学位論文内容の要旨

博 士 （ 医 学 ）    小 林 和 夏

学 位 論 文 題 名

Decrease of peripheral and intestinal NKG2A ― positiveT     cells in patients with ulcerative colitis

（潰瘍性大腸炎における末梢血および大腸粘膜固有層NKG2A+T 細胞の減少）

学位論文内容の要旨

【 背 景 と 目 的 】 腸 管 に は 多 数 の 免 疫 細 胞 が 存 在 し て お り 、 そ れ ら は 常 時 外 部 か ら 多 数 の 刺 激 を 受 け て い る 。 通 常 、 腸 管 の 免 疫 反 応 は 抗 原 に 対 す る 免 疫 応 答 と 宿 主 に 対 す る 障 害 を 抑 制 す る 機 能 と の 聞 で バ ラ ン ス が 調 整 さ れ 、 炎 症 が 制 御 さ れ た 状 態 に 保 た れ て い る 。 炎 症 性 腸 疾 患(inflammatry bowel disease、 以 下IBDと 略 す ） は 慢 性 的 か つ 再 燃 性 の 腸 管 炎 症 が 特 徴的で ある疾 患であ り、 潰瘍性 大腸炎(ulcerative colitis、 以下UC)、ク ロー ン病(Crohn s disease、 以 下CD)が 代 表 的 な 疾 患 と し て 挙 げ ら れ る 。 こ れ ら の 疾 患 は 感 染 や 環 境 、 遺 伝 等 に よ り 影 響 を 受 け 、 腸 管 内 病 原 体 に 対 す る 免 疫 防 御 機 能 と 炎 症 反 応 の バ ラ ン ス が 崩 れ る こ と で 生 じ る と 考 え ら れ て い る 。NK細 胞 は 自 然 免 疫 の 主 要 因 子 と し て 働 く 細 胞 傷 害 性 リ ン パ 球 の 一 種 で あ り 、 サ イ ト カ イ ン や ケ モ カ イ ン を 産 生 し 抗 体 依 存 性 、 非 依 存 性 の 細 胞 傷 害 機 能 を 有 す る 。NK細 胞 の 自 己 寛 容 性 はMHCク ラ スI分 子 と 抑 制 性NKレ セ プ タ ー(inhibitory natural killer receptors、 以 下iNKRs)の 結 合 に よ り 誘 導 さ れ る が 、iNKRsはT細 胞 の 一 部 の サ ブ セ ッ ト に も 発 現 し て お り 、T細 胞 上 に 発 現 し たiNKRsは 抗 原 を 介 し たT細 胞 の 細 胞 傷 害 活 性 や サ イ ト カ イ ン の 放 出 を 抑 制 さ せ る こ と で 免 疫 反 応 を 調 整 し て い る と 考 え ら れ て い る 。 し か し な が ら 、IBDの 病 態 とiNKRs発 現T細 胞 の 関 連 性 を 検 討 し た 報 告 は こ れ ま で な い 。 本 研 究 で は 、IBDに お け るiNKRsの 病 態 関 連 性 を 明 ら か に す る 目 的 で 、iNKRsの1つ で あ る NKG2A発 現T細 胞 に 関 し て 、 代 表 的 な 腸 炎 モ デ ル で あ るDextran sulfate sodium（ 以 下DSS) 腸 炎 モ デ ル マ ウ ス 及 び UC患 者 の 末 梢 血 、 腸 管 内 単 核 球 を 用 い た 解 析 を 行 っ た 。

【 材 料 と 方 法 】8〜10週 齢 の オ ス のBalb/Cマ ウ ス に 、 腸 炎 を 発 症 さ せ る た め 蒸 留 水 で 調 整 し た3％ ま た は5％ の デ キ ス ト ラ ン 硫 酸 ナ ト リ ウ ム(dextran sulfate sodium，DSS)水 溶 液 を7日 問 自 由 飲 水 さ せ た 。 コ ン 卜 ロ ー ル と し て 同 週 齢 の マ ウ ス に 通 常 の 蒸 留 水 を 飲 水 さ せ た 。 末 梢 血 単 核 球 お よ び 大 腸 の 粘 膜 固 有 層 内 単 核 球 のNKG2A+T細 胞 に つ い て 解 析 す る た め 、 末 梢 血 単 核 球 お よ び 大 腸 粘 膜 固 有 層 内 単 核 球 をDSS投 与0、7、10、14、21、28日 目 に 採 取 し フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー で 検 討 を 行 っ た 。 抗NKG2A抗 体 を 用 い た ブ ロ ッ キ ン グ に は5％DSS 経 口 投 与 の3日 前 、 当 日 、3日 後 の3時 点 で300ロgの 抗NKG2A抗 体 も し く は コ ン ト ロ ー ル と し て の 抗IgG抗 体 を マ ウ ス の 腹 腔 内 に 注 入 し 腸 管 の 組 織 学 的 検 討 を 行 っ た 。UC患 者20 例 ，CD患 者16例 お よ び 健 常 コ ン ト ロ ー ル(healthy control， 以 下HCと 略 す ）23例 よ り 末 梢 血 を 採 取 し フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー で 検 討 を 行 っ た 。 免 疫 染 色 に は 、UC6例 とCD5例 の 生 検 検 体 と 手 術 検 体 を 用 い た 。 同 様 に 、 正 常 腸 管 組 織 と し て7例 の 大 腸 癌 患 者 の 手 術 検 体 の 正常部 分を用 いた。

【 結 果 】DSS腸 炎 マ ウ ス の 炎 症 期 に お い て 、 末 梢 血 中 のNKG2A+T細 胞 は 減 少 し 、 反 対 に 腸 管 で は 増 加 し て い た 。 ま た 、DSS腸 炎 マ ウ ス に 抗NKG2A抗 体 を 投 与 す る と 腸 管 の 炎 症

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巣 が 増 加 し た 。 以 上 の 結 果 か ら 、NKG2A+T細 胞 は 腸 管 の 炎 症 部 位 に 集 積 し 、 炎 症 反 応 に 対 し 抑 制 的 に 作 用 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 ヒ トIBDお よ びHC検 体 を 用 い た 解 析 で はUC患 者 に お い て 、 臨 床 所 見 に 関 係 無 くCD患 者 や 健 常 者 に 比 べ て 末 梢 血 中 のNKG2A+T 細 胞 が 減 少 し て い た 。 ま た 、 ヒ ト 腸 管 に 分 布 す るNKG2A+T細 胞 を 検 討 し た 結 果 で は 、UC 患 者 で は 腸 管 に お い て もNKG2A+T細 胞 が 減 少 し て い た 。

【 考 察 】NKG2A+T細 胞 は 、TCR刺 激 の 閾 値 の 上 昇 、 サ イ ト カ イ ン 産 生 の 抑 制 、 細 胞 傷 害 活 性 の 減 弱 に よ りT細 胞 の 免 疫 反 応 を 調 整 す る と 考 え ら れ て い る 。 本 研 究 で は 、DSS腸 炎 マ ウ ス に お い て 腸 炎 の 炎 症 期 で は 腸 管 内NKG2A+T細 胞 の 割 合 は 増 加 し 、 炎 症 改 善 後 に は DSS投 与 前 の 程 度 ま で 減 少 す る と い うNKG2A+T細 胞 が 腸 管 局 所 で 顕 著 な 変 化 を 示 す こ と が わ か っ た 。 炎 症 期 に お け るNKG2A+T細 胞 の 増 加 に 関 し て は 、 末 梢 か ら 腸 管 にNKG2A+

T細 胞 が 移 動 す る 、 あ る い は 局 所 で の 増 殖 等 の 機 序 が 考 え ら れ る が 、 末 梢 血 に お い て は 炎 症 活 動 期 に お い てNKG2A+T細 胞 の 割 合 は 減 少 す る が 、DSS投 与 を 中 止 し 腸 炎 が 改 善 す る に っ れ 次 第 に そ の 割 合 は 上 昇 し た 。DSS腸 炎 は 腸 管 傷 害 の 急 性 期 の 簡 易 的 な モ デ ル で あ り 、 こ の よ う に 末 梢 血 及 び 腸 管 に お い てNKG2A+T細 胞 が ダ イ ナ ミ ッ ク な 変 化 を す る こ と は DSSに よ っ て 惹 起 さ れ た 粘 膜 障 害 に 対 す る 免 疫 反 応 を 反 映 し て い る 可 能 性 が あ る と 考 え ら れ る 。DSS腸 炎 マ ウ ス に 抗NKG2A抗 体 を 投 与 す る こ と で 腸 管 粘 膜 の 炎 症 巣 が 増 加 す る 傾 向 が 認 め ら れ た こ と か ら 、iNKRの 免 疫 学 的 機 能 を 考 え る と 、NKG2A+T細 胞 は 傷 害 を 受 け た 腸 管 に 集 め ら れ 、 免 疫 の 過 剰 な 反 応 か ら 生 じ る 組 織 障 害 を 防 ぐ た め に 機 能 し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ る 。 ヒ ト で は 自 己 免 疫 疾 患 、 悪 性 腫 瘍 等 に お い て 、NKG2A+T細 胞 が 病 態 に 関 わ っ て い る 報 告 が あ り 、 炎 症 調 節 機 能 を 有 す るNKG2A+T細 胞 が 低 下 す る こ と が 、 炎 症 過 剰 状 態 の 要 因 の1っ に な っ て い る こ と が 推 定 さ れ る 。 そ の 一 方 で 、NKG2A+T細 胞 の 増 加 はT細 胞 に よ る 不 完 全 な 細 胞 傷 害 活 性 を 誘 導 す る こ と に も な り 得 る と 考 え ら れ る 報 告 も 出 て い る 。 以 上 よ り 、 ヒ トNKG2A+T細 胞 は マ ウ ス と 同 様 に 免 疫 調 節 能 を 有 し 、 主 に 免 疫 応 答 を 抑 制 す る 機 能 を 有 し て い る こ と が 推 定 さ れ る 。UCに お け る 免 疫 異 常 を 考 え る 上 で 、 本 研 究 で 明 ら か に な っ た 興 味 深 い 点 は 、UC患 者 で はNKG2A+T細 胞 が 末 梢 血 の み な ら ず 炎 症 局 所 の 腸 管 粘 膜 固 有 層 に お い て も 減 少 し て ぃ た こ と で あ る 。 こ れ はDSS腸 炎 モ デ ル マ ウ ス に お い てNKG2A+T細 胞 が 炎 症 期 に 腸 管 に 集 積 し て い た 現 象 と 相 反 し て い る 。iNKRを 発 現 ・ し たT細 胞 は 免 疫 抑 制 能 が あ る こ と を 考 え る と 、 腸 管 に お い てNKG2A+T細 胞 が 減 少 す る こ と が 局 所 で の 過 剰 な 炎 症 反 応 を 誘 導 し 、UCの 病 態 に 関 与 し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ る が 確 定 に は 至 っ て お ら ず 、 今 後 の 検 討 課 題 と 考 え ら れ る 。

【 結 論 】 今 回 の 研 究 で 、DSS腸 炎 マ ウ ス に お い て 炎 症 期 に 末 梢 血 中 のNKG2A+T細 胞 の 割 合 が 減 少 し 大 腸 粘 膜 固 有 層 中 のNKG2A+T細 胞 の 割 合 が 増 加 し て い る こ と 、NKG2A+T細 胞 は 腸 炎 の 炎 症 抑 制 作 用 を 有 す る と 推 定 さ れ る こ と 、UC患 者 に お い てCD患 者 やHCと 比 較 し て 末 梢 血 、 大 腸 粘 膜 固 有 層 の NKG2A+T細 胞 の 割 合 が 減 少 し て い る こ と が 示 さ れ て た 。 こ れ ら の 結 果 か らNKG2A+T細 胞 は 過 剰 な 炎 症 反 応 を 抑 制 す る 免 疫 制 御 作 用 を 有 し て お り 、 UC患 者 で はNKG2A+T細 胞 が 減 少 し て い る た め に 適 切 な 免 疫 応 答 の 調 節 が 行 え ず 、 慢 性 ・ 持 続 性 の 腸 炎 を 発 症 し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ た 。NKG2A+T細 胞 の 炎 症 抑 制 機 能 に つ い て 検 討 を 深 め 、 更 にNKG2A+T細 胞 を 量 的 ・ 質 的 に コ ン ト ロ ー ル を す る こ と が 可 能 と な れ ば 、 、 新 た な 治 療 戦 略 に っ な が る 可 能 性 が あ る と 考 え る 。

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学位論文審査の要旨 主査 副査

副査 副査

教 授    清 教 授    坂 准教授   神 教 授    志

野研一郎 本 直 哉 山 俊 哉 田 壽 利

学 位 論 文 題 名

    Decrease of peripheral and intestinal NKG2A‑positiveT     cells in patients with ulcerative colitis

，（潰瘍性大腸炎における末梢血および大腸粘膜固有層NKG2A+T 細胞の減少）

炎症性腸疾患（inflammatry bowel disease 、以下IBD) は慢性・反復性に 腸管の炎症が生じ る病 態の こと を指し、疾 患として潰瘍性大腸炎とクローン病が含まれる。これら の疾患は 感染 や環 境、 遺伝等によ り影響を受け、腸管内病原体に対する免疫防御機能と炎 症反応の バラ ンス が崩 れることで 生じると考えられているが、その病態で知られているこ とはごく わずかである。抑制性NK レセプター（inhibitory natural killer receptors 、以下iNKRs) はT 細胞 の一 部の サブセット にも発現しており、免疫反応を調整していると考えられ ている。

本 論 文 は 、 IBD に お け る iNKRs の 病 態関 連 性を 明ら かに する 目的 で、 iNKRs の1 っで ある NKG2A 発 現 T 細 胞 に 関 し て 、 IBD の 疾 患 モ デ ル と さ れ る デ キ ス ト ラ ン 硫 酸 ナ ト リ ウ ム

（dextran sulfate sodium ，以下DSS) 腸炎マウス及びヒト潰瘍性大腸炎患者における末梢血、

腸 管 粘 膜 固 有 層 中 の NKG2A 陽 性 T 細 胞 に つ い て の 検 討 を 行 っ た もの で ある 。DSS 腸 炎マ ウ ス で の NKG2A 陽 性 T 細 胞 の 割 合 は 、末 梢 血に おい ては 腸炎 の極 期で 減少 して おり 、症 状 の 改 善 に 伴 っ て 増 加 し て い た 。 腸管 粘 膜固 有層 にお いて はNKG2A 陽 性T 細胞 は腸 炎の 極期 で増 加す るが 腸炎 改善 時に は DSS 投与 前の程度まで元に戻っていることがわ かった。

ま た 、 抗 NKG2A 抗 体 を 腹 腔 内 投 与 し DSS を 飲水 させ たマ ウス では 組織 学的 に検 討し たと ころ 、抗 IgG 抗 体を 投与 した コン トロ ール 群のマウスと比較して腸管の炎症巣の 数が多い こと がわ かっ た。また、 潰瘍性大腸炎の患者では末梢血及び腸管粘膜固有層の両 方におい て 健 常 者 、 ク ロ ー ン 病 の 患 者 と 比 較し て NKG2A 陽 性T 細 胞の 割合 が減 少し てい るこ とが わ か っ た 。 さ ら に 、 潰 瘍 性 大 腸 炎 患者 末 梢血 中の NKG2A 陽 性T 細 胞は ステ ロイ ド投 与の

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有無や腸管切除の有無、疾患活動性の有無、腸管の炎症範囲といった臨床状態に関係なく 減少していることがわかった。今回の研究で、DSS 腸炎マウスにおいて炎症期に末梢血中 の NKG2A+T 細胞の割合が減少し大腸粘膜固有層中のNKG2A+T 細胞の割合が増加してい ること、NKG2A+T 細胞は腸炎の炎症抑制作用を有すると推定されること、 UC 患者にお い て CD 患者 や HC と比 較し て末 梢血 、大 腸粘膜固有層の NKG2A+T 細胞の割合が減少し ていることが示された。これらの結果からNKG2A+T 細胞は過剰な炎症反応を抑制する免 疫制御作用を有しており、UC 患者ではNKG2A+T 細胞が減少しているために適切な免疫 応 答の 調節 が行 えず 、慢 性・ 持続 性の 腸炎 を発症 して いる 可能 性が 考えられた。

審査会では、学位論文内容の発表後、副査志田教授より TCR ッ6 陽性細胞、CD56 陽性細 胞の機能と役割について、 DSS 腸炎で他に腸炎を制御する作用を持つCD4 等の存在はある のかということ、副査坂本教授より潰瘍性大腸炎患者で疾患の寛解期と活動期の両方で NKG2A 陽性T 細胞の割合が低値であることの意味、実験対象とした潰瘍性大腸炎患者の 臨床的背景について、副査神谷准教授より対象とした潰瘍性大腸炎患者での癌罹患者の有 無、クローン病患者でNKG2A 陽性T 細胞の割合が低下しているヒトが含まれる事の意味 に つい て、 主査清野教授からは抗 NKG2A 抗体として用いた抗体はNKG2A 特異的なもの を用いたのか否か、についての質問があり、申請者は得られた研究データや文献的な知見 を引用し、概ね妥当に回答した。

この論文は、未だ解明されていなぃ潰瘍性大腸炎について疾患の病態メカニズムを明らか にする重要な手掛かりを提起したといった点で高く評価され、今後の病態解明や治療法の 開発などにっながることが期待される。

審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併 せ 申請 者が 博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと判定した。

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