腸 内 細 菌 叢 ― 腸 ― 脳 軸 に 着 目 し た ス ト レ ス 惹 起 性 消 化 管 機 能 異 常 の 解 析
た か じ ょ う た け し
高 城 健
(消 化 器 病 学 専 攻)
防 衛 医 科 大 学 校
平 成 ３ ０ 年 度
目 次
第 １ 章 緒 言 1
第 １ 節 ス ト レ ス と は 1
第 ２ 節 視 床 下 部 ― 下 垂 体 ― 副 腎 皮 質 軸
(h ypothal ami c-pitui tar y-adrenal axis: HPA axis ) 2 第 ３ 節 脳 腸 相 関(brai n-gut int eraction ) 2 第 ４ 節 脳 腸 相 関 と 腸 内 細 菌 の 関 係 3 第 ５ 節 う つ 病 と 腸 内 細 菌 と の 関 係 4 第 ６ 節 現 代 社 会 に お け る ス ト レ ス 4 第 ７ 節 ス ト レ ス と 過 敏 性 腸 症 候 群
(irritable bowel s yn drom e: IBS ) 5 第 ８ 節 本 検 討 に お け る 仮 説 と 目 的 5
第 ２ 章 急 性 ス ト レ ス 負 荷 動 物 モ デ ル を 用 い た 腸 内 細 菌 叢
お よ び 消 化 管 内 臓 知 覚 の 変 化 の 検 討 7
第 １ 節 目 的 7
第 ２ 節 方 法 7
第 １ 項 動 物 7
第 ２ 項 シ ャ ト ル 箱 法 に よ る ス ト レ ス 負 荷 と 行 動 試 験 8
第 ３ 項 行 動 パ タ ー ン の 定 義 8
第 ４ 項 Colorect al distension (CRD) 9
第 ５ 項 腸 内 細 菌 叢 の 解 析 10
第 ６ 項 統 計 処 理 10
第 ３ 節 結 果 10
第 １ 項 行 動 パ タ ー ン の 変 化 10
第 ２ 項 CRD の 閾 値 11
第 ３ 項 腸 内 細 菌 の 相 対 豊 富 度 11
第 ４ 項 腸 内 細 菌 叢 の 多 様 性 12
第 ４ 節 小 括 13
第 ３ 章 水 回 避 ス ト レ ス モ デ ル を 用 い た 内 臓 知 覚 過 敏 に 対 す る
糞 便 微 生 物 移 植 の 有 効 性 の 検 討 14
第 １ 節 目 的 14
第 ２ 節 方 法 14
第 １ 項 動 物 14
第 ２ 項 糞 便 微 生 物 移 植
(fecal mi crobiot a t ranspl ant ation: FMT ) 15 第 ３ 項 水 回 避 ス ト レ ス(wat er avoidance stress: WAS ) 15
第 ４ 項 CRD 15
第 ５ 項 腸 内 細 菌 叢 の 解 析 15
第 ６ 項 統 計 処 理 16
第 ３ 節 結 果 16
第 １ 項 CRD の 閾 値 の 変 化 量 16
第 ２ 項 腸 内 細 菌 の 相 対 豊 富 度 17
第 ３ 項 腸 内 細 菌 叢 の 多 様 性 17
第 ４ 項 WAS 負 荷 前 後 に お け る 腸 内 細 菌 の 変 化 17 第 ５ 項 CRD の 閾 値 の 変 化 と 腸 内 細 菌 の 変 化 の 相 関 18
第 ４ 節 小 括 18
第 ４ 章 水 回 避 ス ト レ ス モ デ ル を 用 い た 内 臓 知 覚 過 敏 に 対 す る
自 家 培 養 菌 の 有 効 性 の 検 討 19
第 １ 節 目 的 19
第 ２ 節 方 法 19
第 １ 項 動 物 19
第 ２ 項 自 家 培 養 菌 の 投 与 19
第 ３ 項 WAS 20
第 ４ 項 CRD 20
第 ５ 項 大 腸 mRNA の 抽 出 と 発 現 の 評 価 20
第 ６ 項 統 計 処 理 21
第 ３ 節 結 果 22
第 １ 項 CRD の 閾 値 の 変 化 量 22
第 ２ 項 大 腸 タ イ ト ジ ャ ン ク シ ョ ン mRNA 発 現 の 変 化 22
第 ４ 節 小 括 22
第 ５ 章 総 括 23
第 ６ 章 考 察 24
第 １ 節 急 性 ス ト レ ス 負 荷 動 物 モ デ ル に お け る 検 討 24 第 ２ 節 WAS 負 荷 IBS 動 物 モ デ ル に お け る 検 討 26
第 ７ 章 結 論 30
謝 辞 31
略 語 説 明 32
引 用 文 献 33
図 表 41
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第 １ 章 緒 言
第 １ 節 ス ト レ ス と は
現 代 社 会 は 「 ス ト レ ス 社 会 」 で あ る と 形 容 さ れ る ほ ど ， ス ト レ ス の 存 在 は 我 々 の 健 康 状 態 と 密 接 に 関 係 し て い る ． 日 本 に お い て ス ト レ ス と い う 概 念 が 認 知 さ れ 始 め た の は 1980 年 代 と 比 較 的 最 近 の こ と で あ る ．
元 来 ， ス ト レ ス と い う 単 語 は 物 理 工 学 の 分 野 で 用 い ら れ て い た も の で あ り ，「 物 体 に 外 か ら 圧 力 が 加 え ら れ た 際 に 生 じ る 歪 み 」 を 意 味 し て い た ． 医 学 領 域 に ス ト レ ス の 概 念 を 初 め て 持 ち 込 ん だ の は Cannon1 )で あ り ，1915 年 の こ と で あ る ． 彼 は イ ヌ に 吠 え ら れ た ネ コ が 興 奮 し ， 副 腎 髄 質 か ら ア ド レ ナ リ ン が 分 泌 さ れ て 自 律 神 経 系 が 興 奮 し た 結 果 ， 瞳 孔 散 大 ， 血 圧 上 昇 ， 脈 拍 数 増 加 ， 消 化 管 運 動 低 下 ， 唾 液 分 泌 低 下 な ど の 生 体 反 応 が 出 現 す る こ と を 発 見 し ， こ れ を
“fi ght-or-fli ght response” と し て 提 唱 し た ．
一 方 ， ス ト レ ス と い う 言 葉 を 医 学 領 域 で 初 め て 用 い た の は Sel ye2 ) で あ る ． 彼 は 1936 年 に 発 表 し た 論 文 の 中 で ， 外 界 か ら の 刺 激 に 対 す る 一 連 の 生 体 反 応 を “general adapt at ion s yndrom e”(汎 適 応 症 候 群 ， 以 下 GAS と 略 す)と 命 名 し ，報 告 し て い る ．こ の 発 表 が 契 機 と な っ て ス ト レ ス の 概 念 が 広 く 知 ら れ る よ う に な っ た ． こ の 時 点 で は ま だ ス ト レ ス と い う 単 語 は 用 い ら れ て い な か っ た が ，後 に S el ye は 生 体 に 加 え ら れ る 外 界 か ら の 刺 激 や 環 境 因 子 を“stressor”，刺 激 に 適 応 し よ う と し て 生 じ る 生 体 の 内 部 に 非 特 異 的 な 反 応 を “st ress” と 定 義 し た ． 現 在 で は 両 者 が 混 同 さ れ ， 両 者 と も 「 ス ト レ ス 」 と 呼 称 さ れ る こ と が 多 い ．
な お ス ト レ ス は 刺 激 の 種 類 に よ り ， 物 理 的 な も の(温 度 ， 光 ， 音 な ど)， 化 学 的 な も の(薬 物 ， 食 事 な ど)， 生 物 学 的 な も の(細 菌 ， 花 粉 な ど)， 精 神 的 な も の に 大 別 さ れ る ． 本 研 究 は ， 精 神 的 ス ト レ ス と 消 化 管 機 能 と の 関 係 に つ い て 研 究 し た も の で あ る ．
- 2 - 第 ２ 節 視 床 下 部 ― 下 垂 体 ― 副 腎 皮 質 軸
(h ypothal ami c-pitui tar y-adrenal axis: HPA axis )
Sel ye は GAS の 過 程 に お い て 副 腎 皮 質 に 変 化 が み ら れ る こ と を 発 見 し ， そ の 背 景 に は 非 特 異 的 な 神 経 内 分 泌 反 応 が 存 在 す る と 考 え た が ， こ れ こ そ が HPA axis と し て 現 在 広 く 知 ら れ て い る 概 念 の 原 点 で あ る ．HPA axis は Cannon の 提 唱 し た“fi ght-or-fli ght response”で み ら れ る 自 律 神 経 系 の 変 化 と 併 せ て ， ス ト レ ス の 病 態 生 理 の 根 幹 を 形 成 し て い る と 考 え ら れ て い る ．
生 体 が stressor に 曝 露 さ れ る と ，視 床 下 部 室 傍 核 よ り 副 腎 皮 質 刺 激 ホ ル モ ン 放 出 ホ ル モ ン(corti cotropin rel easing hormo ne: CRH )が 放 出 さ れ ，CR H は 下 垂 体 か ら の 副 腎 皮 質 刺 激 ホ ル モ ン(adrenocorti cotropi c hormone: ACTH)の 分 泌 を 促 し ，AC TH は 副 腎 皮 質 か ら の グ ル コ コ ル チ コ イ ド 分 泌 を 引 き 起 こ す ．
グ ル コ コ ル チ コ イ ド に は 糖 新 生 の 促 進 や 免 疫 反 応 の 抑 制 な ど の 作 用 が あ り ， 生 体 に と っ て 重 要 な ホ ル モ ン で あ る ． 正 常 で あ れ ば ネ ガ テ ィ ブ フ ィ ー ド バ ッ ク に よ り ，AC TH は CR H の 分 泌 を 抑 制 し ， グ ル コ コ ル チ コ イ ド は ACTH と CRH の 分 泌 を 抑 制 す る が ，stressor 曝 露 が 過 剰 に な る と ネ ガ テ ィ ブ フ ィ ー ド バ ッ ク が 破 綻 し ，HPA axis が 亢 進 し た 状 態 と な る ．HPA axis の 亢 進 が 長 期 化 す る と 生 体 が 疲 弊 す る の み な ら ず ， 海 馬 神 経 細 胞 の 萎 縮 や ア ポ ト ー シ ス 促 進 が み ら れ る よ う に な り ， 記 憶 や 学 習 能 力 の 低 下 と い っ た 高 次 脳 機 能 障 害 を 惹 起 す る 原 因 と な る 3 )．
第 ３ 節 脳 腸 相 関(brai n-gut int eraction )
ス ト レ ス の 概 念 が 提 唱 さ れ 始 め た の は 比 較 的 最 近 で は あ る も の の ，
「 腹 が 据 わ る 」，「 腸 が 煮 え く り 返 る 」，「 断 腸 の 思 い 」 な ど の 慣 用 句 に み ら れ る よ う に ， 消 化 器 と 中 枢 神 経 と の 関 連 性 は 古 来 よ り 日 本 に お い て も 注 目 さ れ て い た ．
消 化 管 と 脳 は ， 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン ， 神 経 伝 達 物 質 ， 消 化 管 ホ ル モ ン な ど を 介 し て 双 方 向 的 に 関 連 し て い る が ， そ の 概 念 は 脳 腸 相 関
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と し て 知 ら れ て い る 4 )．消 化 管 の 情 報 は 中 枢 神 経 系 を 介 し て 大 脳 に 伝 達 さ れ ， 腹 痛 や 腹 部 不 快 感 な ど の 腹 部 症 状 ， 時 に は 抑 う つ や 不 安 な ど の 情 動（ 比 較 的 急 速 に 引 き 起 こ さ れ た 一 時 的 で 急 激 な 感 情 の 動 き ） を 惹 起 す る ． ま た ， そ れ ら の 情 動 が HPA axis や 自 律 神 経 系 を 介 し て 消 化 管 へ 伝 達 さ れ る こ と に よ り ， 腹 部 症 状 が 増 悪 す る と い う 悪 循 環 を 形 成 す る こ と も あ る ．
第 ４ 節 脳 腸 相 関 と 腸 内 細 菌 の 関 係
近 年 で は 先 述 の 脳 腸 相 関 に 加 え て 中 枢 神 経 系 (central nervous system: C NS )と 腸 内 細 菌 と の 相 互 作 用 が 注 目 さ れ て お り ，こ れ ら を 包 括 し た 腸 内 細 菌 叢 ― 腸 ― 脳 軸(mi crobiota-gut -brain axis: MGB axis )と い う 概 念 も 提 唱 さ れ て い る 5 )．MGB axis の 経 路 と し て は 自 律 神 経 系 の 一 種 で あ る 腸 管 神 経 系(ent eric nervous s ystem: ENS )が 注 目 さ れ て お り ， 腸 内 細 菌 と ENS と の 関 係 に つ い て の 報 告 も み ら れ て い る ．
Sudo ら 6 )は 無 菌(germ free: GF)マ ウ ス に Bifidobacteri um infantis を 経 口 投 与 す る と ，視 床 下 部 に お い て 神 経 活 動 の マ ー カ ー で あ る c-Fos の 発 現 が 速 や か に 増 強 さ れ る こ と を 報 告 し ， さ ら に そ の 反 応 は 乳 幼 児 期 に カ プ サ イ シ ン 処 理 で 求 心 性 神 経 線 維 を 破 壊 し た GF マ ウ ス で は 認 め ら れ な い こ と ， ま た セ ロ ト ニ ン(5-h ydrox yt r ypt amine: 5 -HT)受 容 体 の 一 つ で あ る 5-HT3 受 容 体 の ア ン タ ゴ ニ ス ト ， グ ラ ニ セ ト ロ ン で 前 処 置 を 行 う と 抑 制 さ れ る こ と を 報 告 し た 7 )．こ の 結 果 は ，腸 内 細 菌 の 作 用 に よ っ て 腸 ク ロ ム 親 和 性 細 胞(ent erochrom affin cell: EC cell ) か ら 産 生 さ れ た セ ロ ト ニ ン が 求 心 性 神 経 末 端 の 5-HT3 受 容 体 に 作 用 し ， 孤 束 核 を 経 由 し て 脳 へ 情 報 を 伝 達 す る 経 路 が 重 要 で あ る こ と を 示 唆 し て い る ．
ま た ，Bravo ら 8 )は マ ウ ス に Lactobaci llus rhamnosus J B-1 株 を 経 口 投 与 す る と ス ト レ ス に よ る 不 安 ・ 抑 う つ 行 動 が 減 弱 す る が ， 迷 走 神 経 を 切 離 し た マ ウ ス で は そ の 作 用 が 認 め ら れ な い こ と を 報 告 し ，J B-l 株 に よ る 不 安 抑 制 効 果 は 迷 走 神 経 を 介 し て い る こ と を 示 し た ．
- 4 - 第 ５ 節 う つ 病 と 腸 内 細 菌 と の 関 係
う つ 病 は ス ト レ ス 関 連 精 神 疾 患 の 一 つ と し て 知 ら れ て お り ， ス ト レ ス と 関 連 の 深 い 消 化 器 疾 患 で あ る 過 敏 性 腸 症 候 群(i rritabl e bowel syndrome: IBS )と 強 い 関 連 性 を 持 つ 疾 患 で あ る た め ， 近 年 う つ 病 患 者 の 腸 内 細 菌 叢 も 注 目 さ れ る よ う に な っ て き た ． 実 際 に そ れ を 検 討 し た 報 告 も あ り ，Naseri bafrouei ら 9 )は う つ 病 患 者 に お い て Bact eroides 目 の 増 加 と Lachnospira 科 の 減 少 の 他 ，Oscillibact er と Alistipes に 強 い 関 連 性 が み ら れ た と 報 告 し ，Jiang ら 1 0 )は Enterobact er や Alistipes の 増 加 と Faecalibact erium の 減 少 が み ら れ た と 報 告 し て い る ． ま た
Maes ら 1 1 ) , 1 2 )は う つ 病 患 者 の 血 清 に 含 ま れ る 腸 内 細 菌 由 来 の 抗 LPS
抗 体 濃 度 は 健 常 人 の も の と 比 較 し て 有 意 に 高 く ， ま た そ の 血 中 濃 度 と 消 化 器 症 状 に 相 関 が み ら れ た こ と を 報 告 し て い る ．
第 ６ 節 現 代 社 会 に お け る ス ト レ ス
IT 技 術 の 発 展 や グ ロ ー バ リ ゼ ー シ ョ ン の 進 展 は 現 代 社 会 に 大 き な 恩 恵 を も た ら し た が ， 一 方 で 労 働 力 流 動 化 に よ っ て 職 場 に お け る 人 間 関 係 は 希 薄 化 し ， コ ン ピ ュ ー タ ー や ス マ ー ト フ ォ ン の 普 及 は テ ク ノ ス ト レ ス を 惹 起 す る よ う に な っ た 1 3 )． そ れ ら は 現 代 社 会 に お け る ス ト レ ス の 一 因 と な っ て い る が ， 日 本 に お い て は 特 有 の 労 働 環 境 に ま つ わ る 問 題 も み ら れ る ．
第 二 次 世 界 大 戦 後 ， 日 本 は 高 度 経 済 成 長 や バ ブ ル 景 気 を 経 て 復 興 を 成 し 遂 げ た が ， そ の 裏 で は 長 時 間 労 働 と サ ー ビ ス 残 業 を 強 い る 事 業 所 ， そ し て 労 働 者 の 過 労 死 （karoshi） が 社 会 的 問 題 と し て 浮 き 彫 り と な っ た 1 4 )． 過 労 死 の 原 因 は 心 血 管 系 イ ベ ン ト と 抑 う つ 状 態 ・ う つ 病 に 関 連 し た 自 殺 が 大 半 を 占 め る と さ れ て お り ， 近 年 は 労 働 環 境 の 改 善 以 外 に 労 働 者 の メ ン タ ル ヘ ル ス ケ ア の 重 要 性 も 注 目 さ れ て い る ．2015 年 12 月 に「 労 働 安 全 衛 生 法 」が 改 正 さ れ ，一 定 規 模 以 上 の 事 業 所 で は ス ト レ ス チ ェ ッ ク が 義 務 付 け ら れ た 1 5 )．
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第 ７ 節 ス ト レ ス と 過 敏 性 腸 症 候 群(irrit abl e bowel s yndrome: IBS ) 精 神 的 ス ト レ ス は う つ 病 や 心 的 外 傷 後 ス ト レ ス 障 害(post-traum atic stress disorder: PTS D )な ど 多 岐 に わ た る ス ト レ ス 関 連 精 神 疾 患 の 誘 因 と な る が ， そ れ ら の 疾 患 は 機 能 性 胃 腸 障 害(functional gastroint estinal disorder: FG ID )と の 関 連 性 が 指 摘 さ れ て い る ．FGID の 発 症 機 序 は 未 だ 不 明 な 点 が 多 い が ，FGID の 一 形 態 で あ る IBS に お い て は 精 神 的 ス ト レ ス が 脳 腸 相 関 に 影 響 を 与 え ， 内 臓 知 覚 過 敏 や 消 化 管 の 運 動 障 害 な ど の 機 能 異 常 が 惹 起 さ れ る こ と に よ り ， 腹 痛 ， 便 通 異 常 ， 腹 部 膨 満 感 な ど の 症 状 が 出 現 す る と 考 え ら れ て い る ．
IBS は 通 常 ，検 体 検 査 や 画 像 検 査 で 器 質 的 疾 患 を 除 外 す る こ と に よ っ て 診 断 を 行 う が ， 内 臓 知 覚 過 敏 の 有 無 を 評 価 す る バ ロ ス タ ッ ト 法 の 有 用 性 が 報 告 さ れ て い る 1 6 )． な お IBS 動 物 モ デ ル を 用 い た 実 験 に お い て も ，colorect al dist ensi on (CR D)に 対 す る 反 応 に よ っ て 内 臓 知 覚 過 敏 の 有 無 を 評 価 す る 手 法 が 広 く 行 わ れ て い る ．
ま た IBS 発 症 の 機 序 に 関 係 す る も の の 一 つ と し て 腸 内 細 菌 の 変 化 が 注 目 さ れ て い る ． 実 際 IBS の 患 者 で は 腸 内 細 菌 叢 の 構 成 が 健 常 人 と 異 な る こ と が 知 ら れ て お り 1 7 )， 実 臨 床 に お い て も プ ロ バ イ オ テ ィ ク ス に よ る IBS の 治 療 が 広 く 試 み ら れ て い る ．
一 方 ， ス ト レ ス 性 精 神 疾 患 で あ る う つ 病 や 不 安 症 の 既 往 は IBS 発 症 リ ス ク と な る こ と が 知 ら れ て お り ，IBS 患 者 は う つ 病 や 不 安 症 と の 合 併 率 が 高 い こ と も 指 摘 さ れ て い る 1 6 ) , 1 8 ) , 1 9 )．な お P TSD と IBS と の 関 連 性 を 指 摘 す る 報 告 も い く つ か み ら れ る 2 0 ) - 2 3 )．ま た IBS 患 者 に お い て 腸 内 細 菌 叢 の 変 化 が 報 告 さ れ て い る が ， 前 述 の 通 り う つ 病 患 者 に お い て も 同 様 の 報 告 が あ り ， 両 者 に 関 連 性 が み ら れ る 可 能 性 が あ る ．
第 ８ 節 本 検 討 に お け る 仮 説 と 目 的
前 述 の 通 り ， 精 神 的 ス ト レ ス と IBS と の 関 連 性 に つ い て は 広 く 知 ら れ て お り ， 脳 腸 相 関 に 着 目 し た ス ト レ ス と 消 化 管 の 関 係 は 以 前 よ り 検 討 さ れ ， 報 告 さ れ て き た ． し か し な が ら ， ス ト レ ス に よ っ て 惹
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起 さ れ た 情 動 が ど の よ う な 行 動 変 化 を 引 き 起 こ し ， ど の よ う な 消 化 器 症 状 と 腸 内 細 菌 叢 の 変 化 を 引 き 起 こ す の か ，と い っ た MGB axis の 一 連 の 流 れ を 同 時 に 直 接 検 討 し た 報 告 は な い ． ま た ， 腸 内 細 菌 叢 の 変 化 は ど の よ う に 一 連 の 病 態 に 関 連 し て い る の か は 未 だ 不 明 瞭 で あ る ．
そ こ で 今 回 我 々 は ， 精 神 的 ス ト レ ス が 行 動 変 化 や 内 臓 知 覚 過 敏 を 惹 起 す る 原 因 は 腸 内 細 菌 の 変 化 に あ る と い う 仮 説 を 立 て ， ス ト レ ス を 負 荷 し た 動 物 モ デ ル を 用 い て 検 討 を 行 う こ と と し た ．
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第 ２ 章 急 性 ス ト レ ス 負 荷 動 物 モ デ ル を 用 い た 腸 内 細 菌 叢 お よ び 消 化 管 内 臓 知 覚 の 変 化 の 検 討
第 １ 節 目 的
前 章 で 述 べ た 通 り ， ス ト レ ス 関 連 精 神 疾 患 と IBS と の 関 連 性 に つ い て は 一 般 的 に 知 ら れ て い る も の の ， あ る 個 体 に お け る 腸 内 細 菌 叢 の 変 化 が ， 行 動 変 化 と 消 化 器 症 状 の 両 方 の 原 因 に な っ て い る と い う 確 証 は な い ． そ れ を 確 認 す る に は ， 実 際 に ス ト レ ス に よ っ て 惹 起 さ れ た 情 動 が ど の よ う な 行 動 変 化 を 引 き 起 こ し ， ど の よ う な 消 化 器 症 状 と 腸 内 細 菌 叢 の 変 化 を 引 き 起 こ す の か ，と い っ た MGB axis の 一 連 の 流 れ を 同 一 の 個 体 で 同 時 に 検 討 す る 必 要 が あ る が ， こ れ ま で に そ の よ う な 報 告 は み ら れ な い ．
そ こ で 我 々 は 前 述 の 仮 説 を 基 に ， ス ト レ ス に よ る 行 動 変 化 を 検 証 す る 実 験 モ デ ル と し て 確 立 さ れ て い る ， シ ャ ト ル 箱 を 用 い た 急 性 ス ト レ ス 負 荷 動 物 モ デ ル 2 4 ) - 2 9 )を 用 い ，精 神 的 ス ト レ ス に よ り 惹 起 さ れ た 行 動 変 化 と 腸 内 細 菌 の 変 化 ， そ し て 消 化 器 症 状 と の 関 係 を 探 る べ く 実 験 を 行 う こ と と し た ． な お 当 モ デ ル は ， 本 学 の 行 動 科 学 研 究 部 門 と 精 神 科 学 講 座 で 考 案 さ れ た も の で あ る ．
第 ２ 節 方 法 第 １ 項 動 物
6 週 齢 の 雄 性 Wistar ラ ッ ト(日 本 ク レ ア ，東 京)を 使 用 し た ．ラ ッ ト は プ ラ ス チ ッ ク ケ ー ジ 1 ケ ー ジ に つ き 3 匹 ず つ の 飼 育 と し ， 飼 育 環 境 は 室 温 を 24°C，湿 度 55%と し ，12 時 間 明 暗 サ イ ク ル に 保 た れ た 環 境 下 で ，飼 料(日 本 エ ス エ ル シ ー ，東 京)お よ び 水 は 自 由 に 摂 取 さ せ た ． 入 荷 後 1 週 間 の 馴 化 期 間 を 経 た 後 ， 実 験 を 行 っ た ．
実 験 は 防 衛 医 科 大 学 校 の 動 物 実 験 倫 理 委 員 会 の 承 認 を 得 て 行 っ た(No. 15089 )． 動 物 の 扱 い は 防 衛 医 科 大 学 校 の 実 験 動 物 使 用 に 関 す る ガ イ ド ラ イ ン に 準 拠 し ， こ れ を 遵 守 し た ． 以 降 の 動 物 実 験 も 同 様 で あ る ．
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第 ２ 項 シ ャ ト ル 箱 法 に よ る ス ト レ ス 負 荷 と 行 動 試 験(図 1A, B) 一 定 の ス ト レ ッ サ ー を 動 物 に 負 荷 し た 場 合 ， 個 体 に よ っ て は 異 常 な 行 動 パ タ ー ン を 呈 す る こ と が あ る ． シ ャ ト ル 箱 法 は ス ト レ ッ サ ー と し て 電 撃 を 使 用 し ， そ の 後 の 行 動 変 化 を モ ニ タ ー す る こ と に よ り ，う つ 様 変 化 や PTS D 様 変 化 の 出 現 し た 個 体 を 区 別 す る こ と が で き る 実 験 法 で あ る ．
当 実 験 に は 既 報 と 同 様 の 動 物 モ デ ル を 使 用 し て い る ． 薄 暗 い 環 境 の 中 で 2 方 向 シ ャ ト ル 箱 型 行 動 解 析 シ ス テ ム(Med Associ ates, Inc., St. Albans, VT, US A )を 使 用 し ， ラ ッ ト に 逃 避 不 能 の 電 撃 を 0.8mA， 刺 激 時 間 15 秒 ， 待 機 時 間 15±7.5 秒 の 設 定 で 60 回(30 分) 負 荷 し ， そ の 2 週 間 後 に 行 動 観 察 を 実 施 す る ．
行 動 観 察 で は 薄 暗 い 環 境 の 中 で 同 じ シ ャ ト ル 箱 シ ス テ ム を 用 い ， 5 分 間 の 周 囲 環 境 へ の 順 応 期 を 設 け て ラ ッ ト の 自 発 運 動 量 を 測 定 し た 後 ， 回 避 ・ 逃 避 試 験 を 行 う ． 回 避 ・ 逃 避 試 験 で は ，5 秒 間 の 光 刺 激 が 呈 示 さ れ て い る 間 に シ ャ ト ル 箱 の 中 央 ゲ ー ト を 通 過 し な い 場 合 ，0.8mA の 電 撃 が 最 大 で 15 秒 負 荷 さ れ る ，と い う tri al を 待 機 時 間 15±7.5 秒 で 合 計 80 回 繰 り 返 す ．
各 tri al の 成 績 は ， 電 撃 負 荷 前 に 光 刺 激 の み に 反 応 し て 反 対 側 に 移 動 す る「 回 避 avoidance」，電 撃 に 曝 露 さ れ て か ら 移 動 す る「 逃 避 escape」， 移 動 せ ず に 電 撃 を 受 け 続 け る 「 失 敗 error」 の い ず れ か に 分 類 す る ． 最 終 的 に は ， 順 応 期 の 自 発 運 動 量 と 回 避 ・ 逃 避 試 験 の 成 績 を 総 合 し ， 行 動 パ タ ー ン を 判 定 す る ．
第 ３ 項 行 動 パ タ ー ン の 定 義
同 一 の 条 件 で 電 撃 負 荷 を 実 施 し て も 行 動 観 察 の 成 績 は 個 体 に よ っ て 異 な る が ， あ る 一 定 の 傾 向 が み ら れ る た め ， パ タ ー ン 傾 向 に よ っ て 分 類 を 行 っ た ． 回 避 ・ 逃 避 試 験 中 に 「 失 敗 」 を 10 回 以 上 示 し た 場 合 は ，う つ 病 の 動 物 モ デ ル と さ れ る learned helplessness (LH)
状 態 3 0 ) , 3 1 )と 同 様 の 特 徴 を 呈 し て い る と 考 え ら れ る た め ，LH 群 と
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し て 分 類 し た ．そ の 他 の ラ ッ ト に 関 し て は non-LH 群(以 下 NLH 群) と し て 分 類 し ， 比 較 検 討 を 行 っ た ．
ま た NLH 群 に お い て ，刺 激 の 少 な い 順 応 期 に 活 動 が 少 な く(中 央 ゲ ー ト の 通 過 が 10 回 以 下)，刺 激 の 多 い 回 避・逃 避 試 験 中 に 活 動 が 多 い(tri al 間 の ゲ ー ト 通 過 と 「 回 避 」 が 合 計 30 回 以 上)ラ ッ ト が み ら れ た ．こ れ は PTS D に 特 徴 的 な 活 動 性 と 反 応 性 の 二 方 向 性 の 行 動 変 化 を 伴 い ， 精 神 障 害 動 物 モ デ ル と し て の 表 面 妥 当 性 と 構 成 概 念 妥 当 性 を 満 た す と 捉 え る こ と が で き る た め 3 2 )， こ れ を PTS D 群 と し て 分 類 し て そ の 他 の ラ ッ ト(non-PTSD 群 ，以 下 NP T 群)と 比 較 検 討 を 行 っ た ．
第 ４ 項 Colorect al distension (CRD)
内 臓 知 覚 過 敏 の 有 無 を 評 価 す る た め ，CRD を 実 施 し た ． 前 章 で 述 べ た 通 り ， 内 臓 知 覚 過 敏 は IBS の 主 要 な 病 態 と し て 知 ら れ て お り ，CR D は IBS 動 物 モ デ ル を 用 い た 実 験 で 内 臓 知 覚 を モ ニ タ リ ン グ す る 手 段 と し て 極 め て 有 用 で あ る と 報 告 さ れ て い る 3 3 )．
装 置 は 既 報 3 4 )を 参 考 に 自 作 し た も の を 用 い た(図 2)．行 動 試 験 終 了 後 ，一 晩 絶 食 と し た ラ ッ ト に イ ソ フ ル ラ ン(和 光 純 薬 工 業 ，大 阪) 吸 入 麻 酔 を 行 い ，ERCP カ テ ー テ ル(P R-V234Q； オ リ ン パ ス ，東 京) 先 端 に ラ テ ッ ク ス 手 袋 か ら 作 成 し た 5cm 長 の バ ル ー ン を 糸 と テ ー プ で 固 定 し た も の を 経 肛 門 的 6cm に 挿 入 し ， 尾 根 部 に テ ー プ 固 定 し た ． そ の 後 ラ ッ ト を ホ ル ダ ー(KN-325-A； 夏 目 製 作 所 ， 東 京)内 に 静 置 し ， 覚 醒 後 30 分 経 過 し た 後 に CRD を 開 始 し た ．
バ ル ー ン カ テ ー テ ル に は 三 方 活 栓 で 血 圧 計 と ゴ ム 球 が 接 続 さ れ て い る ．バ ル ー ン を 秒 速 1mmHg で 緩 徐 に 加 圧 し ，ラ ッ ト の 腹 筋 が 視 覚 的 に 収 縮 を 開 始 し た 時 点 で の 圧 を 閾 値 と し た ． こ れ を ビ デ オ 録 画 と 共 に 最 低 3 回 繰 り 返 し ， 評 価 を 行 っ た ． 評 価 に 際 し て は ， 急 性 ス ト レ ス 負 荷 と 行 動 試 験 を 実 施 し て い な い ラ ッ ト(cont rol 群 ， 以 下 CON 群)と 比 較 を 行 っ た ．
- 10 - 第 ５ 項 腸 内 細 菌 叢 の 解 析
既 報 を 参 考 に 処 理 を 行 っ た 3 5 ) - 3 7 )．C RD 終 了 後 ，ラ ッ ト よ り 新 鮮 な 盲 腸 内 容 物 を 採 取 し ，採 取 後 は 速 や か に- 80 °C で 保 存 し た ．盲 腸 内 容 物 か ら Q IAam p stool mini kit (Q IAGEN, Val enci a, C A, US A )を 用 い て 腸 内 細 菌 DNA の 抽 出 を 行 っ た ．16S rRNA 遺 伝 子 の 可 変 領 域 V4 を 標 的 と し ， プ ラ イ マ ー(Forward: 515F, R everse: 806rcbc33~52 ) と TaKaRa Ex Taq (タ カ ラ バ イ オ ， 大 阪)を 用 い て 16S rR NA 遺 伝 子 領 域 を PCR 法 に よ り 増 幅 し た ．QIAquick PCR puri ficati on kit (Q IAGEN )に よ り P CR 産 物 を 精 製 し た ． 次 世 代 シ ー ケ ン サ ーMiSeq (Illumi na, Inc., S an Diego, C A, USA )を 用 い た 解 析 は 明 治(株)に 委 託 し た ．
第 ６ 項 統 計 処 理
結 果 は 平 均 値 ± 標 準 誤 差 で 示 し た ．CRD に よ る 閾 値 に つ い て は 一 元 配 置 分 散 分 析(one wa y anal ysis of variance: one wa y ANOVA )と Tuke y‒Kram er 法 を 用 い て 評 価 を 行 っ た ． 腸 内 細 菌 の 相 対 豊 富 度 に つ い て は Kruskal -Wallis 検 定 と St eel -Dwass 法 を 用 い て 評 価 を 行 っ た ． 統 計 処 理 に は JMP Pro version 12.2.0 (S AS Institut e Inc., Car y, NC, US A)を 使 用 し た ． 有 意 水 準 は 0.05 と し た ． 腸 内 細 菌 叢 の 多 様 性 に つ い て は Quantitative Insi ghts Int o Microbi al Ecology (Q IIME) を 用 い て 解 析 し た デ ー タ を 基 に 評 価 を 行 っ た ．
第 ３ 節 結 果
第 １ 項 行 動 パ タ ー ン の 変 化
14 匹 の ラ ッ ト に 対 し 急 性 ス ト レ ス 負 荷 を 実 施 し ， 行 動 試 験 を 行 っ た 結 果 ，LH を 呈 し た ラ ッ ト は 2 匹(14.3%)で あ っ た ．ま た ，P TSD 様 変 化 を 呈 し た ラ ッ ト は 7 匹(50.0% )で あ っ た ．
1 回 の プ ロ ト コ ー ル で は LH を 呈 す る ラ ッ ト が 2 匹 と 少 数 で あ っ た た め ，以 降 LH を 呈 す る ラ ッ ト が 合 計 5 匹 と な る ま で 同 一 の プ ロ ト コ ー ル を 繰 り 返 し た ．LH を 呈 し た 5 匹 を LH 群 と し ， そ の 他 の
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個 体 か ら 無 作 為 に 抽 出 し た N LH 群 10 匹(PTS D 群 5 匹 と NPT 群 5 匹)と 共 に ， 以 降 の 検 討 を 行 っ た ．
第 ２ 項 CRD の 閾 値
各 群 に お け る CRD の 閾 値 は ，LH 群 で 21.42±1.57mmHg，NLH 群 で 28.43±1.49mm Hg，CON 群 で 29.07±1.07mm Hg で あ り ，LH 群 の 閾 値 は CON 群 の そ れ と 比 較 し て 有 意 に 低 値 で あ っ た(p=0.0480, Tuke y-Kram er 法) (図 3 A)．
ま た ，NLH 群 を PTSD 群 と NPT 群 に 分 け ，CON 群 と の 比 較 検 討 も 実 施 し た が ，CR D の 閾 値 は PTSD 群 で 29.30±1.50mm Hg，NPT 群 で 26.88±3.34mmHg で あ り ， 明 ら か な 差 を 認 め な か っ た(p=0.6786, one wa y ANOVA) (図 3 B)．
第 ３ 項 腸 内 細 菌 の 相 対 豊 富 度
LH 群 ，N LH 群 ，CON 群 の 三 群 間 に お け る 腸 内 細 菌 の 相 対 豊 富 度 の 比 較 を 行 っ た と こ ろ ， 門 レ ベ ル の 解 析 で は LH 群 に お い て Actinobact eria の 相 対 豊 富 度 が C ON 群 と 比 較 し て 有 意 に 高 値 で あ っ た(1.94±0.72% vs 0.46±0.11%, p=0.0326, St eel -Dwass) (図 4 A, B)．
存 在 比 率 0.1%以 上 の 上 位 27 科 の 解 析 で は ，LH 群 に お い て Clostridi ales incert ae sedi s の 相 対 豊 富 度 が CON 群 と 比 較 し て 有 意 に 低 値 で あ っ た (15.80±1.24% vs 29.67±2.79%, p=0.0326, Steel -Dwass)．ま た LH 群 に お い て Lactobacill aceae (22.52±2.21% vs 10.90±1.07%, p=0.0326 ) ， Turi cibact eraceae (9.55±1.59% vs 3.28±0.54%, p=0.0326 ) ， P eptostrept ococcaceae (4.53±0.96% vs 2.33±0.20%, p=0.0326) ， Bi fidobacteriaceae (1.55±0.71% vs 0.24±0.05%, p=0.0326 )の 相 対 豊 富 度 が CON 群 と 比 較 し て 有 意 に 高 値 で あ っ た ．一 方 ，N LH 群 に お い て S24-7 の 相 対 豊 富 度 が CON と 比 較 し て 有 意 に 高 く (3.17±0.69% vs 1.39±0.20%, p=0.0446 ) ，
*[Mogibact eri aceae ]の 相 対 豊 富 度 が CON と 比 較 し て 有 意 に 低 値 で あ っ た(0.41±0.04% vs 0.77±0.10%, p=0.0230 ) (図 5 A, B)．
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存 在 比 率 0.1%以 上 の 上 位 28 属 の 解 析 で は ，LH 群 に お い て Clostridial es incert ae sedis の 相 対 豊 富 度 が CON 群 と 比 較 し て 有 意 に 低 値 で あ っ た (15.80±1.24% vs 29.67±2.79%, p=0.0326, Steel -Dwass)． ま た LH 群 に お い て Lact obacillus (22.50±2.20% vs 10.89±1.07%, p=0.0326 )，Turici bacter (9.55±1.59% vs 3.28±0.54%, p=0.0326 ) ， Peptostrept ococcaceae i ncert ae sedis (4.52±0.83% vs 2.33±0.20%, p=0.0326 )，Bifi dobact erium (1.55±0.71% vs 0.24±0.05%, p=0.0326 )の 相 対 豊 富 度 が CON 群 と 比 較 し て 有 意 に 高 値 で あ っ た ． 一 方 ，NLH 群 に お い て S24-7 incert ae sedis の 相 対 豊 富 度 が CON と 比 較 し て 有 意 に 高 く (3.17±0.69% vs 1.39±0.20%, p=0.0446 ) ，
* *[Mogi bact eri aceae] incertae sedis の 相 対 豊 富 度 が C ONと 比 較 し て 有 意 に 低 値 で あ っ た(0.41±0.04% vs 0.77±0.10%, p=0.0230 ) (表 1)．
次 に ，NLH 群 を PTSD 群 と NPT 群 に 分 け ，CON 群 と 三 群 間 に お け る 腸 内 細 菌 の 相 対 豊 富 度 の 比 較 を 行 っ た ． 門 レ ベ ル の 解 析 で は 明 ら か な 差 は 認 め な か っ た(図 6 A, B)．
存 在 比 率 0.1%以 上 の 上 位 27 科 の 解 析 で は ，P TSD 群 に お い て S24-7 (2.64±0.18% vs 1.39±0.20%, p=0.0326, St eel -Dwass)の 相 対 豊 富 度 が CON 群 と 比 較 し て 有 意 に 高 値 で あ っ た ．一 方 ，NPT 群 に お い て*[Mogibact eri aceae ] (0.31±0.04% vs 0.77±0.10%, p=0.0326 ) の 相 対 豊 富 度 が CON 群 と 比 較 し て 有 意 に 低 値 で あ っ た(図 7 A, B)．
存 在 比 率 0.1%以 上 の 上 位 28 属 の 解 析 で は ，P TSD 群 に お い て S24-7 incertae sedis (2.64±0.18% vs 1.39±0.20%, p=0.0326, Steel -Dwass)の 相 対 豊 富 度 が CON 群 と 比 較 し て 有 意 に 高 値 で あ っ た ． 一 方 ， NPT 群 に お い て * *[Mogibact eriaceae] incertae sedi s (0.31±0.04% vs 0.77±0.10%, p=0.0326 )の 相 対 豊 富 度 が C ON 群 と 比 較 し て 有 意 に 低 値 で あ っ た ．
第 ４ 項 腸 内 細 菌 叢 の 多 様 性
LH 群 ，N LH 群 ，CON 群 の 三 群 間 に お け る 腸 内 細 菌 叢 の 多 様 性 の 比 較 を 行 っ た ．α 多 様 性 の 評 価 で Shannon index を 比 較 し た と こ
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ろ ，LH 群 は 他 二 群 と 比 較 し て 低 い 傾 向 を 示 し た ( LH 群: 6.16±0.25, NLH 群: 6.74±0.14, CON 群: 6.79±0.19, p=0.0715, ANOVA ) (図 8 A)．
β 多 様 性 の 評 価 で 主 座 標 分 析(Pri nci pal Coordinate Anal ysi s: PCoA ) を 行 っ た と こ ろ ，LH 群 は 他 二 群 と 比 較 し て 異 な る 分 布 を 示 し た(図 8 B)． ま た 平 均 UniFrac 距 離(wei ght ed)解 析 を 行 っ た と こ ろ ，C ON 群 ―LH 群 間 の 平 均 Uni Frac 距 離 が CON 群 内 の 平 均 距 離 よ り も 有 意 に 高 く(0.18±0.01 vs 0.12±0.01, p=0.0062, St eel -Dwass)， ま た LH 群 内 の 平 均 距 離 よ り も 高 い 傾 向 を 示 し た(0.18±0.01 vs 0.14±0.01, p=0.1778) (図 8 C)．こ れ は 両 群 間 の 細 菌 叢 構 造 が 異 な る 傾 向 を 示 す こ と を 意 味 す る ．
次 に ，NLH 群 を PTSD 群 と NPT 群 に 分 け ，CON 群 と 三 群 間 に お け る 腸 内 細 菌 叢 の 多 様 性 の 比 較 を 行 っ た ．S hannon index の 比 較 で は 三 群 間 で 有 意 な 変 化 は 認 め な か っ た(PTSD 群: 6.63±0.25, NPT群: 6.87±0.14, CON 群: 6.79±0.19, p=0.6989 , ANOVA ) (図 9 A)が ，PCoA で は PTS D 群 は C ON 群 と 比 較 し て 異 な る 分 布 を 示 し た(図 9 B)．
第 ４ 節 小 括
同 一 の 急 性 ス ト レ ス 負 荷 を 実 施 し た の に も か か わ ら ず ， そ の 反 応 と し て 出 現 す る 行 動 パ タ ー ン は 個 体 に よ っ て 異 な っ て い た ．LH 群 に お い て は 内 臓 知 覚 過 敏 が 認 め ら れ た ．ま た ，特 に LH 群 に お い て は 腸 内 細 菌 叢 の 多 様 性 が 低 下 し ，特 徴 的 な 腸 内 細 菌 叢 の 構 成 が み ら れ た ．
* QIIME 解 析 時 ， Greengenes dat abase に よ り Clost ri dial es 目 Mogibact eri aceae 科 と し て 分 類 ．
** QIIME 解 析 時 ， Greengenes dat abase に よ り Clost ri dial es 目 Mogibact eri aceae 科 と し て 分 類 ， 所 属 位 置 不 明 ．
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第 ３ 章 水 回 避 ス ト レ ス モ デ ル を 用 い た 内 臓 知 覚 過 敏 に 対 す る 糞 便 微 生 物 移 植 の 有 効 性 の 検 討
第 １ 節 目 的
第 １ 章 で 述 べ た 通 り ，IBS 発 症 の 機 序 の 一 つ と し て 腸 内 細 菌 叢 の 変 化 が 注 目 さ れ て お り ，臨 床 に お い て も プ ロ バ イ オ テ ィ ク ス に よ る IBS の 治 療 が 試 み ら れ て い る ． し か し な が ら ， 実 際 に IBS に 対 す る プ ロ バ イ オ テ ィ ク ス を 用 い た 腸 内 細 菌 へ の 治 療 介 入 試 験 は 数 多 く み ら れ る も の の ， 有 効 性 が 示 さ れ た も の は Bifidobact erium3 8 ) や Lactobacillus3 9 )に 属 す る 特 定 の 単 一 菌 種 で あ っ た り ，複 数 の 菌 種 の 合
剤 4 0 ) - 4 2 )で あ っ た り ， 有 効 な 菌 種 は 一 様 で は な い ．
一 方 ，2013 年 に 再 発 性 偽 膜 性 腸 炎 に 対 す る 糞 便 微 生 物 移 植(fecal microbiot a transplantation: FMT )4 3 )の 有 効 性 が 報 告 さ れ て 以 降 ，各 種 消 化 器 疾 患 の 腸 内 細 菌 叢 に 介 入 す る 治 療 法 と し て 健 常 人 を ド ナ ー と し た FMT が 注 目 さ れ 始 め た ．IBS に 対 す る FMT の 有 効 性 を 検 討 し た 報 告 も み ら れ る が そ の 数 は わ ず か で あ り ，有 効 性 も 一 様 で は な い 4 4 ) - 4 6 )．
そ こ で 我 々 は ，動 物 実 験 モ デ ル を 用 い て IBS に 対 す る FMT の 有 効 性 を 検 討 し た ． 前 章 で 用 い た 手 法 で は 内 臓 知 覚 過 敏 を 呈 す る ラ ッ ト の 発 生 率 が 低 率 で あ っ た た め ， 本 検 討 で は IBS の 動 物 実 験 モ デ ル と し て 水 回 避 ス ト レ ス(water avoidance stress: WAS)モ デ ル を 用 い る こ と と し た ． な お ，WAS モ デ ル は 慢 性 的 な 精 神 的 ス ト レ ス 負 荷 に よ り 内 臓 知 覚 過 敏 が 惹 起 さ れ る こ と を 示 し た モ デ ル で あ り 4 7 )， 精 神 的 ス ト レ ス で 腹 痛 が 増 悪 す る IBS の 病 態 を 反 映 す る も の と さ れ て い る ．
第 ２ 節 方 法 第 １ 項 動 物
使 用 動 物 と 飼 育 環 境 に つ い て は 前 章 第 ２ 節 第 １ 項 と 同 様 で あ る ． 実 験 は 防 衛 医 科 大 学 校 の 動 物 実 験 倫 理 委 員 会 の 承 認 を 得 て 行 っ た(No. 14101 )．
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第 ２ 項 糞 便 微 生 物 移 植(fecal microbiota t ranspl ant ation: FMT ) 既 報 を 参 考 に 実 施 し た 4 8 )． 同 齢 の ス ト レ ス 負 荷 を し て い な い ラ ッ ト を ド ナ ー と し て 新 鮮 便 を 採 取 し ，- 80 ° C で 保 存 し た ．FMT 実 施 の 際 は 10倍 量 の 1% PBSを 加 え て ホ モ ジ ナ イ ズ し た 後 ，4°C，800g， 2 分 間 の 遠 心 分 離 で 得 ら れ た 上 清 を 使 用 し た ．WAS 負 荷 開 始 後 よ り イ ソ フ ル ラ ン 吸 入 麻 酔 の 上 で 経 胃 的 に 1 日 2 回 ，1 回 あ た り 1m L を 投 与 し た ．FMTを 行 う WAS +FMT群 ，WAS負 荷 を 実 施 し て 1% P BS を 1m L 経 胃 投 与 す る WAS+P BS 群 ，WAS 負 荷 を 行 わ ず 同 様 に 1%
PBS を 経 胃 投 与 す る Sham +P BS 群 の 全 3 群 で 実 験 を 行 っ た ． 本 検 討 の タ イ ム ラ イ ン を 図 10 に 示 す ．
第 ３ 項 水 回 避 ス ト レ ス(wat er avoidance stress: WAS )
入 荷 後 1 週 間 の 馴 化 期 間 を 経 た 後 ，既 報 を 参 考 に し て WAS 負 荷 を 開 始 し た 4 7 )．幅 46.5cm×奥 行 37cm ×高 さ 24cm の 透 明 な 容 器 の 中 央 に 直 径 10cm×高 さ 10cm の プ ラ ッ ト ホ ー ム を 設 置 し ， プ ラ ッ ト ホ ー ム の 頂 部 よ り 1cm 下 が 水 位 と な る よ う に 容 器 に 水 を 入 れ ， ラ ッ ト を プ ラ ッ ト ホ ー ム 上 に 1 日 1 時 間 ，10 日 間 連 続 で 放 置 し た ． 同 様 の 容 器 に 水 が な い 状 態 で ラ ッ ト を 1 日 1 時 間 ，10 日 間 連 続 で 放 置 し た も の を Sham WAS と し た ．
第 ４ 項 CRD
使 用 す る 器 具 と 詳 細 な 閾 値 の 測 定 方 法 に つ い て は 前 章 第 ２ 節 第 ４ 項 と 同 様 で あ る ． 今 回 は 時 系 列 に よ る 閾 値 の 変 化 を 評 価 し た ．
ま ず 10 日 間 の WAS 負 荷 開 始 の 前 日(da y0 )に CRD を 実 施 し ，WAS 負 荷 終 了 の 翌 日(day11 )，6 日 後(da y16 )，11 日 後(da y21 )に 再 度 CRD を 実 施 し た ．da y0 の 結 果 を 基 準 と し ， 各 々 の 結 果 か ら 差 分 で 変 化 量 を 求 め て 三 群 間 で 比 較 し た ．
第 ５ 項 腸 内 細 菌 叢 の 解 析
各 群 よ り 無 作 為 に 5 匹 ず つ 選 択 し ，WAS負 荷 開 始 前(da y0)と WAS
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負 荷 終 了 後(da y10 )に そ れ ぞ れ の 個 体 よ り 新 鮮 便 を 回 収 し ， 腸 内 細 菌 叢 の 解 析 を 行 っ た ． 使 用 試 薬 と 詳 細 な 解 析 手 法 に つ い て は 前 章 第 ２ 節 第 ５ 項 と 同 様 で あ る ．
第 ６ 項 統 計 処 理
結 果 は 平 均 値 ± 標 準 誤 差 で 示 し た ．CRD に よ る 閾 値 の 変 化 量 の 評 価 に つ い て は one wa y ANOVA と Tuke y‒Kram er 法 を 用 い て 評 価 を 行 っ た ． ま た 腸 内 細 菌 の 解 析 を 行 っ た 個 体 に 関 し て は ，WAS 負 荷 前 後 の 各 腸 内 細 菌 の 変 化 を pai red t -test，WAS 負 荷 前 後 の 各 腸 内 細 菌 の 変 化 と CR D に よ る 閾 値 の 変 化 の 関 係 を P earson の 積 率 相 関 係 数(r)を 求 め て 評 価 し た ． 腸 内 細 菌 の 相 対 豊 富 度 ， 腸 内 細 菌 叢 の 多 様 性 に つ い て は 前 章 第 ２ 節 第 ６ 項 と 同 様 で あ る ．
第 ３ 節 結 果
第 １ 項 CRD の 閾 値 の 変 化 量
WAS 負 荷 前 後 に お け る CRD の 閾 値 の 変 化 量 を 比 較 し た と こ ろ ， da y11 で は Sham +PBS 群 で 0.81± 1.11 mm Hg， WAS +PBS 群 で - 4 . 2 1 ± 0 . 8 3 m m H g，WAS+FMT 群 で 1.41±1.49 mmHg で あ っ た ． WAS+PBS 群 に お け る 閾 値 の 変 化 量 は Sham+P BS 群 と 比 較 し て 有 意 に 低 下 し て い た(p=0.0203, Tuke y-Kramer 法)が ， こ の 閾 値 低 下 の 変 化 は WAS +FMT 群 に お い て 有 意 に 改 善 し て い た(p=0.0092 ) (図 11 )．
以 降 の 閾 値 の 変 化 量 は Sham +PBS 群 の da y16 で 2.37±1.48 mmHg， da y21で 2.37±1.57 mmHg，WAS +PBS群 の da y16 で- 4 . 2 1 ± 2 . 5 5 m m H g， da y21 で- 4 . 6 7 ± 3 . 3 2 m m H g，WAS +FMT 群 の da y16 で 3.22± 1.54 mm Hg， da y21 で 1.81± 1.65 mmHg で あ っ た ． い ず れ も 有 意 差 は 認 め な か っ た も の の ，WAS +P BS 群 に お け る 閾 値 の 低 下 は WAS の 終 了 後 も 遷 延 す る 傾 向 に あ り ，WAS+FMT 群 に お い て は WAS の 終 了 後 も 閾 値 低 下 の 改 善 効 果 が 持 続 す る 傾 向 に あ っ た(p=0.1031, 0.0723, on e wa y ANOVA)．
- 17 - 第 ２ 項 腸 内 細 菌 の 相 対 豊 富 度
ま ず WAS 負 荷 前 の 三 群 間 に お け る 腸 内 細 菌 の 相 対 豊 富 度 の 比 較 を 行 っ た ．門 レ ベ ル ，WAS 負 荷 前 に お け る 存 在 比 率 0.1%以 上 の 上 位 20 科 ， 存 在 比 率 0.1%以 上 の 上 位 26 属 の い ず れ の 解 析 に お い て も 明 ら か な 有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た ．
次 に WAS 負 荷 後 の 三 群 間 に お け る 腸 内 細 菌 の 相 対 豊 富 度 の 比 較 を 行 っ た ． 門 レ ベ ル の 解 析 で は ， WAS+FMT 群 に お い て Actinobact eri a の 相 対 豊 富 度 が Sham +PBS 群 と 比 較 し て 有 意 に 高 値 を 示 し た(11.90±2.12% vs 4.13±1.14 %, p=0.0326, Steel -Dwass) (図 12 A, B)．WAS 負 荷 後 に お け る 存 在 比 率 0.1%以 上 の 上 位 21 科 の 解 析 で は ，WAS+FMT 群 に お い て Bifi dobacteriaceae の 相 対 豊 富 度 が Sham+P BS 群 と 比 較 し て 有 意 に 高 く(11.33±2.14 % vs 3.47±1.17%, p=0.0326 )， ま た WAS+P BS 群 に お い て Staph yl ococcaceae の 相 対 豊 富 度 が Sham +PBS 群 と 比 較 し て 有 意 に 低 値 を 示 し た(0.13±0.06% vs 0.01±0.00 %, p=0.0326 ) (図 13 A, B)． ま た 存 在 比 率 0.1%以 上 の 上 位 31 属 の 解 析 で は ，WAS+FMT 群 に お い て Bifidobacterium の 相 対 豊 富 度 が Sham+P BS 群 と 比 較 し て 有 意 に 高 値 を 示 し た(11.33 ±2.14%
vs 3.47±1.17%, p=0.0326 )．
第 ３ 項 腸 内 細 菌 叢 の 多 様 性
WAS 負 荷 前 の 三 群 に お い て 腸 内 細 菌 の α 多 様 性 を Shannon index で 比 較 し た が ，明 ら か な 差 は 認 め な か っ た(WAS+P BS 群: 5.16±0.12, WAS+FMT 群 : 5.42±0.12, Sham +P BS 群 : 5.16±0.13, p=0.2832 , ANOVA)．ま た WAS 負 荷 後 の 三 群 間 に つ い て も 同 様 に 比 較 し た が ， 明 ら か な 差 は 認 め な か っ た(WAS +P BS 群: 5.70±0.36, WAS+FMT 群: 5.59±0.22, Sham +P BS 群: 5.74±0.31, p=0.9335 )．
第 ４ 項 WAS 負 荷 前 後 に お け る 腸 内 細 菌 の 変 化
そ れ ぞ れ の 群 に お い て WAS 負 荷 前 後 の 各 腸 内 細 菌 の 変 化 を 比 較 し た ．WAS 負 荷 後 に お け る 存 在 比 率 0.1%以 上 の 上 位 31 属 に お い
