( ) 役割 イ 潅 障害 け 脳虚血 後 再 流

ウ サ ギ脳 虚 血後再潅流障害^モデル におけ^る イ ^ン タ ^{ー ロ} イ キ ン^ー8(^{I L 8}) ^の役割

金 沢 大 学 医学 部 医 学 科 脳 神 経 外 科 学 講 座 ( 主 任^:LL ｢ F純 宏 教授)

松 本 哲 哉

脳 虚血後^{再 潅 流 障}害^は脳 神 経 外 科 領 域で は脳 塞 栓 な^{ら び に}脳 梗 塞 後^の血栓 溶 解 療 法に おける重 要な問 題であ り, そ^の発 生に お^いて好 中 球が重 要 な 役 割^{の 一 つ}を 担^っ て^いる と^いわ れ て^い る. 好 申 球遊 走 因子^であるインタ ^{ー ロ}イ キン^ー8(^{in te rl}e uki_n^‑8,

Ⅰし8) ^の脳 虚 血 後 再 潅 沈 降 害に おける関与 を 検 討 する た め, ウ サギ 脳 を 用^い局 所 脳 虚血後再 潅流^の実 験^モデルを作 成^{し た.} さ ら に抗Ⅰし8 抗 体に よ る再 潅 流 障害^の治 療^の可能 性 を 検 索し た. 脳 組 織ホ^モジネ^ー ト中のⅠし8 濃 度^は, 虚血側^{に て}再 潅 流後⁶ 時 間^で有意に 上昇し た^. また再 潅 流 後6時 間で は, 痛 理 組 織 学 的に好 中 球^の血管 内で^の凝 集, 血管 周 囲腔^への浸 潤が認め ら れ た^. Ⅰし8 の免疫 組織 染 色に より, 血管内 皮が Ⅰし8 を 主に産 生し て^いることが判 明 した. 抗Ⅰし8 抗 体 を 静 脈 内 投 与 す^{る と}, 梗 塞巣 を 中心^{と し たエ バ ン スブル ー の血}管 外 漏 出, す な^わち 血液 脳 間 門 O^{)lo od‑br ain ba r rie r}, B B B) ^の透 過 性^が抑制 され た^. こ のように脳 虚血後再 潅流 障害に おいて Ⅰし8 が深 く 関 与し てい る と考えら れ, 抗Ⅰし8 抗 体に よ る脳 再 海 流 障 害^の治 療^の可能性 が示 唆^{さ れ た.}

Key ^{w o r}ds c e r ebr al is che mia^‑r ep^{e r}fu sio ninj^{u r}y^{,n e u}tr Ophil_,inte rle ukin^‑8(^Ⅰし8),a nti^‑IIJ8 a ntibod_y

近 年, 脳 梗 塞 超急 性 期^の治 療 法と して, いまだ不 可 逆 的な細 胞 死に陥^っ ていな^い領域^の血流 を 再 開さ せ る 血栓 溶 解 療 法に期 待^が寄^{せ ら れ ている1 ) 2). し か し}, 血行 再 開に伴^い機 能^の回複^よ

F) む し ろ逆に更な る組 織 傷 害 ( 虚血後 再 潅 流 障 害) ^の発 生が問 題と なっ て^いる. 臨 床 的^{に は}出^血性 梗 塞^=一軒や脳 浮 腫^の増 大と し て認め ら れ る が, 血栓 溶 解 療 法 を 行^って^いな^い場 合でも血栓^の 自然 融解に続^いて起^こる^ことも ある. 再 潅 流 障 害^は脳 梗 塞^以外 にも 心 筋 梗 塞や臓 器 移 植 等で問 題となって^いる が, その病 態は

いまだ完 全に は解 明さ れ てい な^い. 虚血後 再潅 流 障害^の病 因の

一 つと し て好 中 球が重 要な役 割 を 果^{た し ている と}考 えら れ て^い る^{5 … .} 好 中 球は 血管 内 皮 細 胞と接 着し, 内 皮 細 胞に傷 害を与 えるのみ な らず, 脳 組 織 内に侵入, 椎^{々 の}細 胞 傷 害物 質を放 出 し, 脳 組 織 を 傷 害す る^ことも 明ら か にな^っ てきて^いる. ま た,

好 中 球 除 若^洲や好 中球^の血管 内皮^{へ の}接 着 阻 止^が虚血後l専権流

障害の軽 減に有 効^‖)'^{1 5 )}との報告 もな さ れて いる^.

イ^ンタ ^ー ロ イ キ ^ンー8 (^{inte rle uk in‑8}, I L 8) ^{は1) ポ}多 糖 体 (¹ⁱp^opolys a c charide, L P S) 刺 激^ヒト末 梢血単 楷 球^の培 養上清よ り 精 製さ れ た サ イ ト カ イ ^{ン1 ti)}で, 7 2偶^{の ア ミ ノ}酸^よりなり^{1 7 )},

分子 量^は約8,0 0 0 である^. Ⅰし8 は酔‑^l]球 走 化性 作 用 を 有 するのみ ならず, 好 中 球を活 性 化し リソゾ^{ー ム}酵 素^の放 出やス ^ー パ ^ー オ

キ サイドの産生誘 導^{1 8)1 9 )}, ロイ^コ ト リ^{エ ン}B 4 (1e ukotrie n e B 4,

m 4)^{2 0)21 )の}産生誘 導 など^の働 き を する.

心 筋 虚 血 後 再 潅 流 障 害^{2 2 )}, 肺 虚血後 再 潅 流 障 害^の実 験^モデ^ル

に お^いて Ⅰし8 が検 出さ れ, こと に肺 虚血後 再 潅 流 障 害で は抗

Ⅰし8 抗 体^の投 与に より 再 潅 流 障 害^が抑 制^{さ れ た2 ニー)と}報告^{さ れ て}

いる.

以上 より 脳 虚血後 再 潅 流 障 害に お^いて I L 8 が関与し て^いる か どう^か, ま^た関与し て^いる な ら ば抗Ⅰし8 抗 体投 与に より 再 連流 障 害^の治療が 可能か どうかを 検 討 する た め, ウ サ ギを 用いて脳 梗 塞^モデルを 作 成^し, 実 験 を 行^{っ た.}

対 象お よび 方 法

Ⅰ^. 実験 動 物

実 験に は体 重2.7 ^､3.O kg の ^{ニ ュ ー} ジ ^ー ラ^ンド種^の雌 性^{ウ サ ギ} (三共ラ ボ サ ^ー ビス

, 東京) ^{6 8 羽 を}用^いた^. まず 前投 薬と し て硫 酸^ア トロ ピン 岬 ^辺, 東 京) ^0.5m g を筋 肉 内 注 射し, イ^ソフ ル

ラン(^アポッ ト, ノ ^ー ス シカゴ

, 米 国) ^{3 (‰ に てマ スク}麻 酔^し た. 実 験 中^の輸 液, 薬 物^の投 与^のた め耳 介に静 脈 路を確 保し,

手 術 台^に仰 臥 位^に固 定し た^. 前 頭 部 縦切開に て気 管を露Jll後,

気 管切開に より 行3^.5m m の気管 内挿 管チ ュ ^ー ブ を約2c m 挿人 固 定^し, 人工呼 吸 器 (^{シ ナノ}製 作 所, 東 京) ^に接 続^{し た.} 人 工 呼 吸 器を接 続 する と同 時に臭 化パ ンク^ロニ ウム (^{オルガノ ン,}

ア ム ステル ダム, オ ランダ) ^2m g を 静 脈 内 投 与^{し イソ フ ルラン} 濃 度を1^.5 % と し た^. 人工呼 吸 器は, 酸 素 濃 度3 0 % , 1回 換 気 量1 5 ^､ 2 0ml/^kg, 換 気 回数 毎 分^{2 0 ､2 5}回^{と し}, PC O 2 が 3 2 ^〜 4 0m m H g となる よう 調 節^{し た.} 右 大腿動 脈 を 露 出し, 留 置 針

平 成⁸ 年1 1月29 日受付, 平 成9 年1 月9 日受理

A bbr eviatio n s: A C A, a nterio r c e r ebral a rte ry; B B B_,blo od^‑br ain b a r rie r;B S A_,b ovi n e s e ru m al bu min;I C A_,inte m al

C ar 0ti d arte ry ;I C A M

,inte r c ellular ad he sio n m ole c ule;IL^,1 ,inte rle ukin^‑1;II]8,inte rle ukin^‑8;L RA b^TmP h^{o cy te} fu n ctio n a s s o ciated a nti_ge n; u ^､,1e ukotrie n e; M C A, mid dle c e r ebr al a rte ry; O N ,Op^tic n e rv e; P B S_{, p}h o sp h^ate‑bu飴r ed s alin e; T N F_,tu m O r n e C r O Sis 血cto r

2 6 松

を 留 置し 血圧^{モ ニ}タ ^ー に接 続 して 血圧 を 持 続 的に測 定し た^. 続

いて ウ サ ギを 腹 臥 位に変 え 頭 部 を 固定し た. 補 液は 5 % 乳 酸リ ンゲル液 ( 大 塚, 東 京) を^5ml/k g/ 時 間^で行^い, 臭 化^{パ ン}ク^ロ

ニウムを 適 宜 静 注し た.

Ⅰ. 実 験^モデ^ルの作成

右 眼球 周 囲に頭 皮 切 開を 加 え, 頭 皮 を 剥 離, そして眼 球お よ び眼裔内容 物 を 摘 出^{し た.} 視 神 経 管 を^{ド リルに て}拡 大^し直 径 約 5m m の関 頭 を 行^っ た^. 硬膜を開放し右 内頚 動 脈, 中 大 脳 動 脈,

前 大 脳 動脈 を確認^し, 右 内頚 動 脈, 中大 脳 動 脈 起 始 部, 前 大 脳 動脈 起 始部 をZe n 式ク リッ プ で ク リッ ピングを 行^い, 中 大 脳 動 脈 閉 塞^{モデルと し た}( 図¹)^. 虚血中は イソ フ ル ラン の濃 度 を 調 節し て, 平 均 血 圧が 5 5 ^〜6 5m m H g となる ように し た^. 右 中大 脳 動 脈 領域^の局 所 脳 虚^血モデルとし て 以 下^の3 群^の実 験 系 を作

成し た^.

1 . 虚血 後 再 潅 流 群

ク リ^ッ ピング に て常 温2^.5時 間に わ た る右 脳 局 所 虚 血 を 開始 し た. 2^.5時 間^の虚 血^の後, ク リ ップ を解 除し再 潅 流さ せ た^. 再 潅 流 後3時 間 (⁵ 羽)^{, 6} 時 間 (⁸ 羽) ^の時 点^で実 験 を 終 了す

る亜 群^に分 けた^. 2 . 対 照 群

対 照と し て虚 血 負 荷 前^の正 常 脳 群 (⁴羽), ク リッ ピ^ング を行 わず, 血管^の剥 離^のみを 行^い, 8.5時 間 放 置^{し た}偽 手 術 群 (⁴ 羽), お よ び ク リッ ピング に て脳 虚血のみを2^.5時 間 (4 羽), 5^.5 時 間 (⁵ 羽), 8.5時 間 (^{8 羽}) ^の永 久 血 流 遮 断 群 を も う け^た.

3^. 抗Ⅰし8 抗 体 投 与群

上記と同じ脳 虚 血 後 再 海 流 実 験に お^いて, 再 潅 流 開 始^と同 時 に^マウス抗^ヒト Ⅰし8 ^{モ ノ}ク^ロー ナ^ル中和 抗 体 (^{W S‑4})^{2 4 )}を投 与 す る群 (⁸ 羽) を 作 成^{し た. 1 0m}g ^の W S^‑4 を3ml ^の生 理食 塩 水で 希 釈, 耳 静 脈 内^に注 入し た後, 6 時 間^の再 潅 流 を 施 行し た^. 対 照 実 験と し て ミ^エ ロ ^ー マ蛋白b ^{3.6.2.8.1)2 5 】10 m}g を同様^に静 注^し再 潅 流^{し た}群 (⁹ 羽) を 作 成^{し た.}

】肛^. 脳 組 織 中の Ⅰし 8 濃 度 測 定

各実 験^の終 了時 点^で塩化^{カ リ ウム5ml}を 急 速 静 注^し, ウ サ ギ を屠 殺^し, 全 脳 を^一 塊と し て摘 出し た^. 右 中大 脳 動 脈 領 域^の脳 組織 を1 5 0mg 採 取^し, リ^ン酸^{緩 衝 食 塩 水}b^{ho s}phate^‑bufEe r ed

Sal in e, P B S)b ^{H 7.2})1 5 0_FLl中^で十 分ホ^モ ジネ^ー 卜 し た^. なお,

採 取 部 位は手 術 部 位 を 除^いた. そ^の後1 0,0 0 0回 転, 5分 間 遠 心

Fig^.1^. Sche m aticdr awing ofthe e xperim e ntalpr o c edu r e^. Ze n Clipp$ W e r e applied to I C A, M C A,a nd A C A a ndthe fo c al

C e r ebr al is che mia w a s m ade^. Repe rfu$io n w a s pe rfo r m ed by r e m o val of th e clips^.

し, 上宿^のみを取 り^‑8 0℃で保存し た^.

脳 組 織ホモ ジネ ^ー ト 上清 中^のⅠし8 濃 度^の測 定は E L IS A^{21 ) 2̀i)}に て行^っ た^. ま ず ^一次抗 体と し て W S^‑4 を0^.0 5 M 炭 酸 綬 衝 液b^H

9.6) ^{に て 0.5}/^上g/ ml ^の濃 度に希 釈し, 9 6穴マイ ク^ロ タ イ タ ^ー プ レ^ー ト(^{ヌ ンク}, コ ペ ンハ ^ー ゲン, デンマ ^ー ク) ^の各穴に 1 0 0〃l ず^つ加 え4 ℃で ^一 晩イ ンキュベ ^ー ショ ンを行^{っ た. 0.0 5 % ツ}イ

ー ン2 0,

1) ン酸 綬 衝 食 塩 水 (^{tw e e n.P B S}) ^{に て 3} 度 洗 浄^{し た}後,

1 % 仔 午 血 清^{ア ル}ブ ミン O) O Vin e s eru m albumi n, B S A), リン

酸 緩 衝 食塩 水 (^{1 % B S A} , P B S)^{1 50}F^Ll を各 穴^に加 え, 3 7℃で 1 時 間イ^ンキュ ベ ^ー ショ ンを行っ た^. ツイ ^{ー ンー}P B S に て 3 度 洗 浄し た後, 0.5 % B S A, ツイ ^ー ン^ーP B S に て希 釈^{さ れ た サンプル} を 1 0 0_〃1 ず^つ 加 えた^. また毎 回Ⅰし8 濃 度^の標 準 曲線 を 作る た め, 組 換 え 型ウ サギII.^{J･8 を1 3.7 〜1 0,0 0 0p g/ml の濃 度に 0.5 %}

B S A , ツイ ^{ー ンー}P B S で希釈し, 1 0 0_/Llず^つ別^の穴に加 えた^. そ の後プ レ ^ー トを4 ℃ で ^一 晩イ^ンキ^{ュベ ー} ショ ンを 行^った. ツイ

ー ン^ーP B S に て 5 度 洗 浄し た後, 二次 抗 体と し てモ ル モ ッ ト抗 ウ サ ギ Ⅰし8 抗 体^{2 3)}を3 % ポ リ^エ チレ ング リコ ^ー ル6 0 0 0, ツイ

ー ンP B S で 1_/Ll/^{ml に}希釈し, 1 00_/Llず^つ各穴^に加 え^{3 7}℃^{で 2} 時 間イ ンキ ュベ ^ー ショ ンを 行^{った. ツイ ー ンP B S に て 5} 度 洗 浄^{し た}後, ア ルカ リフ ォ スうァ タ ^ー ゼ標 識 抗^{モ ル モ ット}免 疫^グ

ロブ リ ンG ( ^バイ オ^{マ ー} カ ^ー , エ ルサ レム_, イス ラ^{エ ル}) を 0.5 % B S A, ツイ^{ー ンー}P B S で 3 0 0 0倍^に希釈^し, 1 0 0_/Llずつを各 穴に加 え3 7℃で 2 時 間インキ^{ュベ ー} ショ ンを 行^{っ た. ツイ ー}

ン^ーP B S に て 5 度洗 浄し た後, 針^ニ ト^{ロ フユ} ニ ^ー ルリ^ン酸ニ ナ ト リ ウ^ムをジ^エ タ^{ノ ー ル}ア ミ^ンで 1m g/ml ^の濃 度に希 釈し, 1 0 0

〃1 ずつ各^{穴に加 え 室 温で3 0分 間インキュ ベー ションを 行っ た.} 反 応 を 止め る た め に 1 規 定 水 酸 化ナ ト リ ウ^ムを1 0 0_〃1 ず^つ各穴

に加 え, マ イクロプ レ ^ー ト リ ^ー ダ ^ー ( 束^{ソ ー} , 山口) に て 4 0 5n m に おけ^る吸 光 度 を 測 定^し, 標 準 曲線 を も^{と に サンプル}中

のⅠし8 濃 度 を 算 出し た^.

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2.5 brI 5.5 b∫Ⅰ 2･5 k I 8.5 bI 2^･5 brI

+ 3 brR 十6 brR

S b田I l

Fig^.2^. I L^‑8 c o nte ntsin t he ho m og^{e n ate o}f br ain tis s u e s

bg/ ml)^. Atth eindic at_edtim e, r ab b i^ts w e r e killed an d brain

t

is s u e s w e r e ha rv e Sted a nd a s s ay^ed forI し8^. T he n u mbe r s of

a nim alsfo r e a ch _gr o up ^{a r e a s}fo 1lo w s :2^.5 hrI(is che miafo r2^.5 hr) 4; 5^.5 hrI (^{is che mia fo r 5.5 hr}) 5; 2^.5 hrI + 3 hr R (is chemi afo r2^.5 hr+r epe rfu sio nfo r3 hr)5;8^,5 hrI(is che mia

f

or2^.5 hr)8;2^,5 hrI + 6 hrR (is chemi afo r2^.5 hr+r epe rfu sio n

fo r6 hり8;S h am 4^. Data a r esho w n a s更±S E M ^{. * *}p < 0^.0 5 (A N O V A wi th Sche触^'s m ultiple c o mparis o npr o c edu r e)^.