発酵食品由来の微生物が生産する抗菌抗真菌物質に関する研究

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(1)博士学位論文発酵食品由来の微生物が生産する抗菌抗真菌物質に関する研究. 近畿大学大学院農学研究科応用生命化学専攻. 安藤仁.

(2) 博士学位論文発酵食品由来の微生物が生産する抗菌抗真菌物質に関する研究. 平成 24 年 9 月. 近畿大学大学院農学研究科応用生命化学専攻（主査：岸本憲明教授）. 安藤仁.

(3) （和文題目）. 発酵食品由来の微生物が生産する抗菌抗真菌物質に関する研究. 近畿大学大学院農学研究科応用生命化学専攻安藤仁（主査：岸本憲明教授）（英文題目）. Antibacterial-antifungal substances produced by microorganisms isolated from fermented food. Hitoshi Ando. September, 2012. Graduate School, Kinki University Division of Agricultural Science Major: Applied Bioscience (Advisor: Prof. Noriaki Kishimoto). Submitted to the Graduate School, Kinki University, to fulfill the requirement for the Doctorate Degree..

(4) 目次緒論 ................................................................................................................................................................... 1 第 1 章発酵食品から Aspergillus brasiliensis 胞子の発芽を阻害する微生物の探索. 1-1. 緒言 ................................................................................................................................................... 4 1-2. 実験方法 ......................................................................................................................................... 4 1-2-1. 実験準備 ............................................................................................................................... 4 1-2-1-1. 供試株 .......................................................................................................................... 4 1-2-1-2. 供試試料と試薬 ...................................................................................................... 4 1-2-1-3. 培地組成 ..................................................................................................................... 4 1-2-1-4. 糸状菌胞子懸濁液の調製 .................................................................................. 7 1-2-2. 発酵食品から抗真菌活性を示す微生物の探索 ............................................... 7 1-2-2-1. 重層法による抗真菌活性を示す微生物群集の探索 ........................... 7 1-2-2-2. 重層法による抗真菌活性を示す微生物の単離 ..................................... 7 1-2-3. NP9 株の同定 ..................................................................................................................... 7 1-2-3-1. 形態観察 ..................................................................................................................... 7 1-2-3-2. 26S rRNA 遺伝子（D1/D2 領域）塩基配列の解析 ................................. 8 1-2-3-3. 生理・生化学的性状試験 .................................................................................. 9 1-2-3-4. イラン産市販カスピアンチーズから微生物の分離 ........................... 9 1-2-4. NP9 株の生産する糸状菌胞子発芽阻害物質 .................................................... 9 1-2-4-1. NP9 株培養液および培養液上清の抗真菌活性 ..................................... 9 1-2-4-1-1. 微量液体希釈法による抗真菌活性の測定 ..................................... 9 1-2-4-1-2. Agar spot 法による抗真菌活性の測定 ............................................. 9 1-2-4-2. NP9 株の生産する揮発性抗真菌物質 ....................................................... 10 1-2-4-2-1. 揮発性抗真菌物質の検出 ...................................................................... 10 1-2-4-2-2. 活性炭を用いた揮発性物質の抗真菌活性の確認 .................... 10 1-3. 結果および考察 ........................................................................................................................ 11 1-3-1. 発酵食品から抗真菌活性を示す微生物の単離 ............................................. 11 1-3-3. NP9 株の同定 ................................................................................................................... 12 1-3-3-1. 形態学的特徴 ......................................................................................................... 12.

(5) 1-3-3-2. 26S rRNA 遺伝子（D1/D2 領域）塩基配列 .............................................. 13 1-3-3-3. 生理・生化学的性状 .......................................................................................... 14 1-3-3-4. イラン産市販カスピアンチーズから微生物の分離 ......................... 15 1-3-4. Candida maltosa NP9 が生産する糸状菌胞子発芽阻害物質 ................... 16 1-4. まとめ ............................................................................................................................................ 18 第 2 章 C. maltosa NP9 が生産する揮発性抗真菌物質の抗菌抗真菌活性評価 2-1. 緒言 ................................................................................................................................................. 19 2-2. 実験方法 ....................................................................................................................................... 20 2-2-1. 実験準備 ............................................................................................................................. 20 2-2-1-1. 供試株 ........................................................................................................................ 20 2-2-1-2. 供試試薬 ................................................................................................................... 21 2-2-1-3. 培地組成 ................................................................................................................... 21 2-2-1-4. 糸状菌胞子懸濁液の調製 ................................................................................ 21 2-2-1-5. 菌体懸濁液の調製 ............................................................................................... 22 2-2-2. C. maltosa NP9 が生産する揮発性成分の同定 .............................................. 22 2-2-2-1. 固相マイクロ抽出（Solid Phase Micro Extraction: SPME）.......... 22 2-2-2-2. GC/MS 分析............................................................................................................ 22 2-2-3. Vapor-agar contact 法による C. maltosa NP9 が生産する揮発性物質の抗真菌活性 ................................................................................................................................... 23 2-2-4. 揮発性酢酸イソアミルとイソアミルアルコールの抗菌抗真菌活性 24 2-2-4-1. 揮発性酢酸イソアミルとイソアミルアルコールの抗菌抗真菌活性 ....................................................................................................................................................... 24 2-2-4-2. 揮発性酢酸イソアミルとイソアミルアルコールに曝露した被検菌の静菌殺菌試験 .................................................................................................................... 24 2-2-5. Vapor-agar contact 法における揮発性物質の気相中量の測定............. 24 2-2-5-1. SPME ........................................................................................................................... 24 2-2-5-2. GC/MS 分析............................................................................................................ 25 2-2-6. 揮発性酢酸イソアミルとイソアミルアルコールに曝露した A.. brasiliensis .......................................................................................................................................... 25.

(6) 2-2-7. 酢酸イソアミルとイソアミルアルコール類縁体の構造と抗真菌活性 ................................................................................................................................................................. 25 2-2-7-1. 揮発性酢酸イソアミル類縁体の抗真菌活性 ........................................ 25 2-2-7-2. 揮発性イソアミルアルコール類縁体の抗真菌活性 ......................... 26 2-3. 結果および考察 ........................................................................................................................ 27 2-3-1. C. maltosa NP9 が生産する揮発性物質の同定 .............................................. 27 2-3-2. C. maltosa NP9 が生産する揮発性物質の抗真菌活性 ............................... 29 2-3-3. 揮発性酢酸イソアミルとイソアミルアルコールの抗菌抗真菌スペクトル ....................................................................................................................................................... 30 2-3-4. Vapor-agar contact 法における揮発性酢酸イソアミルとイソアミルアルコールの気相中量の経時的変化 ................................................................................. 34 2-3-5. 揮発性酢酸イソアミルとイソアミルアルコールに曝露した A.. brasiliensis 胞子の走査型電子顕微鏡観察 ....................................................................... 35 2-3-6. 揮発性酢酸イソアミル類縁体の抗真菌活性と構造活性相関 ............... 39 2-3-7. 揮発性イソアミルアルコール類縁体の抗真菌活性と構造活性相関 41 2-4. まとめ ............................................................................................................................................ 42 第 3 章揮発性酢酸イソアミルが Escherichia coli の生育に与える効果 3-1. 緒言 ................................................................................................................................................. 44 3-2. 実験方法 ....................................................................................................................................... 44 3-2-1. 実験準備 ............................................................................................................................. 44 3-2-1-1. 供試株 ........................................................................................................................ 44 3-2-1-2. 供試試薬 ................................................................................................................... 44 3-2-1-3. 培地組成 ................................................................................................................... 44 3-2-1-4. 揮発性酢酸イソアミルに曝露した E. coli の調製............................ 45 3-2-2. E. coli の殺菌に要する揮発性酢酸イソアミルの曝露時間の検討 ...... 45 3-2-3. 揮発性酢酸イソアミルに曝露した E. coli の微細構造の観察............. 45 3-2-3-1. 揮発性酢酸イソアミルに曝露した E. coli の走査型電子顕微鏡観察 .................................................................................................................................................. 45 3-2-3-2. 揮発性酢酸イソアミルに曝露した E. coli の透過型電子顕微鏡.

(7) 観察 .................................................................................................................................................. 45 3-2-4. 揮発性酢酸イソアミルに曝露した E. coli の蛍光顕微鏡観察............. 46 3-3. 結果および考察 ........................................................................................................................ 48 3-3-1. E. coli の殺菌に要する揮発性酢酸イソアミルの曝露時間 ..................... 48 3-3-2. 揮発性酢酸イソアミルに曝露した E. coli の走査型電子顕微鏡観察 ................................................................................................................................................................. 48 3-3-3. 揮発性酢酸イソアミルに曝露した E. coli の透過型電子顕微鏡観察 ................................................................................................................................................................. 49 3-3-4. 揮発性酢酸イソアミルに曝露した E. coli の蛍光顕微鏡観察............. 50 3-3-4-1. 揮発性酢酸イソアミルに曝露した E. coli の膜損傷....................... 50 3-3-4-2. 揮発性酢酸イソアミルに曝露した E. coli の呼吸活性.................. 51 3-4. まとめ ............................................................................................................................................ 53 第 4 章 E. coli における揮発性酢酸イソアミル生育阻害機構の解析 4-1. 緒言 ................................................................................................................................................. 54 4-2. 実験方法 ....................................................................................................................................... 55 4-2-1. 実験準備 ............................................................................................................................. 55 4-2-1-1. 供試株 ........................................................................................................................ 55 4-2-1-2. 供試試薬 ................................................................................................................... 55 4-2-1-3. 培地組成 ................................................................................................................... 55 4-2-1-4. 揮発性酢酸イソアミルに曝露した E. coli 菌体の調製.................. 55 4-2-2. 揮発性酢酸イソアミルに曝露した E. coli からタンパク質の抽出... 55 4-2-2-1. 可溶性タンパク質の抽出 ................................................................................ 55 4-2-2-2. 膜タンパク質の抽出 .......................................................................................... 56 4-2-3. タンパク質の定量 ......................................................................................................... 56 4-2-3-1. 可溶性タンパク質画分の定量 ...................................................................... 56 4-2-3-2. 膜タンパク質画分の定量 ................................................................................ 57 4-2-4. 可溶性タンパク質および膜タンパク質の SDS-PAGE 解析 ................. 57 4-2-5. 可溶性および膜タンパク質の 2D-DIGE 解析 .............................................. 58 4-2-5-1. 可溶性および膜タンパク質の蛍光標識 .................................................. 58.

(8) 4-2-5-2. 等電点電気泳動（一次元目電気泳動） ....................................................... 58 4-2-5-3. 等電点電気泳動ゲルの平衡化 ...................................................................... 59 4-2-5-4. SDS-PAGE（二次元目電気泳動） ................................................................... 59 4-2-6. 揮発性酢酸イソアミル曝露で発現変動したタンパク質の同定 .......... 60 4-2-6-1. 二次元電気泳動ゲルからのタンパク質スポットの切り出し ..... 60 4-2-6-2. MALDI-TOF/MS によるペプチド断片の検出....................................... 60 4-2-6-3. タンパク質の同定 ............................................................................................... 61 4-2-7. E. coli 遺伝子欠損株の揮発性酢酸イソアミル感受性の評価 ................ 61 4-2-8. E. coli のエステラーゼ活性の測定 ....................................................................... 62 4-2-9. Vapor-agar contact 法による揮発性酢酸の抗菌活性................................. 62 4-3. 結果および考察 ........................................................................................................................ 63 4-3-1. SDS-PAGE による揮発性酢酸イソアミルに曝露した E. coli タンパク質の解析 ........................................................................................................................................ 63 4-3-1-1. SDS-PAGE による可溶性タンパク質の解析 ....................................... 63 4-3-1-2. SDS-PAGE による膜タンパク質の解析 ................................................. 64 4-3-2. 揮発性酢酸イソアミルに曝露した E. coli 菌体中のタンパク質の変化 ............................................................................................................................................................ 65 4-3-2-1. 2D-DIGE による可溶性タンパク質の解析............................................. 65 4-3-2-2. 2D-DIGE による膜タンパク質の解析....................................................... 66 4-3-3. 揮発性酢酸イソアミル曝露で発現量が変化したタンパク質の同定 67 4-3-3-1. 可溶性タンパク質の同定 ................................................................................ 67 4-3-3-2. 膜タンパク質の同定 .......................................................................................... 70 4-3-4. E. coli 遺伝子欠損株の揮発性酢酸イソアミルに対する感受性評価 . 78 4-3-5. E. coli のエステラーゼ活性 ...................................................................................... 79 4-3-6. 揮発性酢酸の抗菌活性 ............................................................................................... 80 4-4. まとめ ............................................................................................................................................ 82 第 5 章 E. coli における揮発性酢酸イソアミル耐性機構の解析 5-1. 緒言 ................................................................................................................................................. 83 5-2. 実験方法 ....................................................................................................................................... 83.

(9) 5-2-1. 実験準備 ............................................................................................................................. 83 5-2-1-1. 供試株 ........................................................................................................................ 83 5-2-1-2. 供試試薬 ................................................................................................................... 83 5-2-1-3. 培地組成 ................................................................................................................... 83 5-2-2. 揮発性酢酸イソアミルの E. coli に対する抗菌活性................................. 84 5-2-3. 揮発性酢酸イソアミルに曝露した E. coli 菌体の膜タンパク質の解析 ............................................................................................................................................................ 84 5-3. 結果および考察 ........................................................................................................................ 85 5-3-1. 揮発性酢酸イソアミルの E. coli に対する抗菌活性................................. 85 5-3-2. SDS-PAGE による揮発性酢酸イソアミル感受性株（NBRC 3301 株）と耐性株（IFO 3806 株）の膜タンパク質の解析............................................................ 86 5-3-3. 2D-DIGE による揮発性酢酸イソアミル感受性株（NBRC 3301 株）と耐性株（IFO 3806 株）の膜タンパク質の解析................................................................. 87 5-3-4. 揮発性酢酸イソアミル耐性株で特異的に発現する膜タンパク質の同定 ............................................................................................................................................................ 89 5-4. まとめ ............................................................................................................................................ 93 総括 ................................................................................................................................................................. 94 参考文献 ....................................................................................................................................................... 99 論文要旨 .................................................................................................................................................... 108 Summary..................................................................................................................................................... 112 論文目録 .................................................................................................................................................... 117 謝辞.

(10) 緒論時代の変化とともに私たちの生活様式も多様化し、とくに食生活においては、昼夜を問わず様々な食品や食材が消費されるようになってきた。また、それらを安定供給するための高度な衛生管理や流通、製造方法が整備されつつある。しかし、2002 年以降毎年 1,000 件以上の食中毒が発生し、患者数は年間 2 万人を超えている（1, 2）。有害微生物による汚染では、汚染糸状菌が生産するカビ毒の摂取による慢性毒性や発癌の危険性も指摘されている（3-6）。食品汚染物質の健康被害リスクは、急性毒性では微生物が最も高く、次いで植物毒、カビ毒、残留農薬の順で、慢性毒性ではカビ毒が最も高い（7）。近年、カビ毒の食品汚染問題は国際的にも注目されており、国連の食糧農業機関（FAO）/世界保健機関（WHO）合同食品添加物専門部会（JECFA）が 2010 年にカビ毒のリスク評価を行っている（8, 9）。日本の食糧自給率は 40％と低く、世界各国から食糧を輸入している。これらの中には生産地で、あるいは輸送中にカビ毒に汚染されている危険性がある。カビ毒は耐熱性が高く、加熱処理した食品にも残留することから、カビ毒を生産する有害糸状菌の制御が重要となる。一部の輸入食品にはポストハーベスト農薬を噴霧して有害糸状菌の生育を抑制しているが、より安全性の高い抗真菌剤の開発が求められている（10-12）。一方、日本では高齢化と労働人口の減少に伴う女性就労者の数が増加しているため、家庭で調理する機会が減少し、調理済食品を購入する人が増えている。また、食品の低塩化やサラダ、刺身など生鮮食品の需要が高まっている。これらの需要を支えるために、低温流通や低温保蔵施設が整備されているが、これらの条件は Listeria monocytogenes など低温性食中毒菌の増殖を容易にしている。今後、低温性食中毒菌による新たな食中毒が多発する可能性が危惧されることから、有害細菌に対する安全性の高い抗菌剤の開発も求められている（13-15）。安全で安心な有害微生物に対する制御技術のひとつとして、バイオプリザベーションが注目されている。バイオプリザベーションとは、Ray ら（16）が 1992 年に提唱したバイオプリザバティブを利用して食品を保存する、または食品汚染微生物を制御する技術である（17-19）。バイオプリザバティブとは「植物、動物および微生物起源の抗菌作用をもつ化合物で、何ら害作用もなしに食品とし 1.

(11) て、あるいは食品とともに長期間ヒトに食べられてきたもの」を言う。最も有用なバイオプリザバティブとして、発酵食品があげられる。発酵食品の有害微生物に対する安定性や抵抗性が高いことを利用すれば、食品の安全な保存技術を提供することが可能となる。バイオプリザバティブの成分として、有機酸とアルコールの他にバクテリオシンが挙げられる。バクテリオシンは生産菌に近縁な細菌に殺菌的に作用するペプチド系抗菌物質で、プロテアーゼで分解されることから高い安全性が評価されている（20-23）。 Lactococcus lactis subsp. lactis が生産するナイシン A は、日本を含む 75 ヶ国以上で保存料として認可されている（18, 19）。しかし、バクテリオシンの抗菌スペクトルは狭く、特定の細菌の生育しか抑制することができない。そこで、発酵食品から食品汚染微生物の生育を阻害する微生物を探索したところ、イラン産市販チーズから Aspergillus brasiliensis の胞子発芽を阻害する酵母を単離することに成功した。そして、単離した酵母は気相中に酢酸イソアミルとイソアミルアルコールを生産して、胞子の発芽を阻害することを見出した。酢酸イソアミルとイソアミルアルコールは、清酒酵母がもろみ中に生産する吟醸香成分で（24）、酢酸イソアミル生産量の高い清酒酵母が吟醸酒醸造用に育種されている（25-27）。しかし、揮発性酢酸イソアミルが食品汚染微生物の生育を阻害した報告はまだない。抗菌活性を示す揮発性物質として、植物由来の精油が多数研究されている（28）。また、植物内在性真菌や土壌細菌が揮発性抗真菌物質を生産して、植物病原性微生物の生育を阻害したと報告されている（29-32）。しかし、発酵食品から単離した微生物が生産する揮発性物質の抗菌活性については、ほとんど報告がない。本研究で単離した酵母が生産する酢酸イソアミルとイソアミルアルコールは、糸状菌胞子の発芽から酵母や細菌の生育まで広く阻害した。とくに Escherichia. coli は揮発性酢酸イソアミルに高い感受性を示した。揮発性酢酸イソアミルは E. coli の生育を 5 h で殺菌的に阻害し、呼吸活性を消失させ、細胞膜も損傷させた。また、揮発性酢酸イソアミルに 5 h 曝露した E. coli と、曝露していない. E. coli の可溶性および膜タンパク質を、蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動（2D-DIGE）とペプチドマスフィンガープリンティング（PMF）法で解析したところ、糖輸送や TCA 回路に関わるタンパク質の発現が変動していることを 2.

(12) 見出した。発現量が変化したタンパク質には、E. coli において酸やアルコールストレスに応答して発現が変動するタンパク質が含まれていた。また、E. coli はエステラーゼ活性を有し、生成物である揮発性酢酸とイソアミルアルコールは. E. coli に高い抗菌活性を示した。これらの結果から、揮発性酢酸イソアミルはエステラーゼによって加水分解され、生成した酢酸とイソアミルアルコールが. E. coli の生育を阻害したことが強く示唆された。最後に、E. coli の揮発性酢酸イソアミルに対する耐性機構を解析した。揮発性酢酸イソアミルに耐性を示した IFO 3806 株と感受性株 NBRC 3301 株の膜タンパク質を比較した結果、NBRC 3301 株とは異なり、IFO 3806 株で構成的に発現しているタンパク質を SDS-PAGE で見出した。次に、2D-DIGE で詳細に比較したところ、IFO 3806 株で特異的に発現している 4 つのタンパク質を見出した。これらすべてのタンパク質は外膜タンパク質 OmpA と同定した。OmpA は、外膜の構造維持や酸ストレス耐性に関与している（33-35）。揮発性酢酸イソアミルに耐性を示した IFO 3806 株で OmpA が発現していたことから、E. coli の揮発性酢酸イソアミルに対する耐性機構には OmpA が関与していることを見出した。本研究では、食品保存に応用することを目的に、発酵食品から揮発性抗菌抗真菌物質を生産する微生物を単離し、揮発性抗菌物質の同定と特性、 A.. brasiliensis 胞子の発芽阻害と E. coli への生育阻害機構と耐性機構を明らかにした。. 3.

(13) 第 1 章発酵食品から A. brasiliensis 胞子の発芽を阻害する微生物の探索 1-1. 緒言近年、消費者が求めている安全で安心な食品汚染微生物の制御技術の確立に、発酵食品を利用したバイオプリザベーションの応用が期待されている。発酵食品から単離した微生物の中から、有機酸やアルコール、バクテリオシンなどの抗菌物質を生産して、発酵食品の品質や保存性の向上に寄与する微生物が単離されている（20, 21）。乳酸菌が生産するバクテリオシンは、タンパク質分解酵素で分解されることから、高い安全性が評価されているが、抗菌スペクトルが狭く、特定の細菌の生育しか抑制できない課題を抱えている（22, 23）。本章では、食品汚染糸状菌 A. brasiliensis の胞子発芽を指標に、より広い抗菌スペクトルをもつ新たな抗真菌物質を生産する微生物を発酵食品から探索した。 1-2. 実験方法 1-2-1. 実験準備 1-2-1-1. 供試株抗真菌活性の被検菌には、Aspergillus brasiliensis NBRC 3301 を用いた。 1-2-1-2. 供試試料と試薬抗真菌活性を示す微生物の探索には、市販チーズ 15 種（国産カマンベール、フロマージュ、チェダー、オランダ産ゴーダ×3、ローファットチェダー、フランス産山羊乳、カマンベール、ニュージーランド産チェダー、ドイツ産モッツァレラ、イラン産カスピアン、イギリス産ホワイトチェダー、オーストラリア産チーズフード、イタリア産クリーム）、市販ヨーグルト 5 種、市販キムチ 5 種を用いた。特に記載の無い試薬はすべて Nacalai Tesuque Inc.（Kyoto）から購入した。 1-2-1-3. 培地組成. A. brasiliensis の培養には、Potato dextrose agar（PDA, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo, Table 1）を用いた。また、供試試料の集積培養にはスキムミルク培地（Table 2）を使用し、A. brasiliensis 胞子の重層には Malt extract soft agar（Table 3） 4.

(14) を用いた。NP9 株の培養には、Yeast extract-malt extract agar（YM, Difco Lab., Becton and Dickison Co., USA, Table 4）と Yeast extract peptone dextrose agar （YPD, Table 5）を使用した。微量液体希釈法による抗真菌活性の測定にはサブロー培地（Table 6）を使用した。市販カスピアンチーズから微生物の分離には GYP 白亜寒天培地（Table 7）を使用した。スキムミルク培地は 110℃で 15 min、残りの培地は 121℃で 20 min 高圧滅菌した。 Table 1. Potato dextrose agar. Table 2. Skim milk medium. Potato starch. 4.0 g. Skim milk. Dextrose. 2.0 g. Distilled water. Agar Distilled water. 15.0 g. 100.0 g 1000 ml pH 6.0. 1000 ml pH 5.6. Table 3. Malt extract soft agar. Table 4. Yeast extract-malt extract agar. Malt extract Agar Distilled water. 25.0 g 4.0 g 1000 ml pH 5.0. Yeast extract. 3.0 g. Malt extract. 3.0 g. Peptone. 5.0 g. Dextrose. 10.0 g. Agar. 15.0 g. Distilled water. Table 5. Yeast extract peptone. 1000 ml. Table 6. Sabouraud liquid medium. dextrose agar Yeast extract. 10.0 g. Peptone. 10.0 g. Peptone. 20.0 g. Glucose. 40.0 g. Glucose. 20.0 g. Distilled water. Agar. 15.0 g. Distilled water. 1000 ml pH 5.6. 1000 ml. 5.

(15) Table 7. GYP containing CaCO3 agar Glucose. 10.0 g. CaCO3. Yeast extract. 10.0 g. MgSO4・7H2O. 20.0 mg. Peptone. 5.0 g. MnSO4・4H2O. 10.0 mg. Meat extract. 2.0 g. FeSO4・7H2O. 10.0 mg. Na-acetate・3H2O. 2.0 g. NaCl. 10.0 mg. Tween 80. 0.5 g. Agar. 15.0 g. CaCO3. 5.0 g. Distilled water. 6. 5.0 g. 1000 ml.

(16) 1-2-1-4. 糸状菌胞子懸濁液の調製 PDA スラント培地に A. brasiliensis を植菌し、28℃で 96 h 培養した。試験管に 0.05％（v/v） Tween 80 添加 0.8％（w/v）滅菌生理食塩水を 3 ml 加え、撹拌後、綿濾過して胞子を回収した。胞子懸濁液は滅菌生理食塩水で 10 倍段階希釈し、分光光度計（UV-1200, SHIMAZU CORPORATION, Kyoto）で濁度（OD660）を測定した。また、希釈液を PDA 平板培地に塗抹し、28℃で 24 h 培養後、形成されたコロニー数をカウントして、1 ml 中の胞子数を算出した。胞子懸濁液の濁度が 1 のとき、胞子数は 4.10×106 spores/ml であった。 1-2-2. 発酵食品から抗真菌活性を示す微生物の探索 1-2-2-1. 重層法による抗真菌活性を示す微生物群集の探索スクリューコック付き試験管に入れたスキムミルク培地 5 ml に供試試料 0.05 g を添加し、28℃で 48 h 静置培養した。得られた培養液を 10 倍段階希釈し、スキムミルク平板培地に塗抹して 28℃で 48 h 培養した。コロニーが形成された平板に、 A. brasiliensis 胞子（終濃度 1.0×104 spores/ml）を加えた Malt extract soft agar 4.5 ml を重層し、28℃で 48 h 培養した。抗真菌活性の有無は、コロニー周囲に形成された A. brasiliensis の生育阻止帯で判定した。 1-2-2-2. 重層法による抗真菌活性を示す微生物の単離. A. brasiliensis の生育を強く阻害した微生物群集 O-9 培養液を 10 倍段階希釈し、スキムミルク平板培地に塗抹して 28℃で 48 h 培養した。コロニーの形成を確認した後、A. brasiliensis 胞子を添加した Malt extract soft agar 4.5 ml を重層し、28℃で 48 h 培養した。最も大きな生育阻止帯を形成したコロニーを選抜し、NP9 株と名付けた。 1-2-3. NP9 株の同定 1-2-3-1. 形態観察 NP9 株は YM 平板培地を用いて 25℃で 96 h 培養し、コロニーの形態を観察した。菌の形態と大きさは走査型電子顕微鏡で観察した。まず、培養菌体は 2.5％（v/v）グルタルアルデヒド（Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka）-リン酸バッファー（PBS, pH 7.4）溶液を用いて 6 h 前固定した。次いで、PBS で 10 min 7.

(17) ×5 回洗浄し、1％（v/v）四酸化オスミウム-PBS 溶液で 15 h 後固定した。固定した菌体は PBS で 10 min × 5 回洗浄し、 0.01 ％（ w/v ）ポリ -L- リジン（Sigma-Aldrich, Inc., USA）-PBS 溶液に浸漬した後、UV 照射下で 1 h 風乾させ、表面にポリ-L-リジンをコートしたプラスチックプレート（3×5 mm）に菌体を接着させた。その後、50、60、70、80、90、99.5％（v/v）エタノールを用いてエタノール濃度を順に上げながら 15 min 間脱水し、最後は t-ブチルアルコールで 30 min×3 回溶液を置換した後、凍結乾燥した。乾燥した試料表面にシルバーペーストを塗布し、Ion Sputter Hitachi E-1030（Hitachi, Ltd., Tokyo）で白金-パラジウムを 10 nm 蒸着した。走査型電子顕微鏡は SEM S-900（Hitachi, Ltd.）を用いた。 1-2-3-2. 26S rRNA 遺伝子（D1/D2 領域）塩基配列の解析 NP9 株の 26S rRNA 遺伝子（D1/D2 領域）を PCR 反応で増幅し、得られた DNA 断片の塩基配列を決定した。増幅方法は、O’Donnell の方法に従った（36, Table 8）。増幅した 26S rRNA 遺伝子（D1/D2 領域）断片の塩基配列を決定した。決定した塩基配列は、国際塩基配列データベース（GenBank/DDBJ/EMBL）に登録されている塩基配列に対して Blast 検索をおこない、相同性の高い菌株を検索した。高い相同性を示した菌株の塩基配列を用いて、近隣結合法により分子系統樹を作成した。 Table 8. Primers used for amplifying D1/D2 domain of the 26S rRNA gene. Primers. Sequences. NL1. 5'-. GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG. -3'. NL2. 5'-. CTCTCTTTTCAAAGTTCTTTTCATCT. -3'. NL3. 5'-. AGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAG. -3'. NL4. 5'-. GGTCCGTGTTTCAAGACGG. -3'. 8.

(18) 1-2-3-3. 生理・生化学的性状試験糖類発酵性試験、炭素源資化性試験、窒素源資化性試験、ビタミン要求性試験、温度耐性試験、薬剤耐性試験は、Barnett ら（37）および Kurtzman & Fell （38）の方法に従っておこなった。 1-2-3-4. イラン産市販カスピアンチーズから微生物の分離 NP9 株はカスピアンチーズ集積培養液から得られた。そこで、このチーズから検出される微生物の数と種類を調べた。滅菌生理食塩水 100 ml にイラン産市販カスピアンチーズ（Caspian cheese, GELA AMOL DAIRY Co., Iran） 10 g を懸濁し、超音波（GE 50 , GE Healthcare, USA, 100 V, 25 W, 4 Hz）を 1 min 間照射した後、3 min 静置する操作を 3 回おこなってチーズ懸濁液を調製した。そして、10 倍段階希釈液を GYP 白亜寒天培地に 100 l 塗抹して、28℃で 72 h 嫌気培養後、コロニーが肉眼で確認できるまで 28℃で好気培養してコロニーの種類と数を測定した。 1-2-4. NP9 株の生産する糸状菌胞子発芽阻害物質 1-2-4-1. NP9 株培養液および培養液上清の抗真菌活性 1-2-4-1-1. 微量液体希釈法による抗真菌活性の測定 NP9 株はスキムミルク培地で 28℃, 48 h 振とう培養した。培養液と培養液上清の抗真菌活性は日本化学療法学会標準法である微量液体希釈法を用いて測定した（39）。A. brasiliensis 胞子は 1.0×104 spores/ml となるようにサブロー培地に懸濁した。 1-2-4-1-2. Agar spot 法による抗真菌活性の測定. A. brasiliensis 胞子が 1.0×104 spores/ml となるように加えた PDA 平板培地を作製し、その上に NP9 株のスキムミルク培養液または培養液上清を 10 l 滴下した。抗真菌活性は 28℃で 48 h 培養後、A. brasiliensis の生育阻止帯の形成で判定した。. 9.

(19) 1-2-4-2. NP9 株の生産する揮発性抗真菌物質 1-2-4-2-1. 揮発性抗真菌物質の検出 NP9 株は YPD 平板培地に塗抹して 28℃で 48 h 培養した。フタをはずしたプレートを下段に、A. brasiliensis 胞子混釈 PDA 平板培地（1.0×104 spores/ml）を上段にして Fig. 1 のようにプレートを重ね合わせて、パラフィルム（30 cm）を巻いて固定し、28℃で 48 h インキュベートした。. Fig. 1. Antifungal activity of volatile compounds produced by strain NP9. 1-2-4-2-2. 活性炭を用いた揮発性物質の抗真菌活性の確認 NP9 株が生産する抗真菌物質が揮発性物質であることを確認するために、 NP9 株が生育した平板培地の一部を除去し、活性炭に置換して抗真菌活性を試験した（Fig. 2）。. Fig. 2. Effect of activated charcoal on the antifungal activity of volatile compounds produced by strain NP9.. 10.

(20) 1-3. 結果および考察 1-3-1. 発酵食品から抗真菌活性を示す微生物の単離供試した市販チーズ 15 種、ヨーグルト 5 種、キムチ 5 種のうち、イラン産市販カスピアンチーズを集積培養した O-9 群だけが A. brasiliensis の生育を強く阻害した（Fig. 3）。. Fig. 3. Growth inhibition of A. brasiliensis by O-9 consortium. a: Control, b: Microbial consortium O-9. O-9 群培養液をスキムミルク平板培地に塗抹して 113 コロニーを得た。113 コロニーをそれぞれスキムミルク平板培地に移植して 28℃で 48 h 培養した後、. A. brasiliensis 胞子を含む Malt extract soft agar を重層し、28℃で 48 h 培養した。113 株の中から生育阻止帯が最も大きかった NP9 株を選抜して、以降の実験に供試した。. 11.

(21) 1-3-2. NP9 株の同定 1-3-2-1. 形態学的特徴 NP9 株が YM 平板培地上に形成したコロニー（25℃, 96 h 培養）は次のような形態学的特徴をもっていた。コロニーの周縁の形状はほぼ全縁、隆起状態は扁平形、表面の形状は平滑、光沢・性状は弱い光沢があり湿性、色調は白色からクリーム色であった（Fig. 4）。. Fig. 4. Colonies of strain NP9 grown on YM agar medium. YM 平板培地に 25℃で 48 h 培養した NP9 株の栄養細胞は、楕円形から円筒形であり、多極出芽によって増殖していた（Fig. 5）。また、偽菌糸の形成が認められた。培養 1 ヶ月を経過した菌体から有性生殖器官の形成は認められなかった。. Fig. 5. Scanning electron microscope observation of strain NP9. Bar represent 3 m. 12.

(22) 1-3-2-2. 26S rRNA 遺伝子（D1/D2 領域）塩基配列 NP9 株から得られた 26S rRNA D1/D2 遺伝子の塩基配列を決定し、DDBJ に accession no. AB568327 として登録した。国際塩基配列データベースに対して Blast 検索すると、NP9 株は、Candida maltosa の基準株である NRRL Y-17677T （accession no. U45745) と 100％の相同性を示した。得られた配列をもとに作成した系統樹において、C. maltosa の基準株 NRRL Y-17677T と同一の系統岐を形成した（Fig. 6）。. Fig. 6. Phylogenetic tree of strain NP9 based on 26S rRNA D1/D2 domain sequence. 13.

(23) 1-3-2-3. 生理・生化学的性状 NP9 株は炭素源としてイノシトール、エリスリトールおよびラフィノースを資化できず、セロビオースおよびメレジトースを資化した（Table 9）。また、窒素源として硝酸塩を資化できず、また、40℃以下で生育しなかったことから、. Candida 属の生理･性状グループⅨに分類された（38）。生理・生化学的特徴において、C. maltosa 基準株はトレハロースを発酵すると報告されているが、NP9 株はトレハロース発酵性を示さなかった（38）。しかし、その他の生理・生化学的特徴は C. maltosa 基準株と一致していた（Table 9）。これら形態学、遺伝学、生理・生化学的特徴から、NP9 株は C. maltosa に帰属すると同定した。 Table 9. Physiological and biochemical properties of strain NP9. Fermentation Glucose. ＋ Galactose. － Trehalose. －. Assimilation Glucose. ＋ -Methyl-D-glucoside ＋ Xylitol. L. Galactose. ＋ Cellobiose. ＋ D-Mannitol. ＋. D-Glucosamine. ＋ Melibiose. － Galactitol. －. D-Ribose. － Lactose. － Inositol. －. D-Xylose. ＋ Raffinose. － 2-Keto-D-gluconate. ＋. L-Rhamnose. － Melezitose. ＋ DL-Lactate. W. Sucrose. ＋ Soluble starch. － Succinate. ＋. Maltose. ＋ Erythritol. － Ethanol. ＋. Nitrate. － Nitrite. － Ethylamin. ＋. L-Lysine. ＋. ＋ 10% NaCl＋5% glucose. W. － Urease. －. Resistance Growth at 37℃. ＋ 0.01% Cycloheximide. Growth at 40℃. －. Other Vitamin-free. － Starch formation. +: positive, W: weakly positive, L: latent positive, -: negative reaction.. 14.

(24) 1-3-2-4. イラン産市販カスピアンチーズから微生物の分離イラン産市販カスピアンチーズ懸濁液と希釈液を GYP 白亜寒天培地に塗抹したところ、酵母と乳酸菌、乳酸菌以外の細菌コロニーが形成された（Fig. 7）。コロニー周辺が透明になったコロニー（Fig. 7 b）は、培地中の CaCO3 （白色沈殿）を可溶性乳酸 Ca に変換したので乳酸菌と判定した。酵母と乳酸菌以外の細菌はコロニーの形態学的特徴と顕微鏡観察で判定した。. Fig. 7. Colonies formed on GYP agar plate from Iranian commercial cheese. a: Yeast, b: Lactic acid bacterium, c: Other bacterium. コロニーの比率は、乳酸菌以外の細菌（62.4％）が最も多く、次いで酵母（37.0％）、乳酸菌（0.52％）の順で、酵母は比較的高い割合で検出された。ロットの異なる市販カスピアンチーズ 8 点について微生物の種類と数を調べたところ、いずれのロットからも酵母が（5.8±0.8）×103 cfu/g 検出された。これらのコロニーから無作為に選抜した酵母は、いずれも C. maltosa と同定され、A. brasiliensis の生育を阻害した。これらの結果から、C. maltosa は市販カスピアンチーズに常在している可能性が極めて高いと考えられる。チーズの熟成に関与している酵母として Geotrichum candidum や Yarrowia. lipolytica が報告されている（40, 41）。C. maltosa NP9 もカスピアンチーズの汚染菌として分離されたのではなく、カスピアンチーズの熟成に関わっていると考えられる。. 15.

(25) 1-3-3. C. maltosa NP9 が生産する糸状菌胞子発芽阻害物質. C. maltosa NP9 コロニーに A. brasiliensis 胞子混釈培地を重層すると、生育阻止帯が形成された。また、スキムミルク培養液は微量液体希釈法や agar spot 法で高い胞子発芽阻害活性を示したが、スキムミルク培養液上清は A. brasiliensis の生育を阻害しなかった。さらに、C. maltosa NP9 が生育した平板培地のシャーレのフタを開けると強い芳香がしたことから、C. maltosa NP9 は揮発性物質を生産している可能性が高いと考えた。そこで C. maltosa NP9 の抗真菌活性を以下の方法で評価した。下段に C. maltosa NP9 を生育させた YPD 平板培地を、上段に A. brasiliensis 胞子混釈 PDA 平板培地を作製した 2 つのシャーレを重ね合わせて培養すると、. A. brasiliensis の生育は阻害された。下段が未植菌の YPD 平板培地では A. brasiliensis は生育した（Fig. 8）。. Fig. 8. Antifungal activity of volatile compounds produced by C. maltosa NP9. a: Inoculation with C. maltosa NP9, b: Non-inoculation. 次に C. maltosa NP9 が生育した平板培地の一部を除去し、空いた場所に活性炭を添加したところ、A. brasiliensis は生育した（Fig. 9）。活性炭を添加していない平板培地では、A. brasiliensis の生育は阻害されたことから、C. maltosa NP9 が生産した抗真菌物質は、活性炭に吸着される揮発性物質であることを明らかにした。 16.

(26) Fig. 9. Disappearance of antifungal activity of volatile compounds by activated charcoal. a: with activated charcoal, b: without activated charcoal. 揮発性抗真菌物質を生産する酵母として、コーヒー生豆 Coffea arabica の加工工程から Pichia anomala が、またエタノール燃料の発酵工程から. Saccharomyces cerevisiae CR-1 が単離されている（42, 43）。しかし、発酵食品から揮発性抗真菌活性物質を生産する Candida 属酵母を単離した報告は、本研究が初めてである。. P. anomala が生産する主要な揮発性抗真菌物質は酢酸フェネチルと同定されているが、S. cerevisiae CR-1 が生産する揮発性抗真菌物質は特定されていない。. P. anomala と S. cerevisiae CR-1 の培養気相からは、酢酸エチル、酢酸イソブチル、プロピオン酸エチル、エタノール、イソアミルアルコールが検出されている。C. maltosa NP9 も揮発性エステル類やアルコール類を生産している可能性が考えられる。. 17.

(27) 1-4. まとめ市販の発酵食品 3 種類 25 点から食品汚染糸状菌 A. brasiliensis の胞子発芽を阻害する微生物を探索した結果、唯一、イラン産市販カスピアンチーズから A.. brasiliensis の生育を阻害する微生物群集 O-9 を得た。O-9 群から 113 コロニーを単離し、その中から糸状菌胞子発芽阻害活性の最も高かった NP9 株を選抜した。 NP9 株の 26S rDNA D1/D2 遺伝子の塩基配列は C. maltosa と 100％の相同性を示した。また、生理・生化学的性状試験では、C. maltosa 基準株とトレハロース発酵能が異なっていたが、その他の生理・生化学的特徴は基準株と一致していたことから NP9 株を C. maltosa と同定した。ロットの異なる市販カスピアンチーズ 8 点から微生物を分離し、酵母と乳酸菌、乳酸菌以外の細菌の割合を求めたところ、酵母は 37％を占めていた。また、いずれのロットのチーズでも C. maltosa が検出され、選抜した C. maltosa はすべて A. brasiliensis の生育を阻害した。これらの結果から、C. maltosa は市販カスピアンチーズの汚染菌ではなく、常在していることを明らかにした。. C. maltosa NP9 が生産する抗真菌物質を試験した。C. maltosa NP9 コロニーに A. brasiliensis 胞子混釈培地を重層すると、生育阻止帯が形成された。また、スキムミルク培養液は微量液体希釈法で胞子発芽を阻害したが、スキムミルク培養液上清では阻害しなかった。また、C. maltosa NP9 が生育したシャーレのフタを開けると強い芳香を感じた。さらに、C. maltosa NP9 の生育した YPD 平板培地と胞子混釈 PDA 平板培地を重ね合わせて培養すると、A. brasiliensis の生育は阻害された。また、C. maltosa NP9 が生育した平板培地の一部を活性炭に置き換えると、A. brasiliensis は生育した。これらの結果から、C. maltosa NP9 が生産する抗真菌物質は揮発性物質であることを見出した。. 18.

(28) 第 2 章 C. maltosa NP9 が生産する揮発性抗真菌物質の抗菌抗真菌活性評価 2-1. 緒言第 1 章では、イラン産市販カスピアンチーズから単離した酵母 C. maltosa NP9 が揮発性抗真菌物質を生産していることを明らかにした。抗真菌物質を生産している酵母として P. anomala が揮発性酢酸フェニチルを、S. cerevisiae CR-1 もまだ特定はされていないが揮発性抗真菌物質を生産して、糸状菌の生育を阻害すると報告されている（42, 43）。本章では、まず C. maltosa NP9 が生産する揮発性物質を同定し、同定した揮発性物質の抗真菌活性を vapor-agar contact 法で評価した。そして、揮発性酢酸イソアミルとイソアミルアルコールが糸状菌胞子の発芽から酵母や細菌の生育まで幅広く阻害することを明らかにした。また、揮発性抗真菌物質に曝露した A. brasiliensis 胞子の形態と大きさを走査型電子顕微鏡で観察し、酢酸イソアミルとイソアミルアルコールは揮発性の違いから異なる発芽段階を阻害することを見出した。. 19.

(29) 2-2. 実験方法 2-2-1. 実験準備 2-2-1-1. 供試株抗菌抗真菌活性の被検菌には、糸状菌 15 種（Table 10）、酵母 5 種（Table 11）、細菌 10 種（Table 12）を用いた。 Table 10. Test fungi used in this study.. Aspergillus Aspergillus Aspergillus Aspergillus Aspergillus Penicillium Penicillium Rhizopus Rhizopus Rhizopus Mucor Mucor Mucor Botryotinia Fusarium. brasiliensis nidulans oryzae fumigatus versicolor crysogenum citrinum retlexus stolonifer javanicus hiemalis javanicus roxianus fuckeliana oxyspolum. NBRC 9455 NBRC 33017 NBRC 100959 No. 232 IAM 2027 IAM 13780 IFO 4640 IAM 6018 IAM IAM IAM IAM IAM IAM. 6021 6028 6088 6108 6131 5126. IAM 5009. Table 11. Test yeasts used in this study.. Saccharomyces Candida Pichia Zygosaccharomyces Kluyveromyces. cerevisiae albicans anomala bailii marxianus. 20. NBRC 10217T NBRC 12204 NBRC 12210 NBRC 1098T NBRC 10005T.

(30) Table 12. Test bacteria used in this study. Gram-positive. Bacillus Listeria Staphylococcus Lactobacillus Lactobacillus Pediococcus Streptococcus. subtillis denitrificans aureus plantarum brevis pentosaceus salivarius. IAM 1213. Pseudomonas Escherichia. aeruginosa coli. IAM 1514T NBRC 3301. Acetobacter. aceti. IAM 1802. JCM 11481 IFO 3060 IAM 1041 IAM 1082 IAM 12296 ATCC 9758. Gram-negative. 2-2-1-2. 供試試薬酢酸イソアミル、イソアミルアルコール、フェネチルアルコールおよび特に記載の無い試薬はすべて Nacalai Tesuque Inc. から購入した。 2-2-1-3. 培地組成. C. maltosa NP9 の培養には YPD 培地を用いた。糸状菌の培養には PDA 培地を、酵母の培養には YM 培地を、細菌の培養には普通寒天培地（ Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., Table 13）を用いた。培地は 121℃で 20 min 高圧滅菌した。 Table 13. Nutrient agar Beef extract. 5.0 g. Peptone. 10.0 g. NaCl. 5.0 g. Agar. 15.0 g. Distilled water. 1000 ml pH 7.0. 2-2-1-4. 糸状菌胞子懸濁液の調製糸状菌胞子懸濁液は、1-2-1-4 に記した方法に従って調製した。 21.

(31) 2-2-1-5. 菌体懸濁液の調製平板培地に酵母または細菌を植菌し、それぞれ 28℃と 37℃で 24 h 培養した。培養後、平板培地に生育した菌体を滅菌生理食塩水に懸濁した。菌懸濁液は滅菌生理食塩水で 10 倍段階希釈し、濁度（OD660）を測定した。また、各希釈液は平板培地に塗抹し、28℃と 37℃で 24 h 培養後、形成されたコロニー数をカウントして、1 ml 中の生菌数を算出した。菌懸濁液の濁度が 1 のとき、酵母の生菌数は 1.3×106 、細菌と乳酸球菌は 1.2×108 、乳酸桿菌は 2.9×108 cfu/ml であった。 2-2-2. C. maltosa NP9 が生産する揮発性成分の同定 2-2-2-1. 固相マイクロ抽出（Solid Phase Micro Extraction: SPME）. C. maltosa NP9 を YPD 平板培地 11 枚に塗抹して、ボール型のガラス製容器（φ 25.0 cm）にシャーレのフタをはずして入れ、アルミニウムシールで密閉後、 28℃で 48 h 培養した。 Polydimethylsiloxane (PDMS, 100 m) ファイバー（Supelco, Bellefonte, PA, USA）を容器に挿入後、28℃で 15 min 保持し、揮発性物質を吸着させた後、直ちに GC/MS 分析した。 2-2-2-2. GC/MS 分析 GC/MS 分析は Agilent 6890N Network GC (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) と JEOL JMS-K9 質量分析装置（ JEOL Ltd., Tokyo) を用い、カラムは DB-WAX キャピラリーカラム (30 m, φ 0.32 mm, 0.25 mm thickness; Agilent Technologies)を使用した。キャリアガスはヘリウムを用い、分析条件は Table 14 に記した。 GC/MS で検出されたピークは、Linear Retention Index （LRI）と National Institute of Standards and Technology （NIST）ライブラリデータベース検索を組み合わせて同定した。LRI は n-アルカン（C8-C16）を Table 14 の条件で分析して算出した（44）。. 22.

(32) Table 14. GC/MS condition for volatile compounds analysis. Inject. mode. Splitless. Inject. temp.. 220℃ (5 min). Oven temp.. Init. temp. Rate. 4℃/min. Final temp. Detect. temp. Ionization. 50℃ (5 min) 220℃ (12.5 min) 230℃. EI. 70 eV. 2-2-3. Vapor-agar contact 法による C. maltosa NP9 が生産する揮発性物質の抗真菌活性 GC/MS 分析で同定した揮発性酢酸イソアミルとイソアミルアルコールの抗真菌活性は vapor-agar contact 法で測定した（45）。ガラスシャーレ（φ 90 mm, volume 100 ml）の内に小シャーレ（φ 35 mm, 32 mm）を 2 つ設置した。1 つの小シャーレ（φ 35 mm）には PDA 培地を 4 ml 作製し、A. brasiliensis 胞子を 320 spores 植菌した。もう一方の小シャーレ（φ 32 mm）には揮発性物質を添加した。ガラスシャーレは、パラフィルムで 3 重に封をして 500 ml 容のタッパーに 1 枚ずつ入れ、28℃で 48 h 培養した。抗真菌活性は、コロニーが形成されなかったものを “”、コロニーが形成されたものを“”と判定した（Fig. 10）。コントロールには、滅菌水 20 l を使用し、実験は n = 3 でおこなった。. Fig. 10. Vapor-agar contact method. 23.

(33) 2-2-4. 揮発性酢酸イソアミルとイソアミルアルコールの抗菌抗真菌活性 2-2-4-1. 揮発性酢酸イソアミルとイソアミルアルコールの抗菌抗真菌活性揮発性酢酸イソアミルとイソアミルアルコールの糸状菌 15 種、酵母 5 種、細菌 10 種に対する抗菌抗真菌活性を vapor-agar contact 法で評価した。胞子の発芽を完全に阻害した試料の最小添加量を最小発育阻止量（minimum inhibitory dose: MID）と定義した（46）。 2-2-4-2. 揮発性酢酸イソアミルとイソアミルアルコールに曝露した被検菌の静菌殺菌試験揮発性酢酸イソアミルとイソアミルアルコール曝露で完全に生育が阻害された寒天培地から、被検菌を植菌した部分を切り取り、新しい平板培地に移植して、28℃で 48 h 培養した。培養後、コロニーが形成されなかった試料の最小添加量を最小殺菌量と定義し、被検菌が糸状菌と酵母の場合は minimum fungicidal dose (MFD)、細菌の場合では minimum bacteriocidal dose （MBD）とした（46）。 2-2-5. Vapor-agar contact 法における揮発性物質の気相中量の測定 2-2-5-1. SPME シャーレ（φ 90 mm, volume 100 ml）内に設置した小シャーレ（φ 32 mm）に酢酸イソアミルまたはイソアミルアルコールを添加し、ビニールテープで密閉後、 28℃でインキュベートした。一定時間後に PDMS ファイバーを挿入し、15 min 保持して気相成分を吸着させた後、GC/MS 分析した（Fig. 11）。実験は n = 3 でおこなった。. Fig. 11. Analysis of volatile compound in gas-phase using SPME-GC/MS analysis.. 24.

(34) 2-2-5-2. GC/MS 分析 PDMS ファイバーに吸着させた揮発性物質は GC/MS 分析に供し、ピークエリアを比較した。GC/MS 分析は、Table 14 に記した条件でおこなった。 2-2-6. 揮発性酢酸イソアミルとイソアミルアルコールに曝露した A.. brasiliensis 胞子の走査型電子顕微鏡観察 Vapor-agar contact 法を用いて A. brasiliensis 胞子を揮発性酢酸イソアミルまたはイソアミルアルコールに曝露させた。胞子を植菌した小シャーレ（φ 35 mm）を新たなシリコ栓をした三角フラスコに移し、28℃で一定時間通気培養して、胞子や培地に付着している酢酸イソアミルまたはイソアミルアルコールを除去した。その後、1-2-3-1 に記した方法で胞子を調製し、走査型電子顕微鏡で観察した。 2-2-7. 酢酸イソアミルとイソアミルアルコール類縁体の構造と抗真菌活性 2-2-7-1.揮発性酢酸イソアミル類縁体の抗真菌活性酢酸イソアミル類縁体（Table 15）の A. brasiliensis に対する抗真菌活性を vapor-agar contact 法で評価した。また、試料を添加した小シャーレを精秤し、残存した試料の重量と密度から試料の揮発量（l）を求めた。 Table 15. Isoamyl acetate analogs used in this study.. n -Heptyl acetateb. Isoamyl butyratea. Methyl acetate. n -Octyl acetateb. Isoamyl isovalerateb. Ethyl acetate. n -Nonyl acetateb. n -Isoamyl caproateb. n -Propyl acetate. n -Decyl acetateb. Isobutyl acetatec. n -Dodecyl acetateb. n –Octanea. n -Butyl acetatea. n -Hexadecyl acetatea. n –Decanea. Acetate esters. 2-Methylbutyl acetateb. Isoamyl esters. Pentyl acetate. Isoamyl formateb. n -Hexyl acetatea. Isoamyl propionateb. n -Alkanes. n -Dodecane. a. Wako Pure Chemical Industries, Ltd., b Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., Tokyo,. c. Sigma-Aldrich, Inc.. 25.

(35) 2-2-7-2. 揮発性イソアミルアルコール類縁体の抗真菌活性 Vapor-agar contact 法でイソアミルアルコール類縁体（Table 16）の A.. brasiliensis に対する抗真菌活性と試料の揮発量（l）を求めた。 Table 16. Isoamyl alcohol analogs used in this study.. n -Alcohols. 1-Pentanol. 1-Decanola. Methanol. 1-Hexanol. 1-Undecanola. Ethanolb. 1-Heptanol. 1-Dodecanola. Propanol. 1-Octanol. Butanol. 1-Nonanola. a. Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., b Yashima Pure Chemicals Co., Ltd., Osaka.. 26.

(36) 2-3. 結果および考察 2-3-1. C. maltosa NP9 が生産する揮発性物質の同定 YPD 平板培地に生育した NP9 株の気相中の成分を SPME-GC/MS 分析したところ、培地由来の成分の他に 7 本のピークを検出し、このうち 3 本のピークを LRI と MS スペクトルのフラグメントパターンから、酢酸イソアミル、イソアミルアルコール、フェネチルアルコールと同定した（Table 17, Fig. 12-17）。ピークエリアから主要成分はイソアミルアルコール（50.5％）で、酢酸イソアミルは 11.1％、フェネチルアルコールは 6.8％を占めていた。 Table 17. Volatile compounds generated by C. maltosa NP9. LRIa. Peak 1. Unidentified compound. 1045. 12.2. 2. Isoamyl acetate. 1114. 11.1. 3. Isoamyl alcohol. 1212. 50.5. 4. Unidentified compound. 1462. 6.3. 5. Unidentified compound. 1591. 0.9. 6. Unidentified compound. 1691. 12.2. 7. Phenethyl alcohol. 1905. 6.8. Total a. Relative amount (%)b. 100. Linear retention indexes were calculated for all volatile compounds. using a homologous series of n -alkanes (C8-C16) on DB-WAX column. b. Relative amounts were calculated from peak area of GC/MS analysis.. Fig. 12. Mass spectrum of peak 2.. 27. Fig. 13. Structural formula of isoamyl acetate..

(37) Fig. 14. Mass spectrum of peak 3.. Fig. 15. Structural formula of isoamyl alcohol.. Fig. 16. Mass spectrum of peak 7.. Fig. 17. Structural formula of phenethyl alcohol.. 熱帯地域から単離された C. maltosa を含む 32 種の酵母が酢酸イソアミルを生産すると報告されている（47）。また、熟成チーズの香り成分として酢酸イソアミルやフェネチルアルコールが検出されている（48）。C. maltosa NP9 もカスピアンチーズの熟成に関わっていて、イソアミルアルコールや酢酸イソアミルを生産していると考えられる。. 28.

(38) 2-3-2. C. maltosa NP9 が生産する揮発性物質の抗真菌活性揮発性酢酸イソアミル、イソアミルアルコール、フェネチルアルコールの抗真菌活性を vapor-agar contact 法で試験した。酢酸イソアミルとイソアミルアルコールは 20 l/dish で胞子発芽を完全に阻害したが、フェニチルアルコールは 160 l/dish でも阻害しなかった（Table 18）。また、3 種類の物質を気相と同じ比率に混合（酢酸イソアミル 16.2％、イソアミルアルコール 73.8％、フェネチルアルコール 10.0％）すると、20 l/dish で胞子発芽を完全に阻害した。 Table 18. Antifungal activity of volatile compounds from C. maltosa NP9a. Concentration (l/dish). Isoamyl acetate Isoamyl alcohol Phenethyl alcohol Mixtureb a. 0. 5. 10. 20. 40. 80. 160.    .    .    .    .    .    .    . The antifungal activity of volatile compounds were compared with water (control). as follows: +; completely inhibition, -; weak or no detectable activity. b. Mixture consist of 16.2% isoamyl acetate, 73.8% isoamyl alcohol, 10.0% phenethyl. alcohol. 酢酸イソアミルとイソアミルアルコールは、清酒酵母がもろみ中に生産する吟醸香成分としてよく知られており（24）、吟醸酒醸造用に酢酸イソアミル生産量の高い清酒酵母が育種されている（25-27）。しかし、清酒酵母が揮発性物質を生産して糸状菌胞子の発芽を阻害した報告はない。また、酢酸イソアミルとイソアミルアルコールは、厚生労働省が認可した食品添加物で、それぞれバナナ様およびウィスキー様香料として添加されている（49）。揮発性酢酸イソアミルやイソアミルアルコールの抗菌抗真菌活性を研究した報告はほとんどなく、本研究結果から、揮発性酢酸イソアミルとイソアミルアルコールは、食品香料と食品汚染微生物の制御という 2 つの働きをもつ物質であることを明らかにした。. 29.

(39) 2-3-3. 揮発性酢酸イソアミルとイソアミルアルコールの抗菌抗真菌スペクトル糸状菌 15 種の胞子発芽阻害活性を vapor-agar contact 法で評価した。揮発性酢酸イソアミルは 160 l/dish で Rhizopus retlexus, Mucor hiemails, M.. javanicus を除く 12 種の胞子発芽を完全に阻害した。また、酢酸イソアミルは 40 l/dish で R. stolonifer 胞子の発芽を、160 l/dish で Penicillium crysogenum と M. roxianus を殺菌的に阻害し、その他の胞子はすべて静菌的に阻害した（Table 19）。一方、揮発性イソアミルアルコールは 20 l/dish で 15 種すべての胞子発芽を阻害し、80 l/dish で殺菌的に阻害した（Table 19）。 Table 19. Antimicrobial spectrum of volatile compounds against fungi.. Aspergillus. brasiliensis. NBRC 9455. Aspergillus. nidulans. NBRC 33017. Aspergillus. oryzae. NBRC 100959. Aspergillus. fumigatus. No. 232. Aspergillus. versicolor. IAM 2027. Penicillium. crysogenum. IAM 13780. Penicillium. citrinum. IFO 4640. Rhizopus. retlexus. IAM 6018. Rhizopus. stolonifer. IAM 6021. Rhizopus. javanicus. IAM 6028. Mucor. hiemalis. IAM 6088. Mucor. javanicus. IAM 6108. Mucor. roxianus. IAM 6131. Botryotinia. fuckeliana. IAM 5126. Fusarium. oxyspolum. IAM 5009. a. Isoamyl acetate. Isoamyl alcohol. MIDa. MFDb. MID. MFD. (l/dish). (l/dish). (l/dish). (l/dish). 20 80 40 80 160 40. >160 >160 >160 >160 >160 160. 20 20 20 20 20 20. 80 40 40 80 40 40. 160 >160 40 80 >160. >160 >160 40 >160 >160. 20 20 20 20 20. 40 20 40 40 40. >160 160. >160 160. 20 20. 40 20. 80 40. >160 >160. 20 20. 80 40. The minimum inhibitory dose (MID) was defined as the lowest addition (l/dish) with. antifungal activity. b The minimum fungicidal dose (MFD) was defined as minimum concentration (l/dish) which fungicidally inhibited spore germination.. 30.

(40) 揮発性酢酸イソアミルは 160 l/dish ですべての酵母の生育を阻害した（Table 20）。S. cerevisiae と P. anomala は 80 l/dish で殺菌的に阻害されたが、その他の酵母は 160 l/dish でも殺菌されなかった。一方、揮発性イソアミルアルコールは 20 l/dish ですべての酵母の生育を阻害し、80 l/dish で Zygosaccharomyces bailii を除く 4 種の酵母を殺菌的に阻害した（Table 20）。 Table 20. Antimicrobial spectrum of volatile compounds against yeast.. Saccharomyces. cerevisiae. NBRC 10217T. Candida. albicans. NBRC 12204. Pichia. anomala. NBRC 12210. Zygosaccharomyces. bailii. NBRC 1098T. Kluyveromyces. marxianus. NBRC 10005T. a. Isoamyl acetate. Isoamyl alcohol. MIDa. MFDb. MID. MFD. (l/dish). (l/dish). (l/dish). (l/dish). 40 160 40. 80 >160 80. 20 20 20. 40 80 40. 80 80. >160 >160. 20 20. >160 80. The minimum inhibitory dose (MID) was defined as the lowest addition (l/dish) with. antifungal activity. b The minimum fungicidal dose (MFD) was defined as minimum concentration (l/dish) which fungicidally inhibited the growth. 清酒酵母は、グルコースからロイシンを経てイソアミルアルコールを生合成する（50）。しかし、菌体内に蓄積したイソアミルアルコールは、偽菌糸の形成を誘導し、細胞骨格タンパク質であるチューブリンの生成量を減少させて清酒酵母の生育を阻害する（51）。そこで清酒酵母は、アルコールアセチルトランスフェラーゼでイソアミルアルコールを酢酸イソアミルに変換、細胞外へ排出することによってイソアミルアルコールの毒性を軽減している（50, 52）。これが酢酸イソアミルよりイソアミルアルコールが酵母に高い抗真菌活性を示した原因の 1 つと考えられる。. 31.

(41) 揮発性酢酸イソアミルは 160 l/dish ですべてのグラム陽性細菌の生育を静菌的に阻害したが、揮発性イソアミルアルコールは 160 l/dish で Bacillus. subtilis を除く 6 種のグラム陽性細菌を殺菌的に阻害した（Table 21）。グラム陰性細菌では属種によって感受性が異なっていて、 Pseudomonas. aeruginosa は揮発性酢酸イソアミルとイソアミルアルコールともに 160 l/dish でも静菌的にのみ阻害された。しかし、Escherichia coli と Acetobacter aceti は揮発性酢酸イソアミルには 20 l/dish で、揮発性イソアミルアルコールでは 40 l/dish で殺菌的に阻害された（Table 21）。 Table 21. Antimicrobial spectrum of volatile compounds against bacteria.. Gram-positive. Isoamyl acetate. Isoamyl alcohol. MIDa. MBDb. MID. MBD. (l/dish). (l/dish). (l/dish). (l/dish). Bacillus. subtillis. IAM 1213. 80. >160. 20. >160. Listeria. denitrificans. JCM 11481. Staphylococcus. aureus. IFO 3060. Lactobacillus. plantarum. IAM 1041. Lactobacillus. brevis. IAM 1082. Pediococcus. pentosaceus. IAM 12296. Streptococcus. salivarius. ATCC 9758. 80 80 160 80 160 160. >160 >160 >160 >160 >160 >160. 20 40 20 40 40 20. 40 80 160 160 80 80. >160 20 20. 20 20. >160 40 20. Gram-negative Pseudomonas. aeruginosa. IAM 1514T. Escherichia. coli. NBRC 3301. 80 20. Acetobacter. aceti. IAM 1802. 20. a. 20. The minimum inhibitory dose (MID) was defined as the lowest addition (l/dish) with. antibacterial activity. b The minimum bacteriocidal dose (MBD) was defined as minimum concentration (l/dish) which bacteriocidally inhibited the growth.. 32.

(42) 精油も非接触的に抗菌活性を示すことが明らかにされている。精油の抗菌活性の特徴は、抗菌スペクトルが広いことで、好気性菌や糸状菌胞子、グラム陽性細菌、抗酸菌に高い活性を示し、グラム陰性細菌への活性は低い。また、疎水性の高い精油は、相対的に親水性の高い精油よりも低い活性を示した（53）。グラム陰性細菌に対する精油の抗菌活性が低い理由として、外膜の透過性が悪くて細胞膜まで到達できないことがあげられている（54）。とくに外膜の透過性が低い Pseudomonas 属細菌は、精油に対する感受性が低く、反対に外膜の親水性側鎖が短く、相対的に疎水性の高い外膜をもつ Haemophilus influenza は、高い感受性を示すことが報告されている（55, 56）。揮発性イソアミルアルコールは供試した被検菌の中では、糸状菌胞子の発芽を最も強く阻害し、次いで酵母、細菌の順で、グラム陰性細菌にも陽性細菌とほぼ同程度の阻害活性を示した。ただし、属種によって感受性に差が認められ、. Z. bailii、B. subtilis と P. aeruginosa には、供試した最大量 160 l/dish でも殺菌できなかった（Table 19, 20）。一方、揮発性酢酸イソアミルは、イソアミルアルコールよりも活性が低かったが、 E. coli と A. aceti にはイソアミルアルコールと同等の活性を示した（Table 21）。また、E. coli と A. aceti の揮発性酢酸イソアミルに対する感受性は、グラム陽性細菌より高かったことから、外膜の構造（外膜の極性や透過性）の他にさらに別の要因があると推測される。. 33.

(43) 2-3-4. Vapor-agar contact 法における揮発性酢酸イソアミルとイソアミルアルコールの気相中量の経時的変化 Vapor-agar contact 法に用いた容器の気相中の揮発性酢酸イソアミルとイソアミルアルコール量を SPME-GC/MS で測定した。酢酸イソアミルを 10～160 l/dish 添加すると、気相中の酢酸イソアミル量は添加 2 h 後までに急激に増加した。160 l/dish では 5 h 以降も同じ値を示したが、20 l/dish 以下では 2 h 後から急速に減少し、20 l/dish 添加した容器では、 48 h 後の酢酸イソアミル量は 2 h 後の値の約 15％に減少した（Fig. 18）。一方、イソアミルアルコールの気相中量は、添加 48 h 後でもほぼ一定の値を保っていた。. Fig. 18. Amount of volatile isoamyl acetate (a) and isoamyl alcohol (b) in gas-phase. The amounts of 10 l (circle), 20 l (triangle) and 160 l (square) isoamyl acetate (open symbol) and isoamyl alcohol (closed symbol) were added in a small glass dish sealed with a parafilm membrane and incubated at 28°C. 気相中の酢酸イソアミル量の最大値は、イソアミルアルコール量より約 2.5 倍高かったが、それ以降急速に減少した（20 l/dish）。これは、アルコール類は遊離水酸基を介して水素結合によって会合しているので、揮発性が低いのに対して、エステル類には遊離水酸基がないので会合せず、揮発性が高かったことが原因と考えられる。また、密閉容器に添加した揮発性物質の気相中量は 2 h 以内に最大に達し、その後減少することは Inouye ら（56）も報告しており、揮発性物質の分解や吸着、漏出が原因と考えられる。 34.

(44) 2-3-5. 揮発性酢酸イソアミルとイソアミルアルコールに曝露した A.. brasiliensis 胞子の走査型電子顕微鏡観察 A. brasiliensis 胞子を PDA 培地で培養すると、培養 5 h 後には吸水、膨潤して胞子外殻の突起状構造は消失し、容積も増えていた。7 h 後には菌糸の伸長が観察され、48 h で二次胞子が形成された（Fig. 19a）。揮発性酢酸イソアミル 160 l/dish に 48 h 曝露した胞子は、大きさと形態に変化は認められなかった（Fig. 19b）。この胞子を新しい PDA 培地に移すと、5 h 後に発芽したが、発芽した胞子の外殻には突起状構造が残存していて、曝露していない胞子の平滑な表層とは異なっていた（Fig. 19c）。一方、揮発性イソアミルアルコール 20 と 160 l/dish に 5 h 曝露した胞子では、胞子外殻の突起状構造が消失していた（Fig. 19d）。この胞子を新しい PDA 培地に移すと、20 l/dish に曝露した胞子は 9 h 後に発芽したが（Fig. 19e）、160 l/dish に曝露した胞子は発芽しなかった。. 35.

(45) Fig. 19. Scanning electron microscope observations of A. brasiliensis spores incubated at 28°C for 0, 5, 7, 9, 11 and 48 h. (a) control, (b) spores exposed to 160 l/dish isoamyl acetate, (c) spores after removing the isoamyl acetate from exposed spores, (d) spores exposed to 20 l/dish isoamyl alcohol and (e) spores after removing the isoamyl alcohol from exposed spores. Bars represent 120 m (a-48 h, c-48 h and e-48h) and 3 m (other pictures). 36.