↑ 蛍

光 強 度

PCRサイクル数→

TaqMan

^®

-MGBプローブでは

レポーターの蛍光色素のみを検出できる

R

DNA TemplateはcDNAを

Total RNAでの質量を元に利用

反応組成の一例

/well Final

TaqMan Universal PCR Master Mix (2x) 25

μ

L 1x

10

μ

M Forward Primer 4.5

μ

L 900nM

10

μ

M Reverse Primer 4.5

μ

L 900nM

10

μ

M TaqMan Probe 1.25

μ

L 250nM

Template (cDNA 10ng/

μ

L) 5

μ

L 50ng

d3W 12.75μL

Total 50

μ

L

TaqMan

アッセイでの反応組成 _{逆転写試薬}

AppliedBiosystems, P/N N8080234   TaqMan Reverse Transcription Reagents マスターミックス

AppliedBiosystems, P/N4304437 TaqMan Universal PCR Master Mix

• リアルタイムPCR TaqMan ^® ケミストリの特徴

•

TaqMan

®

プローブが分解されることによって生じる、

蛍光を検出するので、蛍光量がPCR増幅を反映する。

•

Primerペアだけの設定よりも配列特異性を高める事ができる。

•

2種類の蛍光を用いて2Probeアッセイを行え、

サンプルの有効利用やコストダウンが可能である。 

•

SNPタイピングが可能である

•

低発現遺伝子測定の際のバラツキを低減できる。

特徴

•

DNAにインターカレートして、

蛍光を発する蛍光物質SYBR

®

Green I の 存在下でPCRを行い、

すべての2本鎖DNAを検出する。

•

PCR産物の定性的な検知が可能 注意

•

PCR Primerの配列には充分な注意が必要。

•

Primerの濃度に注意が必要。

•

プライマーダイマー由来の蛍光が生じる。

•

non-specificアニーリング由来の蛍光が生じる。

•

蛍光量と反応産物量の比が必ずしも１：１ではない。

SYBR

^®

Green I アッセイ

PCR反応終了

PCR反応スタート PCR反応が進み、増幅産物が増えると、

SYBR

^®

Green の蛍光量も増加する

ATATATAT

TATATATA 120bp

1  目的バン ド

2  Prim erダイ マ ー 3  ス メ ア ー

4  非特異的バン ド

ATATATAT

PCR反応で 増幅 互いに結合

DNA Polim eraseが認識

1 2 3 4

SYBR ^® Green

ケミストリ使用時には

Primer

の設計に注意が必要である

Primerの設計での注意や「反応条件の最適化」が必ず必要

SYBR Green 反応液組成

No template control

で、プライマーダイマーができない条件等を 複数検討することが必要です。

DNA TemplateはcDNAを

Total RNAでの質量を元に利用 反応組成の一例

/well Final

SYBR Green PCR Master Mix (2x) 25

μ

L 1x

10

μ

M Forward Primer xx

μ

L 50-900nM

10

μ

M Reverse Primer xx

μ

L 50-900nM

Template (cDNA 10ng/

μ

L) 5

μ

L 50ng

d3W xx

μ

L

Total 50μL

SYBR Green

アッセイでの反応組成

逆転写試薬

AppliedBiosystems, P/N N8080234   TaqMan Reverse Transcription Reagents マスターミックス

AppliedBiosystems, P/N 4367659 Power SYBR Green Master Mix

★非特異的産物の生成の確認（Dissociation Curveの作成) 一見、高コピー領域で定量できているように見受けられるが、

全てのサンプルにおいて非特異的産物が生成している。

⇒ 定量性に非常に大きな疑問

4倍希釈（8段階）

SYBR

^®

Green PCR Assay 正確な定量結果を得る為に

非特異的産物？

プライマーダイマー？

NTC

リアルタイム定量PCRの解析法

• 内在性コントロールによるサンプル間の補正

• 検量線を用いない新しい比較定量方法

リアルタイム

PCR

による定量法の例

（内在性コントロールで相対値で比較）

希釈率で検量線を作成して比較する方法

5

10

0.3

36 hrs 3.0

４ ２ １

比較結果

（０ｈｒｓを１として）

８ 0.3

24 hrs 2.4

４ 0.25

12 hrs 1.0

２ 0.1

0 hrs 0.2

標準化 (p53/GAPDH) 内在性コントロール  

遺伝子発現量（GAPDH）

標的遺伝子発現量

（p53）

サンプル

p53の発現量

1 2 3 4 5 6

p53の発現量

Comparative C

_T

法

     1サイクルの検出の違いで、2倍量の差であるという理論を 活用して算出する方法

       

   ２

^-⊿⊿ＣT

＊検量線作成が不要なので、多サンプルを処理できる＊

⊿⊿C

_T

法の成立する条件

１、 ターゲット遺伝子と内在性コントロール遺伝子のPCR効率がほぼ等しい 希釈によって∆C

_T

値が変動しない=検量線を描いた時の傾きが同じ ２、 PCR効率が１に近い

設計のガイドラインに基づくとPCR効率の良い 短いPCR産物のサイズで設計ができる

リアルタイムPCRによる定量法の例（比較定量法）

検量線を作成せずに比較定量する方法

16.5 37 5.6

1

相対比

c-mycの発現比較

（GAPDHで 補正）

2

^4.05

=16.5 2.81-6.86

= -4.05 25.83-23.01

=2.81 23.01

25.83

Ｌｕｎｇ

ドキュメント内 リアルタイムPCRでの 解 析 は 年 々 増 加 ここ 数 年 はRNAi microrna DNAアレイ 解 析 等 での 報 告 が 多 い R (ページ 36-47)