学位論文内容の要旨

博 士 （ 農 学 ）    レ イ リ チ ャ ン ド ラ ワ ス キ タ サ リ

学 位 論 文 題 名

Biodegradation of phenolic compounds by extracellular peroxidase in suspension cell  culture of liverwort Heteroscyphus planu;s

（コケ植物Heteroscyphus planus 懸濁培養細胞の細胞外 ペ ルオ キ シ ダ ー ゼ によ るフ ェノ ール化 合物 の分 解）

学位論文内容の要旨

    A nutnber of oX

晒

vem

ぴ

n

懿 鰤

nb

矧 ち 血 垣

andw

闘

d

釘

pla

艢

ha

忙 ぬ

lI

叩

med

め

d

呼 眦 証

0ma

此び｝

nluta

恤，

HdWeVqthem

出迎

ivcmZym

岱血 ，rn10vゾ酉

pl

鮒畦Su出 笛m畷W0鴫硼la醜le終 卸 珂伍（ れH響衂 伽ヴ謦 肛旺甜 蛔ぴ攤Sandび灯ヰ 瓰dShavebemb吐ぬd価om缸adplantandculm耐OeuS

0f

】

iv

閉恥n屈 砲m町め 瓣ヰ訊 ぬ11職c剛髀r1曲 甜com】卿

mdswe

絶鑁贓

ed

めbe閉 ぬ篤edぢc商das髑

Such

鵠 ぴ瓢｝

xidaS

餾Wi吐1血吐に∞lbof恤liVばW0nn瑚db嶋1hema血｛）bjぱホ′eoflhbmユdyW盤ゆ 洳

es

蜘

mebiod

呼

ad

面

0nof

脚

n

批 讎 恥

mdS

ぢ 恤 嚠 脚

veenZ

卩 髄 血 舛 叩 髑

ionceu

甜 眦

of

足 洳 弧

1kstudyw

笛

caH

湖

0m

鵠

fonows

：

W

岫 恥

of

馳 捌

hd

釘 靜 面

d

纖 讎 晦 血

suSpensim Ceucl

｝ 細】 陀

0r

足朗 鰄瓣and恤 伽b10ementof恤

pe

喞【id慾ea甜V衂

and

聰晩蜘 的馳師

onby

砒駈0n

0f

皿 洲ic捌

npoundSandm

∞ ｜ 晩rpem． ，

2

．

B

伽 昭

ad

甜0nofbiS曲

e

∞

lA

￠

pA

）

andlign

血

model

啣

npound

皿

MIG

舒

laia

嚠出

ced

‐pg面a剛

e

恤ぬ3翩

r

齟pu面 倒ianof恤嚠 珊嚠11d釘

pe

薑・

0Xi

．d鴛 血 血 賦

edwimch

臣

nicd

ぬ ℃ 終 世

ingcoh

班

mchmma

め 夢 叩

hyand

紬 鳩 醯 ぢ

SDSI A

（ 氾

n

舶蓋沁蝋鮒師吋andI12儀（ニon憾ltr臓n血S弧pe噛ibnCnCubmofE廟ヰ弧

    P

貳函dase卸小衂W盤d曲貿ted缸恤m鼇師mofa鋼1叩閉SioぬOeucu曲皿eof口：p細班uSingagu茄卸01 蝋LO鴫vql卸ca艶齟ホ衂w絡nヰd曲ected班ingZ21一a五膩心虹sやそmylb閉z山ia加1む1e16・s1丗bねjcadd

（

AB1

珂総aSu岫讎e，Duringina出面伽at25℃f（ぽ13daysmdぱ30001uxofc0晒m珊硲1轡1ちpem晒d譌e 弼 丘v衂缸 鴛ased踟丗蜘。｜姆襾m廿℃cenぴ）w血1k伽｜n璃suppl觚I鮒圃w油2，6dim甜鰤卵h印01， び 綴

01

，

andn

忙 血

y

刪 闘

Dxid

瞬 甜

iv

叫

ab

讎

tw0

血 岱

M

曲 ぱ

th

觚 廿

K

闢

wimaut

山 珈 齢

com

び

mnd

紅7daysina出面伽， 恥驪閏 血塘廿 薑吐舛 ぱlu面0nofpe蜘函da鉛

maybe

血duoedbIy體ぬ血

m

崩 伽Ccompa】

ndS

．皿塒

m

閲〓a鱈 缸pem虹曲 艶amV叫

an

ぱa出｜

i

血珊0f也o艶皿ぬ湖iccompmm幽W郷 鰍 卿 咄 面

edwimaM

曲

leve10f

聴

q

翻 強 恤 面 弧

Addidmof

尚 叔 珊 閉 め

e

眦 め 蝕

a

舶 鵬 缸 繊

sed

慨 ぴ 閥 晒

da

馳

a

面

vi

炒 甜

mH

： ぶ

2

．

c0

胤 導班 面

mabauttw0

血 畷

M

罍 財

thanmo

闘0fC0曲魂

wlmc

岫 闇

DXida

闘 笹 丘

V

劔

and

聰 暘 ∞ 】 搬 曲面 伽

W

鶻

notdl

繊Oedbyad師

mof

（ ＋ ）皿 珊

eI

（ ± ）

B

吋 馴 卸 ビ 眦 江 出

1

曲 鰍 丶 耐 盤

amm

瞻 饗 繼 缸

nvaSd

釘

pla

艢

andndd

蜘

C

鬪 血 足 伽 鮒 め

w

】 旧

e

（ ＋）哦 ．・pi贓 ぬ迅an邇 ぱ刪弧 畑pe弛缸 霞伽鮒 蝋n纖6b溜 刪i 恥

cleady

缸脆 蝴t缸岫曲e脚cal

    

―271―

← ！ 郁        l

s t r e s s   t o   t h e   c e l l s   o f   l i v a w o r t   r e s u l t e d   i n   t h e   e n h a n c e m e n t   o f p e r o x i a s e   a c t i v i t y   a n d   H 2 0 2 8 n c e n l r i o n

       一

B i o d e g r a d a t i o n   o f   B P A a n d   L M C

   〇 x i d a t i o n   o f   B P A   b y   s u s p s i o n   c e l l   c u l t u r e   a n d   c u h u r e   f l t r a t e s   w e r e   c a r r i e d   o u t .   E i t   m i l l i g r a m   o f   B P A

w a s   a d m i n i s t e r e d   t 0   2 0 0   m l   o f   s u s p e n s i o n   c e l l   c u l t u r e a n d   c u l t u r e   f i R r a t e s   a n d   i n c u b a t e d   f o r   5   d a y s .

       

。 。

d

鬟 ，

A p p r o x i m a t e l y   6 3 %   o f   t h e   B P A

，

w a s   o x i d i z e d   t o   o t h e r     5

ぽ ザ

p r o d u c t s   i n   t h e   s u s p e n s i o n   c e l l   c u l t u r e ,   w h i l e   4 1 % ぼ

t h e   c u l t u r e   f i l t r a t e s .   O x i d a t i o n   o f   B P A   b y   t h e   c u l t u r e

f l t r a t e s   w a s   p e r f o r m e d   i n   o r d e r   t o   e l u c i d a t e   t h e

d e g r a c W i o n   p r o c e s s .   B P A   w a s   m a i n l y   o x i d i z e d さ

i n s o l u b l e   p o l y m e r s   ( 3 0 。 ノ ジ w h i l e   G G M S   a n a l y s i s   o f

、 レ 声 鼇

驚

       

廿

   

や ゴ 尋 ロ

4 B I

亀

l

− 暑

        5

尋 五 喜

ト

r

暑

i l

暑 書 ― ― ′

l J

ヨ ゃ ー

6

毒 毒 ．

t h e   E t O A c   e x t r a c t s o r n   t h e   c u l t u r e   f l t r a t e s   d e t e c t e d   t h e   p r e s e n c e   o f   4 ‑ i s o p p e n y l p h e n o l   ( 1 . 6 9 % )   a n d

4 ‑ h y d r o x y a c e t o p h e n o n e   ( 0 . 0 6 1 % ) .   T h e   f o r m i o n   o f   t h e s e   I w o d u c t s   w a s   e x a m i n e d   u s i n g H 1 4 ] ‑ B P A .   B a s e d

o n   t h e   M S   s p e c a   o f   n o n ‑ l a b e l e d   a n d   2 1 ̲ I ̲ l a b e l e d   4 ‑ i s o p r o p e n y l p h e n o l   a n d   4 ‑ h y d r o x y ‑   a c e t o p h e n o n e ,   t h e

p o s s i b l e   d e g r a d a t i o n   p a t h w a y   o f B P A ， w a s   p r o p o s e d   ( F i g l ） ．

    S i n c e   n o   r q x u t   a b o u t   o x i d a t i o n   o f l i g n i n   b y   p e r o x i d a s e

o m   l i v e r w o r t   c e l l   c u l t u r e ,   t h e   o x i d a t i o n   o f   L M C ぎ

s u s p e n s i o n   c e l l c u l t u r i e   o f   t h e l i v e r w o r t w a s   e x a m i n e d     t h e

o x i d a t i o n   o f   L M C   w a s   c a r r i e d   o u t   i n   s u s p e n s i o n 。 e n

c u h u r e   a n d   c u l t u r e   f i l t t a t e s ゛ e a c h   o f   w h i c h 8 n t a i n e d   o f   1 0

量 g ぢ さ ぎ 2 5 0   m l   o f   c u l t u r e .   T h e   H P L C   a n a l y s i s   o f

E t O A c   e x t r a c t s   s h o w e d   t h a t   t h e   r e s i d u a l   L M C   i n   t h e

s u s p e n s i o n   c e l l   c u ぎ 】 r e   a n d   c u k u r e   f l t r a t e s   w e r e   3 0 . 7 0

聾 ＆ ． や ぎ r e s p e c t i v e l y .   B i p h e n y l   d e h y d r o d i m e r ． w a s

d e t e c t e d   i n   b o t h   t h e   r e a c 4 i o n   m i x t u r e s   o f   t h e   c e l l   c u l t u r e

a n d   c u l t u r e   f i l t r a t e s   i n c u b a t e d   w i t h   L M C   ( 8 . 6 %   i n   t h e   c e l l

c u l t u r e   a n d   1 8 ． 8 % ず ヰ ぷ c u H u r e d   f l t r a t e s ) .   G G M S

a n a l y s i s   o f   t h e   E t O A c   e : x t r a c t s   f r o f f i   t h e   c u l t u r e   f i l t r a t e s

脅 ー

    オ

歪

l

甲 ア

奢 ー ― 腎 ． 丑

   

ゴ

l f    

ぎ ー 署

E

d e t e c t e d   t o   p r e s e p c e   o f 8   n i f e l   a l 8 巨 ‐ f a u l i c   a c i d ,   v a n i l l i n   a n d   g u a i a c o l   a s   d e g r a d e d   p r o d u c t s   o f   L M C ．

B y   o x i d i N i n g   v a m l l i n   a n d 8 m e r y l   a l c o h o l t h e   p o s s i b l e   d e g r a d a t i a ― n   p a t h w a y   o f   L M C   w a s   p r o p o s e d   ( F i g ゼ

P a r t i a l   p u r M c a t i o n   o f   t h e   e x t r a c e H u l a r   p e r o x i d a s e

    T h e 黌 ぼ c e l l u l a r   p e r o x i d a s e   w a s   s e p a r a t e d   b y 8 m b i n a t i o n s   o f 8 ー u m n   c h r o m a t o g r a p h y   w i t h   3 7 ． 7   f o l d

p u r i f i c a t i o n   H o w e v e r ,   f u r t h e r   p u r i f c a t i o n   c o u l d   n o t   b e   d o n e ,   b e c a u s e   t h e   a m o u r t t   o f   t h e   p r o t e i n   w a s   n o t

e o u g : h   t o   b e   a n a l y z e d     A l a r g e   s c a l e   p r o d u c t i o n   o f   t h e   e n z y m e   i s   n e c e s s a r y   t o   p u r 1 や   t h e   s e c r e t e d   p e r o x i d a s e

o f   H . p l a n u s ，

       日 お r e s u l t s   d e s c r i b e d   a b o v e   o p e n ， u p   a   p o s s i b i l i t y   f o r   l i v e r w o r t   c e l l   c u l t u r e   a s   n e w   a l t e r n a t i v e

m e t h o d   i n   b f o r e m e d i a t i o n   s t u d i e s .   A   p o s s i b l e   e c o l o g i c a l   r e l a l i o n s h i p   b e t w e e n   l i v e r w o r t s   a n d   v a s c u l a r   p l a m s

v i a   c b e m i c a l s   w a s   h y p o t h e s i z e d ．   T h e   r e l e a s e d   s p o r e s   : f i o m   g a m e t o p h y t e s   o f   l i v a w o r t s   m a y   d r o p s   a n d

g c a m i n a t e   o n   t h e   s r u f a c e   o f   a   l x u k   T h e n   l h e   i n t r a c e l l u l a r   p e r o x i d a s e   w h j c h   m a y   b e   i r w o l v e d   i n   t h e   c e l l

e l o n g a t i o r i   d u r i n g   g e r m i n a t i o n ,   m a y   b e   e n h a n c e d   b y   v o l a t i l e   p h e n o l i c   c o m p o u n d s   o r   m o n o t a p e n e s   e m i t t e d

f i o m   v a s c u l a r   p l a n t s ．     1 2 7 2 ―

学位論文審査の要旨

学 位 論 文 題 名

Biodegradation of phenolic compounds by extracellular peroxidase in suspension cell  culture of liverwort Heteroscyphus l:,lanus

（コケ植物Heteroscyphus planus 懸濁培養細胞の細胞外 ベ ル オ キ シ ダ ー ゼに よる フェ ノー ル化合 物の 分解 ）

  

微 生物 、 真 菌 類、 維 管 東 植物 由 来 の 酸化 酵 素 を 用い た 環 境 汚染 芳 香 族 化合 物 の分 解に関 し て 多 くの 研 究 報 告が な さ れ てい る が 、 コケ 植 物 由 来の 酸 化 酵 素に よ る 芳 香族 化 合物の 分 解 に 関 する 研 究 は ほと ん ど な い。 コケ植物

Hete

．rDs卿 轟uspぬ皿

us

の母 植物ある いはそ の培 養 細 胞 から 多 く の 高度 に 酸 素 化さ れ た テ ルペ ン や ポ リフ ェ ノ ー ル化 合 物 が 見出 さ れてい る が 、 こ れら の 化 合 物は 細 胞 内 で酸 化 酵 素 によ り 生 成 する 酸 素 活 性種 の 作 用 によ り 生成す る と 考 え ら れ る 。 本 研 究 は、 コ ケ 植 物且

p

血 ロ

us

懸濁 細 胞 培 養中 の 酸 化 酵素 に よ る 芳香 族 化 合 物 の 生分 解 に 関 して 、 以 下 の点 に つ い て研 究 し た もの で あ る 。1） 鼠pぬ皿

Hs

懸濁細 胞培 養 中 の 細胞 外 ペ ル オキ シ ダ ー ゼ活 性 の 分 析と フ ェ ノ ール 化 合 物 及び モ ノ テ ルペ ン 類の添 加 に よ る 酵素活 性の誘 導。2） 〃．planUs細 胞培養 による 環境汚 染物質 ビスフ ェノー ルA（BPA） 及 び り グニ ン モ デ ル化 合 物 （

LMC

、guaiacylglycerolーB―

guaiacylether

）の 生分解 。3）化 学的ストレスにより誘導される細胞外ペルオキシダーゼの部分精製。

  

その結果、以下の点を明らかにした。

″．m釦船懸濁培養中のベルオキシダーゼ活性と過酸化水素濃度。

  H

．

planus

細 胞 培養 中 の 細 胞外 ベ ル オ キシ ダ ー ゼ 活性 を

guaiacol

試 験 で 、ま た 、 ラ ッカ ーゼ活性を2，2 ―azin0―bisー（3ーmethylbenzthiazoline―6―sulfonicacid（ABTS）で検出を行 っ た 。 〃 ．

pjanus

培 養 細 胞を

30001ux

連 続 光 照射 下

13

日間 の 培 養 した 結 果 、 細胞 外 ペ ル オ キ シ ダ ーゼ 活 性 は 細胞 の 増 殖 と同 調 的 に 増加 す る こ とが 確 認 さ れた が 、 ラ ッカ ー ゼ活性 は 検 出され なかった 。また 、種々のフェノール化合物（2，6ーdimethoxyphenol、〆cresol、LMC）

    

―273―

助 信

之 幸

咲

憲  

  浩

英 公

田 方

藤 浦

橋

鍋

生

伊

松

高

授 授

授 授

教

   

   

教 教

教 教

准 准

助

査

査

査

査

査

主

副

副

副

副

の 添 加に よ っ て ペル オ キ シ ダー ゼ 活 性

(1.8

倍） 及 び 過 酸化 水 素 量 が増 加 するこ とが示 され た。 一方、 モノテ ルペン化 合物で ある（ 士）−

bornyl acetate

の 添加によってペルオキシダー ゼ 活 性と 過 酸 化 水素 量 が

2

．

O

倍に増 加した が、内 在

性 の （ ＋ ）ー

a

―plneneの 添 加で は 両 者 とも 増 加 し な か った 。

〃 ．

planus

培 養 細 胞 に よ る

BPA

の 生 分 解

  H

．

 planus

懸 濁 培養 細 胞 に

BPA

を添 加 す る と不 溶 性 の 反 応 生 成 物 を 生 成 し 、

BPA

が 細 胞 外 ペ ル オ キ シ ダ ーゼ に よ っ て酸 化 さ れ る可能 性が示 唆された 。 す な わ ち 、 非 標 識 及 び

2H14

ー

BPA (8mg)

を

200 ml

の 培 養 液 に 加 え 、

5

日 間 培 養 し た 結 果 、

63

％ が 他 の 化 合 物 に 転 換 し た 。 ま た 、 培 養 細胞 を 取 り 除

い た 培 養 濾 液 の み で も、

41

％ のBPAが 他 の 化合 物 に 転 換し た 。 生 成物 の 大 部 分は 不 溶 性 の 重 合 物 で あ る が 、 可 溶 性 生 成 物 を

GC‑MS

分 析 し た 結 果 、

4‑isopropenylphenol

お よ ぴ

4‑hydroxyacetophenone

を 分 解 物と し て 検 出し た 。

2H14‑BPA

か ら 生成 し た こ れら の 化 合 物 の 重 水 素 の 標 識 パ タ ー ン か ら

Fig.l

に 示 し た 分 解 過 程 を 推 定 し た 。

H. p

ぬ

m

硲 培 養 細 胞 に よ る

LMC

（

guaiacylglycerollB

―

g

弧

iacylether

） の 分 解

  

今 ま で コ ケ 培 養 細 胞 に よ る り グ ニ ン 及 び り グ ニ

    d

仔―guaiacyletherを選び、細胞培養並びに培養濾  /・I｜ッ‥、ご¨

液による生分解を試みた。LMC(10 mg)を250r

の 培 養 液 お よ び 培 養 濾 液 脚 ロ え 、

5

日 間 培 養 し ミ

  

＆ ： ， 了 苺 ： ： ヌ ー

q

‥ ・ 反 応 生 成 物 を 酢 酸 エ チ ル 抽 出 し 、 生 成 物 を

HPLC

分

  

… 噐 ‥

hmI  n

ル

  

｛ 、 凱

    

｜

析した結果、添加したLMCのうち、それぞれ、

biphenyl  dehydrodimer (Fig.

物

dimmer LMC)

分 簍

  

羲 ： ｜ ， ］ ， 、 →

A

而 →

q

‥ 。

biphenyldehydrodimer

（Fig．2中dimmerLMC）で

  

…I

    ICnllWWlJ  V

ロnlulll  丶m｜I竍H；｜ピ．d

るが、そのほカゝ、coniferyl alcohol、ferulic acid、  mユ..ajofd。ビ

dmion paih.v¥.

。「LMc

vanillin

、guaiacolを分解産物として検出した。

Vanillin

及 び

coniferyl alcohol

の 培養 液 に よ る転 換 実 験 によ り 、

Fig.2

に 示 す よう な

LMC

の分解過程が推定された。

  

なお 、 細 胞 外ペ ル オ キ シダ ー ゼ 活性 を種々 のカラ ムクロマ トグラ フイー を組み 合わせ て約

38

倍まで精製したが、最終的な生成に至らなかった。

  

以上 の 研 究 成果 に よ り 、コ ケ 培 養細 胞によ って、 芳香族化 合物が 酸化的 に転換 、分解 する こ と が示 さ れ た 。な お 、 維 管束 植 物 か ら放 出 さ れ るフ ェ ノ ー ル物 質 や モ ノテ ル ペ ン によル コ ケ の細 胞 外 ペ ルオ キ シ ダ ーゼ 活 性 が 誘導 さ れ る こと か ら 、 化学 物 質 を 介し た コ ケ 植物一 維 管 束 植 物 間 で の 情 報 伝 達 の 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 よ っ て 審 査 員 一 同 は

Leily Tjan

く

lrawasHtaSan

が 博 士 （農 学 ） の学位 を受け るのに十 分な資 格を有 するも のと認 めた。

―

274 ‑

争…

［ い卜 な

m

は『 黯』 究り 獅．

… す

g

関て にし 叢 の化 物ル 合デ 化モ ルン デニ モグ