リアルタイムPCRでの 解 析 は 年 々 増 加 ここ 数 年 はRNAi microrna DNAアレイ 解 析 等 での 報 告 が 多 い R

リアルタイムPCRによる

遺伝子発現解析の基本から応用

16

46

52

72

178

502

1023

1841

3002

8027

₇₉₀₁

6535

2

6

37

116

292

536

585

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

1

9 9

5

年

1

9 9

6

年

1

9 9

7

年

1

9 9

8

年

1

9 9

9

年

2

0 0

0

年

2

0 0

1

年

2

0 0

2

年

2

0 0

3

年

2

0 0

4

年

2

0 0

5

年

2

0 0

6

年

︵

1

0

月

︶

Real Time PCR

microRNA

リアルタイムＰＣＲでの解析は年々増加。

ここ数年はRNAi、microRNA、DNAアレイ、解析等での報告が多い。

（各年間におけるPubMedでのキーワードサーチの結果）

リアルタイムPCRで可能なアプリケーション例

 相対定量：試料間のターゲットの発現量の差（何倍）を比較

（例） 目的遺伝子の発現変動（時間経過ごとでの変動測定）

（例） 薬剤投与時の挙動（薬剤濃度に依存した変動の測定）

 絶対定量：試料中のターゲットの絶対量(コピー数）を測定

  （例） ウイルスなどのコピー数の定量

（例） バクテリアや病原微生物の変動測定

 定性的測定

（例） ＳＮＰｓタイピング（薬物代謝酵素変異による副作用予測）

リアルタイムPCRによる遺伝子発現の比較とSNPタイピング

A B

IL-4遺伝子

A      B

TGFβ遺伝子

目的の遺伝子に対しての

サンプル間での発現比較

薬物代謝酵素のSNPタイピングP450（CYP2C9*3）

Day 0 Day 1 Day 2 Day 3 Day 4 Day 5 Day 6 Day 7 Day 8 Day 9 Day 10

目的遺伝子の発現変動測定

縦軸スケール

Log相対表記

相対定量法の例：各遺伝子の時間毎の経過を観察

•横軸：遺伝子の種類 （IL-8 ＆ TGF-β 遺伝子）

•縦軸：発現量比較 （Logスケールで表示）

0h

12h

36h

24h

48h

60h

0h

12h

36h

24h

48h

60h

RNAiでの遺伝子発現抑制

(Celera Genomics & Applied Biosystems, USA)

64種類の遺伝子に 

対して、356種類の

RNAiを作成して測定。

80%以上の

ノックダウンを

リアルタイムPCRで

確認。

一定量発現しているmicroRNA

（ Ct値=35未満の）は

ES、EC、各組織で100種類以上ある

Data from:

Caifu Chen, Applied Biosystems and

microRNA検出定量のデータ

Data from: Ridzon, Applied Biosystems and

microRNA検出定量のデータ

サンプルと試薬の混合

サンプルの抽出（30分∼1時間）

リアルタイムPCRでの

分析（30∼1.5時間）

遺伝子の発現量比較の手技

ノザン解析からリアルタイムPCR定量へ

ノザン解析

_{リアルタイムPCR定量}

5日間

GAPDH

p53

1

2

3

4

バンドの濃淡で

遺伝子発現量の比較

PCRの増幅曲線で

遺伝子発現量の比較

（2倍差の検出＆広いダイナミックレンジ）

・ 2倍の正確な発現比較が可能

・ 大量サンプルの解析も可能

・ デンシトメーターでの画像解析

・ クロスハイブリの問題

特徴

Total RNA

=

10∼100ng程度/Well

Total RNA

=

10∼20μg程度/Well

必要なRNA量

RNA

↓

逆転写（1時間半）

↓

リアルタイムPCR（1時間半）

↓

解析・解析

（合計 ３時間程度）

RNA

↓

電気泳動（8時間）

↓

ブロット（8時間）

↓

ハイブリ（2時間）

↓

洗い（2時間）

↓

検出・解析

（合計 24時間以上）

所要時間

ノザンハイブリ

リアルタイムPCR

遺伝子の発現量の手技の比較

検体からのTotal RNA回収

（培養細胞、組織、血液等）

（操作時間：30分程度）

ｃDNA合成（ｍRNAの逆転写反応）

（反応時間：1時間）

リアルタイムPCR実験

（反応時間：30分∼1.5時間）

解析結果

リアルタイムPCRによる遺伝子の発現比較

Ambion P/N 1912

RNAqueous® Kit

50 purifications ¥ 31,000

AppliedBiosystems, P/N N8080234

TaqMan Reverse Transcription Reagents

ランダムヘキサマーでの逆転写を推奨

AppliedBiosystems, P/N 4367659

Power SYBR Green Master Mix

AppliedBiosystems, P/N4304437

TaqMan Universal PCR Master Mix

（n回PCR反応終了時の）PCR産物量

 ＝テンプレートの初期濃度 ｘ ２

ｎ

増幅回数（サイクル数n）→

↑

増

幅

産

物

量

︵

L

o

g

表

示

︶

理想的なPCR反応は１回のサイクルで       

ターゲットのDNAが２倍に増幅する

実際のPCR反応では１回のサイクルで       

DNAが２倍に増幅する領域は限られる



PCR反応の初期は検出限界以下である



PCR反応の後期はプラトー状態になる

増幅回数（サイクル数n）→

↑

検

出

量

︵

L

o

g

表

示

︶

プラトーを引き起こす原因

•PCR産物の基質（dNTPやﾌﾟﾗｲﾏｰ）の枯渇

•酵素の失活

•PCR阻害物の蓄積

   など

プラトー

PCR終了後にゲル電気泳動を行っても

定量することはできない ！

PCRの各サイクルで蛍光強度から目的遺伝子の検出を行う。

初期濃度が2倍違うと、１サイクルずれて増幅曲線が立ち上がる。

↑

検

出

量

︵

L

o

g

表

示

︶

サイクル数→

補助線（Threshold Line）と増幅曲線の交点（Ct値）をみると、

2倍の初期濃度の差は、１サイクルの差になる

サイクル数→

↑

検

出

量

︵

L

o

g

表

示

︶

25

24

23

22

21

各サイクル毎に蛍光を検出すると増幅曲線を作成することができる。

1サイクルの「差」が2倍の濃度の差に相当する。

交点（Ct値）

交点の値（Ct値）と濃度の関係をプロットすると

検量線を作成することができる

複数の未知濃度のサンプルも

27

26

25

24

23

1,250 2,500 5,000 10,000 20,000

(Copy数）    

0.0625 0.125 0.25 

0.5 1        

(希釈率）

  6.25    12.5  

25     50   100    

（相対値%）

1 2 4 8 16

（相対値）

(

交

点

の

サ

イ

ク

ル

数

：

C

t

値

)

検体における遺伝子の発現量の違いを

サイクル数（Ct値）で示す事が出来る。

サイクル数→

↑

検

出

量

︵

L

o

g

表

示

︶

Ct=23

（正常細胞由来ｃDNA検体）

Ct=21

（ガン細胞由来ｃDNA検体）

例）ガン細胞と正常細胞の比較の場合

例）ガン細胞と正常細胞の比較の場合

以上の検量線の比較から、目的遺伝子は

ガン細胞の相対値： 16, 正常細胞の相対値: 4となり、

ガン細胞では4倍の発現量がある事がわかる。

サイクル数（Ct値）

25

24

正常細胞由来ｃDNA 23

22

ガン細胞由来cDNA 21

1 2

4

8

16

（相対値）

増幅効率

遺伝子発現定量に関して重要な要因

PCR産物の増幅効率は以下の式で算出できる。

•

増幅効率 e = 10

-1/slop

_–1

例えば、slopの値が –3.366の場合

e = 10

-1/-3.366

–1

= 10

0.287

_–1

= 1.98-1

=0.98

おおよそ、0.98の割合で増幅していることがわかる

検量線をかくためのスタンダードカーブ作成用サンプル

•

絶対定量を行うとき（ウイルスの定量等の場合）



絶対値(コピー数）が既知のものを利用

•

PCR産物やVector等で塩基数のサイズや

質量がわかっているもの

•

相対定量を行うとき（通常の発現解析の場合）

•

数サンプル間での比較を行いたい場合

•

目的遺伝子が強く発現するｃDNA溶液を１とし、

その段階希釈をとり、それ以外のサンプルが

どこに検出されるかによって判定する。（一般的）

ステップ１：分子量（ｍｗ）の計算

二重鎖DNAプロダクトの長さ（bp）×330 daltons×2 nt/bp＝X daltons(g/mole)

ステップ２：分子量からコピー数への変換

X g/mole÷アボガドロ定数（6.023×10

23

_{molecules/mole）＝Y g/moleclue}

Y：1分子（コピー）あたりのサンプルDNAの重量

定量PCR（絶対定量） コピー数への変換

(6630bp) (330dal×2nt/bp) = 4.38×10

6

_{dal (g/mole)}

(4.38×10

6

_{g/mole) ÷ (6.023×10}

23

_{molecules/mole)=7.27×10}

-18

_g/molecule

プラスミド（6630bp)DNA １分子あたり 7.27×10

-18

_g

すなわち・・・1pgのプラスミドで約13万コピーに相当

（例）ノロウイルスG1領域の増幅曲線

（10

0

_∼10

7

_{copyの10倍希釈サンプル）}

10

co

py

10

co

py

10

co

py

10

co

py

10

co

py

10

co

py

10

co

py

10

co

py

ノロウイルスG1領域の検量線

10

7

_copy

10

6

_copy

10

5

_copy

10

4

_copy

10

3

_copy

10

2

_copy

10

1

_copy

10

0

_copy

（10

0

_∼10

7

_{copyの10倍希釈サンプル）}

10

_copy

10

_copy

10

_copy

10

_copy

10

_copy

10

_copy

10

_copy

10

_copy

検量線を用いた測定方法

Ct値

34

19.5

既知濃度サンプルのThreshold Lineとの

交点（Ct値）から作成した検量線から

サンプルの交点（Ct値）を比較。

リアルタイムPCRでの蛍光検出方法

PCR産物を各サイクルで検出するために

TaqMan

®

法（5‘-Nuclease Assay）

MGB

5’

3’

5’

5’

3’

5’

Forward

Primer

Reverse

Primer

TaqMan

®

Probe

Q

R

TaqMan

®

ﾌﾟﾛｰﾌﾞとPrimerの設計のバックグランド

目的の配列をはさむ特異性の高い領域でPrimerを設計し、

TaqMan

®

Probeをその中心に設計する

Primer とTaqMan

®

ﾌﾟﾛｰﾌﾞの設計のガイドライン

5’

Reverse

Primer

5’

Forward

Primer

PCR primer

目的配列を含む150bp程度の領域を

 増幅するように設計（Tm=58∼60℃）

TaqMan

®

ﾌﾟﾛｰﾌﾞ

PCR産物のほぼ中央にくるような

 Oligoの配列を設計（Tm=68∼70℃）

 ５’末端側にレポーター蛍光色素、

 ３’末端側にクエンチャー蛍光色素を付加。

R

Q

MGB

MGB

ゲノムのコンタミを検出しないようにTaqMan

®

ﾌﾟﾛｰﾌﾞとPrimerを設計する

Primerは可能であればIntronを挟み、異なるExon上にPrimerを設計する。

また、TaqMan

®

Probeをジャンクション部位に設計する。

（ゲノムＤＮＡの誤検出を防ぐため）

Exon1

Exon2

Exon1

Exon2

Forward

Primer

Reverse 

_Primer

TaqMan

®

Probe

R

Q

Forward Primer

Reverse Primer

ゲノムDNA

TaqMan

®

 Probeの特徴

単体のレポーター色素

青色光により励起エネルギーを蓄え、

発光する特徴をもつ。

R

レポーター色素

Fluorescein系の蛍光色素

（FAM もしくは VIC）

クェンチャー

レポーター色素の

蛍光エネルギーを消去

蛍光共鳴エネルギー

転移現象

MGB

Q

5’

3’

R

特定遺伝子領域の配列の検出

PCR反応時には、TaqMan

®

_{ﾌﾟﾛｰﾌﾞが先に}

特異性の高い遺伝子領域に結合する（68-70℃付近）

5’

3’

5’

5’

3’

5’

Forward

Primer

Reverse

Primer

TaqMan

®

Probe

R

Q

5’

3’

5’

5’

3’

5’

Forward

Primer

Reverse

Primer

TaqMan

®

Probe

R

Q

特定遺伝子領域の配列の検出

次に目的遺伝子特異的なPrimerが結合する（58-60℃付近）

特定遺伝子領域の配列の検出

Primer部位にDNAﾎﾟﾘﾒﾗｰｾﾞが結合して伸長反応が進む

5’

3’

5’

5’

3’

5’

Forward

Primer

Reverse

Primer

R

Q

TaqManプローブが

分解され始める

5’

3’

5’

5’

3’

5’

Q

R

特定遺伝子領域の配列の検出

DNAﾎﾟﾘﾒﾗｰｾﾞの伸長方向にDNAがあると、

TaqManプローブが分解される（ｴｸｿﾇｸﾚｱｰｾﾞ活性）。

Q によって抑制されていた、

R

の蛍光が生じる。

TaqManプローブの

R

と Q の

距離が離れて

R

が発光し始める

5’

3’

5’

5’

3’

5’

R

_Q

特定遺伝子領域の配列の検出

PCRが終了し、伸長反応が終了するとTaqMan

®

_{ﾌﾟﾛｰﾌﾞは分解され}

R

の蛍光が検出を検出することができる。

PCRが進むと、TaqMan

®

ﾌﾟﾛｰﾌﾞは分解され、

レポーターの蛍光強度が増加する

↑

蛍

光

強

度

PCRサイクル数→

TaqMan

®

_{-MGBプローブでは}

レポーターの蛍光色素のみを検出できる

R

DNA TemplateはcDNAを

Total RNAでの質量を元に利用

反応組成の一例

/well

Final

TaqMan Universal PCR Master Mix (2x)

25μL

1x

10μM Forward Primer

4.5μL

900nM

10μM Reverse Primer

4.5μL

900nM

10μM TaqMan Probe

1.25μL

250nM

Template (cDNA 10ng/μL)

5μL

50ng

d3W

12.75μL

Total

50μL

TaqMan アッセイでの反応組成

逆転写試薬

AppliedBiosystems, P/N N8080234

TaqMan Reverse Transcription Reagents

マスターミックス

AppliedBiosystems, P/N4304437

TaqMan Universal PCR Master Mix

•リアルタイムPCR TaqMan

®

ケミストリの特徴

• TaqMan®プローブが分解されることによって生じる、

蛍光を検出するので、蛍光量がPCR増幅を反映する。

• Primerペアだけの設定よりも配列特異性を高める事ができる。

• 2種類の蛍光を用いて2Probeアッセイを行え、

サンプルの有効利用やコストダウンが可能である。 

• SNPタイピングが可能である

• 低発現遺伝子測定の際のバラツキを低減できる。

特徴

•

DNAにインターカレートして、

蛍光を発する蛍光物質SYBR® Green I の

存在下でPCRを行い、

すべての2本鎖DNAを検出する。

•

PCR産物の定性的な検知が可能

注意

•

PCR Primerの配列には充分な注意が必要。

•

Primerの濃度に注意が必要。

•

プライマーダイマー由来の蛍光が生じる。

•

non-specificアニーリング由来の蛍光が生じる。

•

蛍光量と反応産物量の比が必ずしも１：１ではない。

PCR反応終了

PCR反応スタート

PCR反応が進み、増幅産物が増えると、

ATATATAT

TATATATA

_120bp

1 目的バン ド

2 Prim erダイ マ ー

3 ス メ ア ー

4 非特異的バン ド

ATATATAT

PCR反応で 増幅

互いに結合

DNA Polim eraseが認識

1

2

3

4

SYBR

®

_{Green ケミストリ使用時には}

Primerの設計に注意が必要である

SYBR Green反応液組成

No template control で、プライマーダイマーができない条件等を

複数検討することが必要です。

DNA TemplateはcDNAを

Total RNAでの質量を元に利用

反応組成の一例

/well

Final

SYBR Green PCR Master Mix (2x)

25μL

1x

10μM Forward Primer

xxμL

50-900nM

10μM Reverse Primer

xxμL

50-900nM

Template (cDNA 10ng/μL)

5μL

50ng

d3W

xx μL

Total

50μL

SYBR Green アッセイでの反応組成

逆転写試薬

AppliedBiosystems, P/N N8080234

TaqMan Reverse Transcription Reagents

マスターミックス

AppliedBiosystems, P/N 4367659

Power SYBR Green Master Mix

★非特異的産物の生成の確認（Dissociation Curveの作成)

一見、高コピー領域で定量できているように見受けられるが、

全てのサンプルにおいて非特異的産物が生成している。

⇒ 定量性に非常に大きな疑問

4倍希釈（8段階）

SYBR

®

_{Green PCR Assay 正確な定量結果を得る為に}

非特異的産物？

プライマーダイマー？

リアルタイム定量PCRの解析法

•内在性コントロールによるサンプル間の補正

•検量線を用いない新しい比較定量方法

リアルタイムPCRによる定量法の例

（内在性コントロールで相対値で比較）

希釈率で検量線を作成して比較する方法

5

10

0.3

3.0

36 hrs

４

２

１

比較結果

（０ｈｒｓを１として）

８

0.3

2.4

24 hrs

４

0.25

1.0

12 hrs

２

0.1

0.2

0 hrs

標準化

(p53/GAPDH)

内在性コントロール  

遺伝子発現量（GAPDH）

標的遺伝子発現量

（p53）

サンプル

Comparative C

_T

法

1サイクルの検出の違いで、2倍量の差であるという理論を

活用して算出する方法

   ２

-⊿⊿ＣT 

＊検量線作成が不要なので、多サンプルを処理できる＊

⊿⊿C

_T

法の成立する条件

１、 ターゲット遺伝子と内在性コントロール遺伝子のPCR効率がほぼ等しい

希釈によって∆C

_T

値が変動しない=検量線を描いた時の傾きが同じ

２、 PCR効率が１に近い

設計のガイドラインに基づくとPCR効率の良い

短いPCR産物のサイズで設計ができる

リアルタイムPCRによる定量法の例（比較定量法）

検量線を作成せずに比較定量する方法

16.5

37

5.6

1

相対比

c-mycの発現比較

（GAPDHで 補正）

2

4.05

_=16.5

2.81-6.86

= -4.05

25.83-23.01

=2.81

23.01

25.83

Ｌｕｎｇ

（肺）

2

5.21

₌₃₇

1.60-6.86

= -5.21

26.25-24.60

=1.60

24.60

26.25

Ｌｉｖｅｒ

（肝臓）

2

2.5

_=5.6

4.37-6.86

= -2.5

27.03-22.66

=4.37

22.66

27.03

Ｋｉｄｎｅｙ

（腎臓）

2

0

₌₁

6.86-6.86

=0

30.49-23.63

=6.86

23.63

30.49

Ｂｒａｉｎ

（脳）

2

乗数項に代入

⊿⊿Ｃｔ

（各臓器の

⊿Ct値）

 - 

（Brainの ⊿

Ct値）

⊿Ｃｔ値

(c-myc)Ct値

 -(GAPDH)Ct値

参照遺伝子

ＧＡＰＤＨの

平均Ｃｔ値

標的遺伝子

c-mycの

平均Ｃｔ値

組織

GAPDH遺伝子を内部標準として用い、Brainでのｃ−ｍｙｃ遺伝子の発現量を

１とした場合の各臓器におけるｃ−ｍｙｃ遺伝子の発現量を比較

* Ct値は一定の蛍光強度に達したサイクル数

相対比

組織

16.5

37

5.6

１

Ｌｕｎｇ

（肺）

Ｌｉｖｅｒ

（肝臓）

Ｋｉｄｎｅｙ

（腎臓）

Ｂｒａｉｎ

（脳）

Ｂｒａｉｎ

Ｋｉｄｎｅｙ

Ｌｉｖｅｒ

Ｌｕｎｇ

Brainでのｃ−ｍｙｃ遺伝子の発現量を１とした場合、

Kidneyでは5.6倍、Liverでは37倍、Lungでは16.5倍の発現量があった。

内在性コントロール遺伝子とは？

組織や細胞の個数をそろえ、

反応系へのcDNA持込量やRT効率の差を補正

刺激などに対して発現量が変化せず、

常に一定量発現している遺伝子が望ましい。

歴史的には

ハウスキーピング遺伝子(GAPDH,β-actin,etc)

18s rRNA・・などが利用されてきた

しかし・・・

GAPDH

CYC

IPC (Positive Control)

18S ribosomal RNA

PO

beta-actin

TBP

TfR

PGK

ß

-Microglobulin

GUS

HPRT

複数の臓器での内在性コントロール検討

18ｓｒＲＮＡやβ-Actin、GUS、

TBP遺伝子は各臓器間での変動が少なく、

各サンプル間での増幅曲線が隣接している。

また、GAPDH、TfR遺伝子は変動が大きく、

各臓器での増幅曲線に変動が見られる。

なお、当実験の結果がすべての実験系に

当てはまるわけではないので、

個々の実験系に応じて検討する必要がある。

PO

1

.0

2

.5

1

.6

2

.9

1

.0

5

.4

1

.4

2

8

.5

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

Bone Marrow

Spleen

Thymus

Lung

18s Normalized IL-10

GAPDH Normalized IL-10

異なる内在性コントロール遺伝子を用いた解析結果の比較

Bone Marrow を基準とした IL-10 の相対定量結果

TaqMan Gene Expression Assays

•

遺伝子発現解析用のTaqMan Gene Expression Assays

•

条件検討不要

•

論文にもそのまま採択

•

高品質なデータを提供

•

Webから検索＆発注（検索のみは登録不要）

•

TaqMan Gene Expression Assays

•

Inventoried Assay: Pre-made、デザイン済み、在庫あり

•

100反応（50μL反応時）、250反応（20μL反応時）、¥28,000-•

Non-Inventoried Assay： Made-to-Order、デザイン済み、在庫なし

TaqMan Gene Expression Assays検索方法

遺伝子名やRefSeq ID入力

↓

動物種入力

↓

検索

TaqMan Gene Expression Assays検索方法

Pre-madeとMade to Orderの違い

•

価格

•

Pre-made : ¥28,000-/100反応分

•

Made to Order : ¥45,000-/150反応分

•

納期

•

Pre-made : 約1週間

•

Made to Order : 約2週間

•

QCチェック (humanのみ）

•

Pre-made : humanのcDNAサンプルを用いて増幅確認済み

•

Made to Order : 増幅は未確認

→特に設計位置の指定がないときにはPre-madeアッセイを推奨します

Assay IDに含まれる情報

Hs00355914_m1

①

②

③

① 生物種：学名の頭文字の組み合わせ

Hs: H. Sapience

Mm: M. musculus

Rn: R. norvegicus

At: A. thaliana

Dm: D. melanogaster

② プライマー・プローブセット固有の番号

  設計した順番に割り当てられ、      

  数が大きいほど新規に設計。

③ Genomic DNA由来の増幅

m: genomic DNAが混入していても

  増幅しません

s: 同一のエキソン上にプライマー・

  プローブが設計されているので

  genomic DNAが混入していたら

  増幅します

g: 染色体上に相同性の高い配列

  が存在するため、genomic DNA

  から増幅する恐れがあります

u: 挟んであるイントロンサイズが短

  いため、genomic DNAから増幅

  する恐れがあります

③ 配列の特異性

1: ターゲット遺伝子特異的に検出することができます。

H: 相同性が高いmRNAからも若干(10-15cycleのずれで）増幅する可能性あり。

複数のアッセイから選択するときのポイント

∼Assay IDでの判断∼

•

右から２番目のアルファベットが“m”のものを選択

•

genomic DNAからの増幅を考慮する必要がありません

•

一番右が“1”のものを選択

•

特異性の高いセットを選択

•

番号が大きいものを選択

•

最新のデータベース上の転写産物配列情報を元に設計されているものを選択

注記：上記は目安です

ターゲットとなる配列情報も併せてご判断いただくことをお勧めします

Pre-madeアッセイが沢山ある時の例①

Assay IDの数字が一番大きい

→最新のアッセイ

対象となる配列数が最も多い

→網羅的に検出することが可能

Pre-madeアッセイが沢山ある時の例②-a

Assay IDの数字が一番大きい

→最新のアッセイ

対象となる配列数が最も多い

_{→網羅的に検出することが可能}

このように最新のアッセイの対象とする配列数が多くない場合

→全てのバリアントを検出することができない可能性が高い

Pre-madeアッセイが沢山ある時の例②-b Map View

Hs00249794_m1 :

NM_016724のみ検出可能

Hs00357143_g1 :

全てのSplicing Variantの検

出可能、しかし“g”なので

genomic DNA由来の増幅の

可能性あり

Hs00360501_m1 :

HM_016724及び

NM_016730の2つのValiant

のみ検出可能

TaqMan PreAmp Master Mix

•

リアルタイムPCRに用いるｃDNAを増幅させる試薬。

•

TaqMan Gene Expression Assays と共に利用。

SYBRや自家設計のPrimerは非対応。

•

最大100遺伝子までをマルチプッレクスPCRで増幅。

•

その後、希釈してリアルタイムPCRを実施。

•

「ｃDNA足りていますか？」

•

「解析するべき遺伝子が多数あるが、ｃDNAが足りない」場合に最適

•

臨床検体・レーザーマイクロダイセクションサンプルから大量の遺伝子解析が

可能

•

発現量が少ない遺伝子の増幅をさせるものではない。

通常のリアルタイムPCR

サンプル（組織・細胞）

↓

RNA抽出

RNA

↓

逆転写反応（RT)

ｃDNA

↓

リアルタイムPCR（10ng/tube)

発現解析結果

(1遺伝子）

PreAmpを用いたリアルタイムPCR

サンプル（組織・細胞）

↓

RNA抽出

RNA

↓

逆転写反応（RT)

ｃDNA

↓

_{PreAmp（10もしくは14サイクル}

↓

（10ng/tube)

希釈（5倍もしくは20倍）

↓

リアルタイムPCR

発現解析結果

(50遺伝子、もしくは200遺伝子解析）

TaqMan PreAmp Master Mix

•

商品構成（1キットに２種類の試薬を含みます）

•

Pre−PCRを行いマルチプレックスで遺伝子増幅。

•

増幅後に個別のリアルタイムPCRで検出

•

増幅させるサンプル数：40検体

–

通常のTaqMan Universal PCR Master Mix付属

»

20μLの反応系（96Wellプレート）で500反応分

TaqMan PreAmp Master Mix

•

ｃDNA足りていますか？

•

リアルタイムPCRの場合は1サンプルあたり10-100ngのｃDNAが必要。

•

サンプルが微量な場合は解析できる遺伝子が数種類しか出来ない。

ｃDNAが少ないので

2遺伝子しか研究できない・・・

cDNAをPreAmpしたので、

20遺伝子を研究できる！

TaqMan PreAmp Master Mix

•

均一にバイアスをかけることなくマルチプレックスPCRを行う。

•

最大100PlexまでPre-PCR反応する事ができる。

•

10サイクル：およそ1,000倍、50反応

•

14サイクル：およそ10,000倍、200反応

•

RIN9.0もRIN7.4も同様の結果を得る。デグラしたRNAでも可能

•

18s rRNAを含むPrimerセットではマルチプレックス不可

•

3ng/well cDNAで測定時にCtが35より早い遺伝子に対応

•

CDKN1B遺伝子をコントロールに推奨

リアルタイムPCRに用いる目的のサンプル数にあわせてPreAmp試薬での増

幅サイクルを10サイクル、もしくは14サイクルに設定することにより必要とする

サンプル数に対応した溶液を得ることができます。（下図参照）

通常は10サイクルでのPre-PCRを推奨。

スタート時の

ｃDNA量

PreAmp試薬での

増幅サイクル数

PreAmp後の

希釈割合

リアルタイムPCRに

利用できるサンプル数

1-250ng

10

1：5

50

14

1：20

200

PreAmp試薬を用いたサイトカイン関連遺伝子の発現解析

•

使用したサイトカイン関連遺伝子Assay

•

24種類（右表参照、ラボにあるストックを利用）

•

15種類：評価可能な発現量あり。

•

9種類：今回用いたサンプルでは発現なし

（Ctが35以降で、PreAmpの評価の対象外）

•

内在性コントロール：CDKN1B

•

使用したサンプル（ラボにストックのあるｃDNAを利用）

•

Raji cDNA (B-lymphocyte; Burkitt's lymphoma)

•

Universal Human Reference cDNA as Control.

•

Total cDNA amount: 810ng for No PreAmp

•

Total cDNA amount: 125ng for PreAmp

Gene

Expression

CCR1

OK

CCR2

OK

CCR4

OK

CCR5

OK

CDK4

OK

MDC

OK

TGF beta

OK

IFN ganma

Not Expressed

TNF alfa

OK

TNF beta

Not Expressed

MCP-1

OK

CD23

OK

CD25

Not Expressed

CD69

OK

IL-2

Not Expressed

IL-3

Not Expressed

IL-4

OK

IL-5

Not Expressed

IL-7

OK

IL-10

OK

IL-13

Not Expressed

IL-17

Not Expressed

IL-18

Not Expressed

PreAmp前

PreAmp後

遺伝子

平均Ct値

No PreAmp

平均Ct値

PreAmp

平均Ct値の差分

(No PreAmp) - (PreAmp)

1

28.47

22.11

6.36

2

25.37

18.66

6.71

3

22.29

15.91

6.39

4

27.87

19.63

8.24

5

22.99

16.26

6.73

6

24.20

17.62

6.57

7

33.81

30.23

3.59

8

25.26

18.43

6.83

9

26.67

19.76

6.92

10

28.37

21.39

6.98

11

32.77

26.03

6.75

12

24.36

17.31

7.05

13

27.47

20.88

6.59

14

24.73

18.24

6.49

15

26.07

19.68

6.39

16

28.41

21.76

6.66

17

27.87

21.41

6.46

18

23.96

17.15

6.82

PreAmp試薬を用いたサイトカイン関連遺伝子の発現解析

（まとめ）

y = 1.1234x - 9.8823

R

= 0.9523

15.00

17.00

19.00

21.00

23.00

25.00

27.00

29.00

31.00

20.00

22.00

24.00

26.00

28.00

30.00

32.00

34.00

36.00

PreAmp試薬を用いたサイトカイン関連遺伝子の発現解析

（まとめ）

リアルタイムPCRでの

RNAi効果の検証

未処理

siRNA-HPRT

リアルタイムPCRでのsiRNA効果測定

18s rRNA遺伝子の発現量

未処理、siRNA-HPRT

HPRT遺伝子の発現量

siRNA処理でおよそ２サイクルの変化あり。

18s rRNAで発現比較を行ったところ、

およそ80%のKnock downを確認。

For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

TaqMan®_{MicroRNA Assay:}

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