外 部 ト ル ク に よ る

外 部 ト ル ク に よ る TF1β E190D 変 異 体 の 回 転 へ の 影 響

Effect of external torque on the rotation of TF1 β E190D mutant

博 士 前 期 課 程 理 工 学 研 究 科 物 理 学 専 攻 宗 行 研 究 室 11N2100008G 河 上 知 広

1 Introduction

〈 F

は 回 転 す る モ ー タ ー 〉

私 達 は ご 飯 を 食 べ て 生 き て い る ． 食 べ た ご 飯 か ら 得 ら れ た エ ネ ル ギ ー は ATP( ア デ ノ シ ン 三 リ ン 酸 ) を 合 成 す る こ と で 蓄 え ら れ ，ATP を 加 水 分 解 し た 際 に 得 ら れ る 自 由 エ ネ ル ギ ー が 細 胞 活 動 ， 物 質 輸 送 ， 情 報 伝 達 な ど の 生 命 現 象 の 多 く に 利 用 さ れ る ． ATP は 生 命 活 動 を 営 む 上 で 必 要 不 可 欠 で あ る ．ATP は ミ ト コ ン ド リ ア の 内 膜 に あ る 膜 た ん ぱ く 質 の FoF

-ATP 合 成 酵 素 に よ っ て 膜 の 両 側 の プ ロ ト ン の 電 気 化 学 ポ テ ン シ ャ

ル 差 を 使 っ て 合 成 さ れ る (図 1 左 )． FoF1-ATP 合 成 酵 素 は Fo 部 分 と F

部 分 で 構 成 さ れ て い て ， そ の 2 つ を 簡 単 に 分 け る こ と が で き る ． そ の F1 部 分 は FoF1-ATP 合 成 酵 素 と は 逆 に ATP を ADP( ア デ ノ シ ン 二 リ ン 酸 ) と Pi(リ ン 酸 )に 加 水 分 解 す る 酵 素 と な り ， F

-ATPase と 呼 ば れ て い る ． ま た ， ATP の 加 水 分 解 に 伴 っ て 回 転 す る 世 界 最 小 の 分 子 モ ー タ ー で あ る こ と で 知 ら れ て い る (図 1 右 )． F

-ATPase( 以 下 F

)は α サ ブ ユ ニ ッ ト (以 下 α )3 つ ， ATP が 結 合 す る 触 媒 部 位 の β サ ブ ユ ニ ッ ト ( 以 下 β )3 つ ，α 3β 3 で 作 ら れ る リ ン グ を 固 定 子 に し た と き の 回 転 子 で あ る γ サ ブ ユ ニ ッ ト ( 以 下 γ )の 他 ， ε と δ サ ブ ユ ニ ッ ト で 構 成 さ れ る が ， α 3β 3γ 複 合 体 で F

の 性 質 は ほ ぼ 再 現 さ れ る の で ， 実 際 の 研 究 で は α 3β 3 γ 複 合 体 を 使 い ， 以 下 ， 本 修 士 論 文 で は F

と い え ば こ の 複 合 体 を 指 す も の と す る ．

〈 加 水 分 解 の 機 構 〉

F1 の 加 水 分 解 と 回 転 機 構 は 様 々 な 研 究 者 に よ っ て 解 き 明 か さ れ て き た ．現 在 も っ と も 有 力 な 説 を 下 に 示 す (図 2)． ま ず 空 の β に ATP が 結 合 し 120゜ 時 計 回 り に 回 っ た 位 置 の β か ら ADP が 解 離 し て γ が 80° 回 転 す る ．次 に ，120゜ 反 時 計 回 り に 回 っ た 位 置 の β に 結 合 し て い た ATP を 加 水 分 解 し Pi を 解 離 し て 40°回 転 す る ．反 時 計 回 り ， 時 計 回 り に つ い て は 図 を 確 認 の こ と ． こ れ を 3 回 繰 り 返 し ATP を 3 つ 加 水 分 解 し て 状 態 変 化 が 一 周 し 元 の 状 態 に 戻 る ． ATP が 低 濃 度 だ と ， な か な か ATP が 触 媒 部 位 に 来 な い の で ，γ の 回 転

図 1 FoF 1 -ATP 合 成 酵 素 と F 1 -ATPase

図 2 F 1 の 回 転 機 構

矢 印 は γ サ ブ ユ ニ ッ ト の 向 き ， 3 つ の ス ペ ー ス は 触 媒 部 位 で あ る β を 表 わ し て い る ．

が 停 止 し ，120°ご と に ス テ ッ プ す る よ う に 観 察 さ れ る ( 図 3)． こ の 120°は 上 記 の よ う に ATP 結 合 後 の 80° と ATP 加 水 分 解 後 の 40°

に 分 け る こ と が で き る が ATP 加 水 分 解 の 待 ち

時 間 は ～ ms と と て も 短 く ， 一 分 子 観 察 に お い て は 回 転 プ ロ ー ブ を 十 分 小 さ く し 時 間 分 解 能 を ms 以 下 に し な い と 観 察 が 難 し い ．

〈 F

の エ ネ ル ギ ー 変 換 〉

F

の 回 転 の 駆 動 力 は ATP を 加 水 分 解 で 得 ら れ る 自 由 エ ネ ル ギ ー で あ る ．先 行 研 究 で 鳥 谷 部 ら は F

が 1ATP の 加 水 分 解 に 伴 っ て 120°回 転 す る と い う 性 質 か ら ， ATP 加 水 分 解 で 得 ら れ る 自 由 エ ネ ル ギ ー は F

に よ り ど れ く ら い 力 学 的 な 仕 事 に 変 換 さ れ て て い る の か を 調 べ た ．方 法 と し て ，ま ず ， 回 転 電 場 法 を 用 い て F

に 回 転 を 妨 げ る 方 向 に 外 力 を か け る ．そ し て 平 均 回 転 速 度 が 0 に な る (F

の ト ル ク と 釣 り 合 う )ト ル ク を ス ト ー ル ト ル ク ( 最 大 ト ル ク ) と 定 義 し ，最 大 ト ル ク に よ り 120°

回 転 す る 仕 事 (最 大 仕 事 ) と 自 由 エ ネ ル ギ ー を 比 較 し た ( 図 4) ． そ の 結 果 ， 自 由 エ ネ ル ギ ー と 最 大 仕 事 は ほ ぼ 一 致 し ， F

は 自 由 エ ネ ル ギ ー と 仕 事 を ほ ぼ 100% の エ ネ ル ギ ー 変 換 効 率 で カ ッ プ リ ン グ さ せ て い る こ と を 示 し た ．さ ら に ，外 部 ト ル ク に よ っ て ATP 結 合 待 ち の 時 間 が 延 び る こ と を 報

告 し た が ATP 加 水 分 解 の 待 ち 時 間 の 延 び は 観 測 さ れ な か っ た ．

．

2 目 的

こ の 高 い 効 率 を 持 つ F

モ ー タ ー の 内 部 の ト ル ク 機 構 は 未 解 明 で あ り ， エ ネ ル ギ ー 入 出 に お け る メ カ ニ ズ ム を 知 る こ と は 大 変 重 要 な こ と で あ る ． そ こ で ， 加 水 分 解 活 性 が 100 倍 低 く な る 変 異 を い れ た β E190D 変 異 体 を 用 い て ， 効 率 が 変 化 す る か ど う か を 調 べ る ． ま た ，加 水 分 解 活 性 が 低 く な る こ と で β E190D 変 異 体 の 回 転 中 ， 加 水 分 解 の 待 ち 時 間 が 発 生 し γ が 停 止 す る の で ATP 高 濃 度 で も ス テ ッ プ が 観 察 で き る ．し た が っ て ， 先 行 研 究 で は 確 認 さ れ な か っ た ATP 加 水 分 解 の 待 ち 時 間 ( γ の 停 止 時 間 ) の ト ル ク 依 存 性 が あ る か を 調 べ る ．

図 3 ATP 低 濃 度 で は F 1 は 120°ず つ ス テ ッ プ す る

図 5 β E190D 変 異 体

こ の 変 異 体 は 触 媒 部 位 の β の C 末 端 か ら 数 え て 1 9 0 番 目 の グ ル タ ミ ン 酸 を ア ス パ ラ ギ ン 酸 に 変 異 し た も の

図 4 自 由 エ ネ ル ギ ー と 最 大 仕 事 の の 比 較

鳥 谷 部 は ス ト ー ル ト ル ク が す る 仕 事 と 自 由 エ ネ ル ギ ー を 比 較 を 行 っ た ．

3 実 験 系

〈 F

の 一 分 子 観 察 の 実 験 系 〉

ま ず ， F

を 特 異 的 な 修 飾 を 施 し た ガ ラ ス に 固 定 す る ． γ の 動 き を 知 る た め に γ の 先 端 に ポ リ ス チ レ ン の ビ ー ズ の 二 量 子 体 を つ け ， ビ ー ズ の 動 き を γ の 動 き と し て 解 析 に 用 い る (図 6)．

〈 回 転 電 場 法 〉

F

に ト ル ク を か け る 手 段 と し て 回 転 電 場 法 を 用 い た ．回 転 電 場 法 と は 4 つ の 電 極 に そ れ ぞ れ 位 相 が 90°ず つ 異 な る 電 場 を か け る と ，電 極 中 心 に あ る 誘 電 体 は 双 極 子 モ ー メ ン ト が 発 生 し 電 場 と の 遅 れ か ら 偶 力 が 発 生 し ト ル ク が か か る と い う 仕 組 み で あ る (図 7)．

4 結 果

〈 F

(変 異 な し )の 最 大 仕 事 と 自 由 エ ネ ル ギ ー の 比 較 〉

追 実 験 と し て 変 異 を 入 れ て い な い F

の 最 大 仕 事 と 自 由 エ ネ ル ギ ー の 比 較 を 行 っ た (図 8)．

F

の 回 転 を 邪 魔 す る よ う に ト ル ク を か け て い き ， 平 均 回 転 速 度 が 0 の ト ル ク を F

が 出 し う る 最 大 ト ル ク と し ， ト ル ク が 120°動 く 仕 事 と 自 由 エ ネ ル ギ ー を 比 較 ， 結 果 ， 先 行 研 究 と 同 じ よ う に 最 大 仕 事 は 自 由 エ ネ ル ギ ー と ほ ぼ 等 し く な っ た (図 8)．

図 6 一 分 子 観 察 の 実 験 系

図 7 回 転 電 場 法 の 実 験 系

図 8 F 1 ( 変 異 な し )は カ ッ プ リ ン グ 効 率 ほ ぼ 100% ．

左 図 は 平 均 回 転 速 度 と 印 加 す る ト ル ク の 関 係 平 均 回 転 速 度

0

F

〈 F

(E190D) の 最 大 仕 事 と 自 由 エ ネ ル ギ ー の 比 較 〉

加 水 分 解 活 性 が 落 ち る E190D 変 異 体 を 用 い て 変 異 な し と 同 じ よ う に 実 験 行 っ た ． 比 較 す る と 最 大 仕 事 は 自 由 エ ネ ル ギ ー を 下 回 っ た ( 図 9)． こ れ は ス ト ー ル ト ル ク の 定 義 は 平

均 回 転 速 度 が 0 に な る ト ル ク ＝ 合 成 方 向 に 回 転 す る ぎ り ぎ り の ト ル ク で あ る ． ATP を 加 水 分 解 で 得 ら れ る 自 由 エ ネ ル ギ ー は 逆 に ATP 合 成 の 為 の 必 要 な 仕 事 で あ り ， 仕 事 が 自 由 エ ネ ル ギ ー を 下 回 る こ と は ATP 合 成 を 行 わ ず し て 回 転 し て い る こ と に 他 な ら な い ． E190D 変 異 体 は カ ッ プ リ ン グ 効 率 が 悪 い 変 異 体 で あ る こ と が わ か っ た ．

〈 ATP 加 水 分 解 の 待 ち 時 間 の ト ル ク 依 存 性 〉 回 転 し て い る E190D に 回 転 を 妨 げ る 方 向 に ト ル ク を か け て い く と 回 転 速 度 は 遅 く な っ た ．こ の 原 因 は 回 転 の ト ラ ジ ェ ク ト リ の 解 析 か ら ATP 加 水 分 解 の 待 ち 時 間 が 長 く な る こ と に よ る も の で あ っ た ． し か し ， 先 行 研 究 と は 逆 に ATP 結 合 の 待 ち 時 間 は 観 測 で き ず ， 停 止 角 度 は 3 つ の ま ま と な っ た ． ト ル ク を 大 き く し て い っ て も 停 止 角 度 が ず れ な い こ と か ら ，観 察 し て い る の は 加 水 分 解 の 待 ち 時 間 由 来 の 停 止 で あ る と 考 え る の が 自 然 で あ る ． し た が っ て ， こ れ は 初 め て 加 水 分 解 の 待 ち 時 間 の ト ル ク 依 存 性 を 示 し た 結 果 に な っ た ．

5 ま と め と 今 後 の 展 望

・ 加 水 分 解 活 性 が 低 く な る E190D 変 異 体 は カ ッ プ リ ン グ 効 率 が 低 い 変 異 体 で あ る こ と を 発 見 し た ． 他 の 加 水 分 解 活 性 が 低 く な る 変 異 体 の 効 率 を 調 べ て み た い ．

・ ATP 加 水 分 解 の 待 ち 時 間 の ト ル ク 依 存 性 を 初 め て 示 し た ． ATP 低 濃 度 の 条 件 下 で E190D に ト ル ク を か け ATP 結 合 ， ATP 加 水 分 解 の 待 ち 時 間 を 両 方 観 測 で き る は ず な の で ， そ の 条 件 で 実 験 を 行 う ．

図 9 変 異 体 の 最 大 仕 事 は 自 由 エ ネ ル ギ ー を 下 回 っ た

図 10 加 水 分 解 の 待 ち 時 間 を 観 測 し た