Posted at the Institutional Resources for Unique Collection and Academic Archives at Tokyo Dental College,
Available from http://ir.tdc.ac.jp/
Title
№２：ラット顎下腺時計遺伝子およびアクアポリン５発
現の時間経過解析
Author(s)
佐藤, 涼一; 石塚, 洋一; 佐藤, 正樹; 木村, 麻記; 澁
川, 義幸; 田﨑, 雅和; 杉原, 直樹
Journal
歯科学報, 115(5): 471-471
URL
http://hdl.handle.net/10130/3855
Right
目的：臨床では，歯周組織再生を目的に生体由来の 足場材料が多く用いられているが，未知なる感染症 のリスク，物性のばらつきなどの問題があるため， 適切な合成材料が求められている。近年，合成マト リックスである自己組織化ペプチドハイドロゲルが 足場材料として注目を浴びており，生体の組織修復 について様々な報告がされているが，歯周組織に関 するものは少ない。そこで本研究はラットに外科的 に作製した歯周組織欠損に自己組織化ペプチドハイ ドロゲルを応用し，その効果を検討した。 方法：本研究は，東京歯科大学動物実験委員会の承 認を得て実施した（№２７２２０２）。In vitro において， ゲルの表面性状 は SEM に て 観 察 し た。宿 主 細 胞 （ヒト歯肉上皮細胞；Ca９-２２）と自己組織化ペプチ ドハイドロゲル（２．５％ RADA１６）と の 相 互 作 用 を Cell Proliferation Assay に て 解 析 し た。In vivo では６週齢雄性 Wistar ラットの上顎第一臼歯を抜 去し４週経過後，上顎第二臼歯近心に歯周組織欠損 を 作 製 し た。RADA１６応 用 群，Matrigel 応 用 群， 欠損のみの対照群を設定した。術後２，４週にて Micro-CT を撮影後，通法に従いパラフィン切片を 作成し，組織染色（H-E，Azan），免疫染色（増殖 細胞核抗原；PCNA，血管内皮増殖因子；VEGF） を行い，光学顕微鏡にて観察した。 結果および考察：RADA１６は微細な立体網目状構 造を呈した。歯肉上皮細胞は RADA１６と親和性を 示し，４８時間まで統計学的有意な増殖率を示した （P＜０．００１）。Micro-CT による評価では，RADA１６ 応用群の新生骨の骨体積率は，Matrigel 応用群， 対照群と比較し術後２，４週において有意に大きな 値を示し，骨梁間隙は有意に小さな値を示した。組 織学的に，RADA１６応用群の骨欠損底部に新生骨 が観察された。術後４週 に お い て，RADA１６応 用 群の骨欠損底部付近の歯根表面に斜走する歯根膜様 線維束が観察されたが，他の群では歯根とほぼ平行 に走行していた。術後２，４週の RADA１６応用群 に お い て，PCNA，VEGF 陽 性 細 胞 率 は Matrigel 応用群，対照群と比較し有意に大きな値を示した。 以上より，今回使用したラットの外科的歯周組織欠 損モデルにおいて２．５％ RADA１６の応用は局所の細 胞増殖と血管新生を促し，歯周組織の治癒を促進す ることが示唆された。 目的：すべての生物の摂食や睡眠といった生命活動 には概日リズムが存在している。また，概日リズム の異常と特定の疾患には相関関係があると考えられ ている。哺乳類の概日リズムの中枢時計は脳の視交 叉上核に存在し，肝臓など一部の臓器には末梢時計 が存在する。唾液腺も末梢時計を持つ臓器の一つで あり唾液分泌量に概日リズムがあることが知られて いるが，分泌リズムの形成メカニズムや調節因子に ついては十分な検討が行われていない。本研究は唾 液腺末梢時計のリズム形成メカニズムを時計遺伝子 の発現解析から検討することを目的とした。 方法：１０週齢オスの Wistar ラットを１２時間毎の明 暗環境（８時から２０時を明期）で４週間飼育し，自 由飲水下で自発的な Wheel-running 行動から概日 リズム を 記 録 し た。明 暗 期 の 運 動 量 を ラ ッ ト 用 Wheel 回転時の磁力変化から計測し，また摂食行 動を暗視撮影下で２４時間連続して記録した。運動量 記録から概日リズムの安定を確認後，６時間毎に ラットから顎下腺を摘出し，それぞれ total RNA を抽出した。加えて明期にあるラットから collage-nase および hyaluronidase による酵素処理後に４０％ Percoll 分画にて導管細胞と腺房細胞を単離し， 各々の total RNA を抽出した。各 total RNA はリア ルタイム定量 RT-PCR 法にて各種時計遺伝子（Bmal １，Per２，Clock，Cry１）およびアクアポリン５の β -actin 発現量に対する相対発現量を計測した。 結果および考察：行動解析実験より Wistar ラット は２０時から２４時に運動量のピークがあり，摂食活動 もこの時間帯に集中する傾向が見られた。また，作 成したダブルプロットアクトグラムより明暗環境２ 週ほどで概日リズムの安定を確認した。安定後の ラット顎下腺には４種の時計遺伝子（Bmal１，Per ２，Clock，Cry１）が発現しそれぞれ日内変動して いた。水分泌に関与するアクアポリン５には明確な mRNA 発現リズムが確認できなかった。したがっ て安静時唾液分泌の日内変動にはアクアポリン５発 現が関与しないことが示唆された。導管細胞と腺房 細胞の時計遺伝子発現量は計測したすべての遺伝子 で両者間に有意差を認めなかった。
