Protein O-GlcNAcylation is essential for foot
process maturation and survival in podocytes.
その他の言語のタイ
トル
タンパク質のO-GlcNAc修飾は糸球体上皮細胞(ポド
サイト)足突起の発達及び生存に重要な役割を担う
タンパクシツ ノ O-GlcNAc シュウショク ハ シキ
ュウタイ ジョウヒ サイボウ ポドサイト ソク ト
ッキ ノ ハッタツ オヨビ セイゾン ニ ジュウヨウ
ナ ヤクワリ ヲ ニナウ
著者
小野 真也
発行年
2017-03-10
URL
http://hdl.handle.net/10422/00012259
学
位
の
種
類 博士（医学）
学
位
記
番
号 博士甲第７６９号
学 位 授 与 の 要 件 学位規則第４条第１項
学 位 授 与 年 月 日 平成２９年 ３月１０日
学 位 論 文 題 目 Protein O-GlcNAcylation is essential for foot process
maturation and survival in podocytes
（タンパク質の O-GlcNAc 修飾は糸球体上皮細胞
（ポドサイト）
足突起の発達及び生存に重要な役割を担う）
審
査
委
員 主査 教授 堀江 稔
副査 教授 古荘 義雄
副査 教授 河内 明宏
別 紙 様 式
3
(課 程 博 士 • 論 文 博 士 共 用 )論 文 内 容 要 旨
X
整 理 番 号7 7 6
民 名 小 野 真 也学 位 論 文 題 目
Protein O-GlcNAcylation is essential for foot process maturation and
survival in podocytes
(タ ン パ ク 質 のO-GlcNAc修 飾 は 糸 球 体 上 皮 細 胞 （ポドサイト） 足突起の 発達及:び生存に重要な役:割を担う） 【目的】 糸 球 体 上 皮 細 胞 （以 下 ポ ド サ イ ト ） は、 そ の 特 徴 的 な 足突起構造によって高分子物質の尿 中 喪 失 を 阻 止 し 糸 球 体 ろ 過 バ リ ア の 維 持 に 重 要 な 役 割 を 担 っ て お り 、 その機能障害は尿タン パ ク 出 現 の 原 因 と な る 。 また、 タンパ ク質の翻訳後修飾は細胞機能制御に不可欠な機構であ り、 ポ ド サ イ ト に お い て も 、 リン酸化 などの翻訳後修飾の変化が高度尿タンパクの出現や足 突起構造の異常 に 関 わ る こ と が 知 ら れ て い る 。細 胞 内 及 び 核 内 の タ ン パ ク 質 にN-アセチルグ ル コ サ ミ ン ’(G lc N A c)を 付 加 す るO-GlcNAc修 飾 は 翻 訳 後 修 飾 の 一 つ で あ る が 、ポドサイト に お ける役割は知られていない。 そ こ で 本 研 究 で は 、ポ ド サ イ ト に お け るO-GlcNAc修飾の 役 割 の 解 明 が 、新 た な ポ ド サ イ ト 機 能 制 御 機 構 の 解 明 に つ な が る と の 仮 説 を 立 て 、GlcNAc修 飾 酵 素 で あ るO-GlcNAc transferase ( O G T )タ ン パ ク を コ ー ド す るO gt遺 伝 子 を 、先天的及び 複 天 的 に ポ ド サ イ ト 特 異 的 に 欠 損 さ せ た 二 つ の マ ウ ス モ デ ル 作 製 し 、それらの腎表現茶解析 を行った。 【方 法 】 Cre-loxPシ ス テ ム を 用 い て ポ ド サ イ ト 特 異 的O gt遺伝子欠損マウスを作 製 し 以 下 を 検 討 し た 。 ① 兜 天 的 ポ ド サ イ ト 特 異 的O gt遺 伝 子 欠 損 マ ウ ス（Pod-Ogt叫 に お け る 腎 障 害 の 検 討 ：対 照 マ ウ ス（O g tWとPod-Ogt’ マ ウ ス を3 2週 間 飼 育 し 、経時的に尿中アルブミン排泄の 定 量 を 行った。腎 組 織 学 的 評 価 と し て 、光 学 顕 微 鏡 に よ る 硬 化 糸 球 体 •炎 症 細 胞 浸 潤 の 評 価 、 電 子 顕 微 鏡 に よ る 足 突 起 構 造 の 観 察 を 行 っ た 。蛍光免疫染色を用いたポドサイ、 障害の評 価 と し て 、ポ ド サ イ トスリツト膜タンパクであるポドシンの発現量屁び染色パターンの確 認 、ポ ド サ イ ト 特 異 的 核 タ ン パ ク で あ るW T 1陽性細胞数の計測を行った。 ② タ モ キ シ フ エ ン（T M )誘 導 性 ポ ド サ イ ト 特 異 的O gt遺 伝 子 欠 損 マ ウ ス（TM-Pod-Og，) に お け る 腎 障 害 の 検 討 :後 天 的 にO g t遺 伝 子 欠 損 を 誘 導 す る た め に 、8週齢の〇势河 とTM- Pod-Ogty/-マ ウ ス に 対 し て 、T Mの 腹 腔 内 投 与（150mg/kg/day)を5 日間行った。 一部のマ ウ ス はT M投 与 後2週 時 点 で 腎 臓 を 摘 出 し 、O-GlcNAc特 異 抗 体（R L 2 )とW T 1の二重免 疫 染 色 を 用 い て 遺 伝 子 欠 損 効 率 を 評 価 し た 。T M投 与 後3 2週 間 飼 育 し 、①と同様の腎表 現 系を解 析した。 ③ Pod-Ogが-マウスにおけるBis-T-23の 足 突 起 障 害 抑 制 の 検 討 ：ダイナミンのアクチン依存 性 オ リ ゴ マ ー 形 成 と ア ク チ ン 重 合 を 促 進 さ せ 、足 突 起 進 展 に 働 く 小 分 子B is-T-23をPod- Ogt，マ ウ ス に 投 与 し 、尿 中 ア ル ブ ミ ン 排 泄 量 の 増 加 抑 制 、及び足突起構造異常の抑制が得られるかを検討した。対 照 群（Ogty/f，Bis-T-23非投 与 ） 、非 治 療 群（Pod-OgtyA，Bis-T-23非 投 与 ） 、治 療 群 （?<^〇单ゾ，：^ 8-丁-2 3投 与 ） の3群 に お い て 、生 後3週 齢 か ら6週 齢 ま で 、 (備考） 1 . 論 文 内 容 要 旨 は 、研 究 の 目 的 • 方 法 • 結 果 • 考 察 • 結 論 の 順 に 記 載 し 、2千字
程 度 で タ イ プ 等 を 用 い て 印 字 す る こ と 。
非 治 療 群 に はBis-T-23の 溶 解 に 用 い た ジ メ チ ル ス ル ホ キ シ ド（D M S O )を、治 療 群 に はBis- T-23 (20mgZkg)を腹腔内に投与し、16週齢で尿中アルブミン排泄の定量汲びポドサイト障害 を評価した。 【結 果 】 . ① Pod-OgtVマ ウ ス で は 生 後8 週 齢 か ら 尿 中 ア ル ブ ミ ン 排 泄 量 が 増 加 し（107±8,4ng/mg vs 〇 が "マ ウ ス37±10|ig/m g)、3 2週 齢 で 著 明 な 尿 中 ア ル ブ ミ ン 排 泄 量 の 増 加(642±74明/mg vsOgty/fマ ウ ス1 2 ± 3 .7 ^ g /m g )を認めた。Pod-Ogty/-マウスの腎組織では硬化糸球る:•炎 症 細 胞 浸 潤 、 ポ ド シ ン の 発 現 量 低 下 及 び 顆 粒 状 染 色 パ タ ー ン 、W T 1陽性細胞数の減少 (ポドサイトロス） 、 ポ ド サイトニ次突起の消失、ポドサイト足突起の平坦化が確認さ れ 、著 し い 浥 突起構造の破綻が確認された。 ② T M投 与 後2週 時 点 で の 腎 組 織 に お け るR L2及 びW T1共 陽 性 細 胞 数 測 定 か ら 、TM-Pod- Ogt^'マ ウ ス の 遺 伝 子 欠 損 効 率 は92,8士0.6%であった。TM-Pod-Ogl/-マ ウ ス はT M投与後 3 2週 ま で 尿 中 ア ル ブ ミ ン排泄量の増加を認めなかった。 腎 組 織 で はPod-Ogt’ マウスと 比 べ 、軽 微 な 足 突 起 構 造 の 変 化 を 認 め た が 、先 天的モデルのような顕著なポドサイト障 害は認めな か っ た 。 ' ③ B is-T -2 3非 治 療 群 の Pod-Og^Aマ ウ ス は 著 明 な 尿 中 ア ル ブ ミ ン 排 泄 量 の 増 加 (256±56（xg/mg vs Ogty/fマ ウ ス15±3.5（x g /m g )及.びポドシン凳現量の低下、廷突起構造 の 破 綻 を 認 め た が 、Bis-T-23治 療 に よ りPod-Ogt^-マウスの尿中アルブミン排泄量は有意 に 減 少 し（76±21jiigZmgvsOgty/fマ ウ ス1 5 ± 3 .5 p g /m g )、ポドシン楽現量の低下庇び足究 起 構 造 異 常 も 認 め な か っ た 。 [考癡] 先 天 的 ポ ド サ イ ト 特 異 的o g t遺 伝 子 欠 損 マ ウ ス で は 、著 明 な尿中アルブミン排泄量の増力n、 足 突 起 構 造 の 破 綻 、 ポドサイ ト 数 減 少 が 認 め ら れ た が 、後 天 的O g t遺 伝 子 欠 損 マ ウ ス で は 、 尿 中 ア ル ブ ミ ン 排 泄 量 の 増 加 が 認 め ら れ ず 、足 突 起 構 造 異 常 が 軽 微 で あ っ た 。 これらの結果 より、翻 訳 後 修 飾 の 一 つO-GlcNAc修 飾 が 、 ポ ド サ イ ト の 機能制御に不可欠なものであり、 特 に 出 生 後 の ポ ド サ イ ト 足 突 起 の 篼 達 過 程 に 重 要 で あ る 可 能 性 が 示 さ れ た 。 また、 出生から 成 体 に 至 る ま で の ポ ド サ イ ト 足 突 起 の 焭 達 過 程 に お い て 、Bis-T-23治 療 を 行 っ たPod-OgP^マ ウスが高度アルブミ ン尿及 び 足 突 起 構 造 異 常 に 至 ら な か っ た こ と か ら 、O-GlcNAc修飾のポド サ イ ト 細 胞 骨 格 タ ン パ ク へ の 関 与 が 示 唆 さ れ た 。本 研 究 で は 、 ポ ド サ イ ト 特 異 的O g t遺伝子 欠 損 か ら 足 突 起 構 造 異 常 に 至 る 具 体 的 機 序 や 、ポ ド サ イ ト に お け るO GT標的タンパクの同定 には至らな か っ た 。腎 臓 に お い て は 、1000以 上 の タ ン パ ク がO G Tに よ るO-GlcNAc修飾を受 け る と 報 告 さ れ て お り 、今 後 、細 胞 骨 格 タ ン パ ク を 含 む ポ ド サ イ ト 機 能 制 御 に 関 わ るOGT標 的タンパクの探 索 が 必 要 で あ る 。 【結 輪 】 タ ン パ ク 質 のO-GlcNAc修 飾 は 、 出生後のポドサイト足突起の発達過程において重要な役 割 を f e っており、正 常糸球体ろ過バ リ ア の 形 成 に 不 可 欠 で あ る 。
別 紙 様 式8 (課 程 博 士 •論 文 博 士 共 用 )
