの 活 性 化 が 誘 導 さ れ た。
NF‑KBの 阻 害 剤 であ るIKB−Qは 、刺 激後30分 でり ン酸 化さ れ、60分 でも ほぽ その レ ベ ルを 維持 してい るこ とが わか った 。一 方、非リン酸化IKB‑aは無刺激でもシグナルが 検 出 さ れ 、 か つ 経 時 的 に 伴 い 減 少 した 。 こ の 結 果 は 、EMSAで 得 ら れ たNF‑KBが活 性 化されるという結果を支持するものである。
以上 の結 果から、Mycoplasma salivarium由来リポタンバク質LPsalおよびその合成リ ポ ペ プ チ ドFSL‑1刺 激 に よ り 歯 肉 線 維 芽 細 胞HGFに 与 え ら れ た シ グ ナ ル はMAPキ ナ ー ゼp38な ら び にSAPK/JNKを 経 由 し 、 転 写 因 子AP・1な ら び にNF‑KBの 活 性 化 を 通 してIL‑6の産生に導かれることが示唆された。
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S i g n a l i n g p a t h w a y s i n d u c e d b y l i p o p r o t e i n s d e r i v e d f r o m 一 ● ●
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更 に転写因子AP−1ならびにNF・KBの活性化においては、HGFをLPsalも しくはFSL―1でO、1、2、4時間刺激後、mini−extract法で核夕ンパクを抽出 し、AP−1もしくはNF‑KBを特異的に認識するプロープを用いてゲルシフト アッセイを行った。尚、検出されたノヾンドの特異性は過剰量の非標識プ口ー ブを用いた競合実験で確認した。
HGFのLPsalも しくはFSL・1刺 激によりp38ならびにSAPK/JNKの 活性化 が誘導され、刺激後30分で最大に達し、60分でもほぽそのレベルを維持し ていた。ERKl/2は無刺激でも活性化されており、LPsalもしくはFSL−1刺激 による活性化の程度は増強されることがなかった。
LPsalもしくはFSL―1のIL−6産生誘導活性はSB203580で阻害されたが、
PD98059では何の影響も受けなかった。
HGFのLPsalも しくはFSL‑1刺激によりAP−1ならびにNF一KBの活性化が 誘 導 さ れ 、 刺 激 後1時 間 で ピ ー ク が 観 ら れ 、 以 後 減 少 し た 。 以上の結果から、Ms由来リポタンパク質LPsalおよびその合成リポペプチ ドFSL−1刺激によ り歯肉線維 芽細胞HGFに与えられたシグナルはMAPキナ ー ゼp38ならびにSAPKノJNKを経由し、転写因子AP−1ならびにNF−KBの活 性 化 を 通 し て IL‑6の 産 生 に 導 か れ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 2.審査委員からの質問 ´
（1）炎症性サイトカインならびに細胞間接着因子ICAM−1の特徴につ いて
（2）Triton−X114に よ る二 相 分離 法 のメ カ ニズ ム に つい て ´ （3）LPsalならびにFSL‑1刺激における転写因子の活性化のピークの 違いについて
（4）NF‑KB活性化のメカニズムについて
（5）微生物由来リポタンパク質リポベプチドを認識するレセプターの 特徴について
（ 6） 本 研 究 の 臨 床 的 応 用 法 な ら び に そ の 展 望 に つ い て 以上のような質問について、論文提出者はそれぞれに的確に解答し、考察・
展望について明確に言及した。
論文提出者は、正常ヒト歯肉線維芽細胞における口腔マイコプラズマ由来 リポタンパク質ならびにその合成リポベプチドのシグナル伝達系について検 討した。本研究のような基礎的見解を今後の臨床へ応用する展望についても 深く考察しており、将来性の点においても評価できる。よって、学位申請者 は博士（歯学）の学位授与にふさわしいと認めた。
