胃癌患者における自己リンパ球混合培養反応について

原 著 頁 421-426 昭和60年5月

胃癌患者における自己リンパ球混合培養反応について

東京女子医科大学 第三病院中央検査科 ノ プ オ ハ セ ガ ワ イチオカ シショウ

高橋

信夫・長谷川みち代・市岡

四 象

東邦大学

白

医学部第一内科学教室 イ タツ オ

井 達 男

(受付 昭和60年2月5日〉

Autologous Mixed Lymphocyte Reaction in the Gastric Cancer Patients Nobuo TAKAHASHI

，

Michiyo HASEGAWA and Shisyo ICHIOKA

Department of Central Labolatory， Tokyo Women's College daini Hospital Tatsuo SHIRAI

1st Department of Internal Medicine， Toho University School of Medicine

Autologous mixed lymphocyte reaction (auto-MLR) is a phenomenon that highly likely occurs in a living human body

，

and plays an important part in the immuno-regulatory network. The significance of the aut旬O

Powke Weed Mi比togenand LPS， a mitogen activating B cel1s， on the auto・MLRwere also studied. The

appropriate length of time taken for auto-MLR was 7-8 days. The auto-MLR for patients with gastric cancer was significantly (p<O.Ol) lower than that for normal adults. In normal adults Powke Weed Mitogen or LPS did not induce any increase in the stimulating ability of the stimulator cel1s. A1though the auto・MLRwas not influenced by the preculture of LPS in gastric cancer patients， the stimulating

ability of stimulator cel1s was increased by Powke Weed Mitogen in some cases. This fact suggests that patients with gastric cancer have a disturbance of the immuno-regulatory network.

緒 言

自 己 リ ン パ 球 混 合 培 養 反 応 (Autologous Mixed Lymphocyte Reaction，以下auto.MLR

と略す〉とはB細胞 (Bリンパ球〉およびマグロ ファージの細胞膜上のIa抗原(HLA.DR座抗原〉 によって自己のT細胞 (Tリンパ球〉が活性化す るとL、う現象加で，その活性化された

T

細胞は

B

細胞の抗体産生を抑制する suppressorT細胞と する報告3)やhelperT細胞とする報告4)があり実 験系の違いによって結論が一致しない傾向にあ る.しかしながら生体内においてもみられる可能 性の非常に強い現象で，免疫担当細胞の相互作用 にもとづく免疫調節ネットワークというきわめて 重 要 な 機 能 を 表 わ す も の で あ る . 今 回 我 々 は -421 a 加utωO タ一としての意義を検討し，さらにPowkeWeed Mitogen(以下PWMと略す)，

L

i

popolysacchar -ide(以下LPSと略す〉という B細胞を活性化す るmitogenS_{)6)7)叫による影響も検討した.} 対象および方法 1.対象 胃癌患者は 8例(男 4人，女 4人，平均年齢63 歳〕で， stage 1 3例， 11 1例， III 1例， IV 3例 である.そのうちstageIIIの1例は5・FUを投与 していて残り 7例は未治療のものである.対照は 健 康 成 人19例について行なった.

2

.

方法 l)

T

細胞， non-T細胞の分離

ι.J _ He戸nn J 出peripheralblood + PBS ~ Ficoll-Conray (S.G.l，077) Centrifuge Plasma + PBS 4 ∞ g 30mm

ι

十/ζごPBL(J片y岬hoc可y匂 回s+monocytes)+P凹bt叫 " ド::::Y-____Ficoll-Conray ~Buffycoat .j.-RBC 「寸____PBS Wash three tim廿 withPBS I T Centrifue 400g 5min ヒコL一一PBL

l

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ell Centrifuge 400g 5min Fig. 1 Method of autologous mixed lymphocyte reaction. Separation of T-cells were done by sheep erythrocyte rosetting. Fig. 1に概略を示した.健康成人および胃癌患 者 よ り へ パ リ ン 加 静 脈 血20-30mlを採取し， Ficoll-Conray比重遠心法(比重 1.077) により末 梢血単核細胞を分離，回収した.末梢血単核細胞 を胎児牛血清 (FCS) に浮遊させ，単核細胞とヒ ツジ赤血球を 1:100の割合で混和し，数本の培養 管に分注し培養管ごとの単核細胞数を 4-5X 106_{個とした.各培養管を 300g，5min.遠心し，氷中} に1時 間 静 置 後 血 球 を 再 浮 遊 さ せ 40 Cの状態で Ficoll-Conray比 重 遠 心 法 に よ り 細 胞 分 離 を 行 なった.遠心後，中間層にはヒツジ赤血球とのロ ゼット非形成細胞 (non-T細胞分画〉が集まり， 管底にはロゼット非形成細胞 (non-T細胞分画〉 が集まる.管底のヒツジ赤血球は0.85%，N H4Cl 液で溶血除去した.それぞれのリンパ球をリン酸 緩衝生食液 (phosphatebuffer saline

，

PBS)で 2 回洗浄後，培養液 (RPMI-1640)に浮遊さぜた9) 2) auto・MLR stimulator cellを RPMI-1640に5-15x106_/ 422 3H-TdR dpm 90，000 80，000 70，000 60，000 50，000 40，000 30，000 20，000 10，000 T十non-Trnmc(normal adult， n二 19) 4 5 6 7 8 Day of culture Fig.2 Autologous mixed lymphocyte reaction in normal adults. Lymphocytes (T+non-Tmmc) were incubated for 4-8days in RPMI-1640 sup -plem巴nted with 10% autologous serum. 3H_ thymidine was added for 6 hours， lymphocytes were harvested and their radioactivity was as -sayed. The value are expressed as the mean土 standard deviation. m Hこ浮遊し， これを mitomycin C (MMC) 50 μg/mlの濃度で3TC，30分処理後， PBSで 2回， RPMI-1640で 1田 洗 浄 し DNA合 成 を 抑 制 し stimulator cellとした.培養管 (Falcon#2054) にstimulatorcellを 5x105個

，

responder cellを 5 X 105個とり RPMI-1640 (10%補体不活化自己 血清〉に浮遊後，3TC， 5 %COz， 95%Air ~こて 7 日 間 培 養 し た . 培 養 終 了 の 6時 間 前 に3H_ thymidine 1μCiを加え，細胞を回収し液体シンチ レーションカウンターで β線 (d.p.m.) を測定し た. 3) P W M， LPS処理による auto・MLR 末梢血単核細胞を T 細胞と non-T細胞に分離 後， non-T 細胞 5x105/ml~こ PWM50μg ， PWM10μg(Gibco， 670)， LPS50μg(Sigma， E. Coli40l2)をそれぞれ添加し， 2日間培養後 M M C 処理を行い PBSと RPMI-1640で洗浄後， T細胞 単独で培養した培養管に加え5日間および7日間 の培養を行なった. 結 果 auto-MLRの 最 適 な 培 養 日 数 を 決 め る た め に 4-8日間の経時的変化をみたのが Fig.2であ

る.3H-thymidineの 取 込 み の 最 大 値 は 7日目 (51，192

:

t

22， 663d.p.m.)に認められたが 8日目 との差はわずかであった.以後のauto-MLRの培 養は7日間とした.Table 1は健康成人19例の7 日間培養のauto-MLRを示したものである. non-T細胞をMMC処 理 に てDNA合成を抑制して stimulator cellとして， T細胞を responderとし た培養系が最も高l，3H-thymidineの取込みを示

Table 1 Autologous mixed lymphocyte reaction in normal adult. Tmmc十non-T T+non-Tmmc Tmmc十non-Tmmc Tmmc non-Tmmc Incorporation of 3H-thymidine dpm(n=19) 6， 738:i:5 ，101 51，192:i:22，663 304:i:124 262:i:98 310:i:117

Lymphocytes were incubated for 7 days in RPMI-1640 supplemented with 10% autologous serum. The value are expressed as the mean士standarddeviation. Tmmc indicate inactivated T cells by mitomycin C. non-Tmmc indicate inactivated non-T cells by mitomycin C. 3H-TdR dpm 150，000 140，000 130，000 120，000 110，000 100，000 90，000 80，000 70，000 60，000 50，000 40，000 30，000 20，000 10，000 Non-T PWM 10μg (normal adult， n=10) Day of cul ture した 胃 癌 患 者 の auto・M L R CT+non-Tmmc)は Table 2に示したごとく，健康成人に比べてp <

Table 2 Autologous mixed lymphocyte reaction in the gastric cancer patients. non-Tmmc indi -cate inactivated non-Tcells by mitomycin C.

Lymphocytes were incubated for 7 days. Case Age Sex Stage T+non Tmmc _d.p.m. A.I 77 F I 36，718 M.M. 70 F I 21，388 Y.K 36 M I 18，795 T.S. 60 F II 25，402 S.M. 65 M III 48，778 I.W. 44 M IV 22，293 T.Y. 81 M IV 547 R.T. 67 F IV 455 Gastric cancer乱1ean士S.D 21，797士16，388 N ormal adults Mean士S.D. _{51，192:i:22，663} 3H-TdR dpm 110，000 100，000 90，000 80，000 70，000 60，000 50，000 40，000 30，000 20，000 10，000 (n二19) Non-T LPS 50μg (normal adult， n=10) 4 Day of cu1ture Fig. 3 P W M (50μg， 10μg) and LPS induced incorporation of 3H-thymidine by non-Tcells. non-Tcells (5XI0') were incubated for 1-5days in supplemented RPMI-1640. 10% of autologous serum was added to the medium. The values are expressed as the mean:tstandard deviation

Table 3 The e妊ectof LPS and PWM on auto -MLR in normal adults. The value are expressed as the mean士standarddeviation. T十non-Tmmc T十non.Tlpsmmc T +non. Tpwm 50 mmc T+non-Tpwm 10 mmc Incorporation of 3H-thymidine dpm(n=19) 51.192::!:22，663 34，776士 8，160 35，237::t9，839 37，489士7，303 0.01の有意な低値 (21，797::1::16， 388d.p.m.)を示し た 5FUに よ り 治 療 を す で に 開 始 し て い た stage IIIの 1例が最も高く (48，778d.p.m.)，stageIVの 3例のうち 2例は著しく低値 (547d.p.m.，455d.p. m.)を示したが，残り 1例は stage1とあまり差が なかった.stageIVの著しい低値の2例はスミル ノフ検索で棄却されなかった. non-T細胞分画単独に P W M，LPSを加え3H_ thymidineの 取 込 み を 経 時 的 に み る と 最 大 値 は PWM50μgでは 2日目， PWM10μgでは 3日目， LPS50μgでは 5日目に認められた CFig.3). 健康成人のnon-T細胞を P W Mあるいは LPS で 2 日間 precultureし た 後 に 5 日 聞 の auto -MLRを行なった結果を Table3に示す. LPS， 'H-TdR d.p.m 13XI04 2 1 0 9 1 1 1 4 lXlO'

¥

、

PWMともに低値の傾向を示したが有意差は認め られなかった.表には示していないが 2日間の preculture後 7日間の auto-MLRを行なった場 合は著しい低値を示すものなどがあり培養には適 当ではなく，以後の実験は2日間の precultureと 5日間の auto・MLRとした. 胃癌患者における LPS，PWMpre配cu叫Ilt凶ur陀eによ るa加u武山

t

ω

O

したものは軽度低値の傾向を示したが有意差は認 められなカか逸つた.00，453士11，540d.p.m.). PWM50μgの precultureでは3H-thymidineの取 込みは34，368::1::29，516d.p.m.と軽度増多の傾向を 示した.特にstage 1の Y

.

K

.

36歳と stageIVの T.

Y

.

81歳の 2例 が92，370d.p.m.，63， 469d.p.m.と 著 明 な 増 多 を 示 し た .PWM10μgの 場 合 も 48，395士41，804d.p.m.と軽度増多の傾向を示し， 50μgの時の 2例 に 加 え て stageIVのI.W.44歳 が78.191d.p.m.と著明な増多を示した (Fig.4). 考 察 今回auto-MLRが胃癌患者において低値を示 すことが明らかとなった.ステージ別の額向は症 例数が少ないので今後の検討が必要のように思わ れる.Smithら3幻)はau叫1此to 胞はsuppressorT細胞でで、あるといい， Chiorazzi auto-MLR LPS preculture auto-MLR PWM50μg preculture auto←MLR PWMIOμgprecultufE Fig.4 The e妊巴dof LPS and PWM on auto-MLR in the gastric cancer patients. Two closed circles binded by a line indicate the same patients.

424-ら4)はhelperT細胞であると報告していて実験系 の違いにより異なる結果がでている.しかしなが らB細胞とマクロファージの細胞膜上の Ia抗原 (HLA-DR抗原，分子量23，000と30，000の二つの 分子からなる〉によってあるサブセットの

T

細胞 (主に

OKT4+

の 細 胞 ? ) が 活 性 化 さ れ ， そ れ に よってTCGF(T cell Growth Factor，インター ロイキン2)の産生がもたらされ，さらに他のT 細 胞 サ ブ セ ッ ト ( 別 の

OKT4+

細胞と

OKT8+

細 胞〉が活性化するという一連の現象は生体内での 自 己 の 認 識 機 構 と し て 重 要 な 意 味 を 持 っ て い る川.胃癌愚者ではこの細胞間相互作用にもとづ くネットワークに障害がみられることが示された と思われる.一方 加

a

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O

異的にみられる現象でで、はない.ホジキン病

1

1

1

慢性 リンパ性白血病， SLEI2)13)などでも低値が報告さ れている.Englemanら11)はHLAの一致したリ ンパ球を用いてホジキン病のauto・MLR低値の 原因はT細胞にあると報告している.SLEの活 動期では坂根ら1町工T細胞， non-T細胞の両方に 欠陥があり，非活動期では

T

細胞のみに欠陥があ ると報告している.我々の実験ではHLAの一致 した患者の同胞などのリンパ球を用いた混合培養 反応を行なっていないのでT細胞と non-T細胞 のどちらに欠陥があるか直接検索できなかった が， PHA反応の低下が広く認められていること をふまえると

T

細胞機能の低下をある程度表現 していると思われる.stimulator cell (non-T細 胞，主にB細胞とマグロファージ〕のmitogenに よる活性化がauto-MLRの活性化に影響をもた らすかをPWM，LPSによって検討しauto・MLR の低い状態の胃癌患者では， PWMでpreculture 後 MMC処 理 を 行 い 培 養 上 清 を 除 去 し て 培 養 し ているので， stimulator cellの細胞自身になんら かの変化を生じ，刺激能をたかめている症例の存 在を示したと思われる.すなわち，健康成人では non-T細 胞 の 刺 激 作 用 はPWMによる影響をう けないが，胃癌患者では

T

細胞機能の低下に加え てnon-T細胞の機能も低下している可能性があ り，その機能がPWMによって回復する症例と， しない症例があると推定される. 総 括 1)au叫1此to 細胞膜上のIa抗原(HLA-DR座抗原〉汁tにこよつてT 細胞が活性化するとL、づう現象でで、，生体内での自己 の認識機構として重要な意味を持っている. 2)ロゼット沈降法によって得られた 5X105_個 のstimulatorcell (non-T細胞，主に

B

細胞とマ グロフア一ジ〉と 5X10_吋5

_f

_{固のrespondercell (T} 細胞〉

λ

，最終濃度1叩0%の補体不活化自己血清を用い たau凶1此to 日間でで、あつた. 3)胃癌患者のauto-MLRは健康成人に比べて p<O.Olの有意な低値を示した.

4

)

胃 癌 患 者 で はLPSのprecultureはauto -MLRに 影 響 を 与 え な い が ， P W Mで は stimulator cellの刺激能を高める(回復させる〉 症例が存在した. 5)我々の実験ではnon-T細胞の刺激作用には じまって

T

細 胞 が 活 性 化 さ れ る ま で の 詳 細 な 過 程は不明であるが，胃癌患者ではT細胞と non-T 細胞(主にB細胞〕の機能低下が推定され，全体 として免疫調節ネットワークの障害があると考え られた. 本論文の要旨の一部は第25回日本臨床血液学会総 会 0983年，東京〉において発表した.東邦大学医学 部免疫学研究室の利用を許可していただいた東邦大 学医学部微生物学教室五島瑳智子教授，免疫学研究室 石川文雄助手に深謝いたします.さらに著者の第一内 科大学院での免疫実験操作の基本を指導していただ いた帝京大学溝の口病院小児科新保敏和講師に深謝 いたします. 文 献 1)Opelz， G.， Masahiro， K.， Takasugi， M. and Terasaki， P.I.: Autologous stimulation of human lymphocyte subpopulation. J Exp Med 142 1327 -1333 (1975) 2)Kuntz， M.M.， Innes， J.B.and Weksler， M.E.: Lymphocyte transformation by autologous cells. Human T-lymphocyte proliferation in -duced by autologous or allogeneic non-T lymphocytes.

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