Pre-made アッセイが沢山ある時の例①
Pre-made アッセイが沢山ある時の例② -a
Assay IDの数字が一番大きい
→最新のアッセイ 対象となる配列数が最も多い
→網羅的に検出することが可能
このように最新のアッセイの対象とする配列数が多くない場合
→全てのバリアントを検出することができない可能性が高い
Pre-made アッセイが沢山ある時の例② -b Map View
Hs00249794_m1 :
NM_016724
のみ検出可能Hs00357143_g1 :
全ての
Splicing Variant
の検 出可能、しかし“g”
なのでgenomic DNA
由来の増幅の 可能性ありHs00360501_m1 : HM_016724
及びNM_016730
の2
つのValiant
のみ検出可能Hs00249794_m1
Hs00357143_g1
PreAmp Master Mix
TaqMan PreAmp Master Mix
• リアルタイム PCR に用いるｃ DNA を増幅させる試薬。
• TaqMan Gene Expression Assays と共に利用。
SYBR や自家設計の Primer は非対応。
• 最大 100 遺伝子までをマルチプッレクス PCR で増幅。
• その後、希釈してリアルタイム PCR を実施。
• 「ｃ DNA 足りていますか？」
• 「解析するべき遺伝子が多数あるが、ｃ DNA が足りない」場合に最適
• 臨床検体・レーザーマイクロダイセクションサンプルから大量の遺伝子解析が 可能
• 発現量が少ない遺伝子の増幅をさせるものではない。
通常のリアルタイム
PCR
サンプル（組織・細胞）
↓ RNA
抽出RNA
↓逆転写反応（ RT) ｃ DNA
↓リアルタイム PCR
（10ng/tube) 発現解析結果
(1 遺伝子）
PreAmp
を用いたリアルタイムPCR
サンプル（組織・細胞）
↓ RNA
抽出RNA
↓逆転写反応（ RT) ｃ DNA
↓ PreAmp
（10
もしくは14
サイクル↓（ 10ng/tube)
希釈（ 5 倍もしくは 20 倍）
↓リアルタイム PCR 発現解析結果
(50 遺伝子、もしくは 200 遺伝子解析）
TaqMan PreAmp Master Mix
• 商品構成（ 1 キットに２種類の試薬を含みます）
• Pre − PCR を行いマルチプレックスで遺伝子増幅。
• 増幅後に個別のリアルタイム PCR で検出
• 増幅させるサンプル数： 40 検体
–
通常のTaqMan Universal PCR Master Mix付属» 20 μ L の反応系（ 96Well プレート）で 500 反応分
» 50 μ L の反応系（ 384Well プレート）で 200 反応分
TaqMan PreAmp Master Mix
• ｃDNA足りていますか？
• リアルタイムPCRの場合は1サンプルあたり10-100ngのｃDNAが必要。
• サンプルが微量な場合は解析できる遺伝子が数種類しか出来ない。
ｃ DNA が少ないので
2 遺伝子しか研究できない・・・
cDNA を PreAmp したので、
20 遺伝子を研究できる！
TaqMan PreAmp Master Mix
• 均一にバイアスをかけることなくマルチプレックスPCRを行う。
• 最大100PlexまでPre-PCR反応する事ができる。
• 10サイクル：およそ1,000倍、50反応
• 14サイクル：およそ10,000倍、200反応
• RIN9.0もRIN7.4も同様の結果を得る。デグラしたRNAでも可能
• 18s rRNAを含むPrimerセットではマルチプレックス不可
• 3ng/well cDNAで測定時にCtが35より早い遺伝子に対応
• CDKN1B遺伝子をコントロールに推奨
リアルタイムPCRに用いる目的のサンプル数にあわせてPreAmp試薬での増 幅サイクルを10サイクル、もしくは14サイクルに設定することにより必要とする サンプル数に対応した溶液を得ることができます。（下図参照）
通常は10サイクルでのPre-PCRを推奨。
スタート時の ｃDNA量
PreAmp試薬での 増幅サイクル数
PreAmp後の 希釈割合
リアルタイムPCRに 利用できるサンプル数
1-250ng 10 1：5 50
14 1：20 200
PreAmp
試薬を用いたサイトカイン関連遺伝子の発現解析• 使用したサイトカイン関連遺伝子 Assay
• 24 種類（右表参照、ラボにあるストックを利用）
• 15 種類：評価可能な発現量あり。
• 9 種類：今回用いたサンプルでは発現なし
（ Ct が 35 以降で、 PreAmp の評価の対象外）
• 内在性コントロール： CDKN1B
• 使用したサンプル（ラボにストックのあるｃ DNA を利用）
• Raji cDNA (B-lymphocyte; Burkitt's lymphoma)
• Universal Human Reference cDNA as Control.
• Total cDNA amount: 810ng for No PreAmp
• Total cDNA amount: 125ng for PreAmp
Gene Expression
CCR1 OK
CCR2 OK
CCR4 OK
CCR5 OK
CDK4 OK
MDC OK
TGF beta OK
IFN ganma Not Expressed
TNF alfa OK
TNF beta Not Expressed
MCP-1 OK
CD23 OK
CD25 Not Expressed
CD69 OK
IL-2 Not Expressed IL-3 Not Expressed
IL-4 OK
IL-5 Not Expressed
IL-7 OK
IL-10 OK
IL-13 Not Expressed IL-17 Not Expressed IL-18 Not Expressed
CDKN1B OK
PreAmp前
PreAmp後
遺伝子
平均Ct値 No PreAmp
平均Ct値 PreAmp
平均Ct値の差分 (No PreAmp) - (PreAmp)
1 28.47 22.11 6.36
2 25.37 18.66 6.71
3 22.29 15.91 6.39
4 27.87 19.63 8.24
5 22.99 16.26 6.73
6 24.20 17.62 6.57
7 33.81 30.23 3.59
8 25.26 18.43 6.83
9 26.67 19.76 6.92
10 28.37 21.39 6.98
11 32.77 26.03 6.75
12 24.36 17.31 7.05
13 27.47 20.88 6.59
14 24.73 18.24 6.49
15 26.07 19.68 6.39
16 28.41 21.76 6.66
17 27.87 21.41 6.46
18 23.96 17.15 6.82
PreAmp
試薬を用いたサイトカイン関連遺伝子の発現解析（まとめ）
y = 1.1234x - 9.8823 R
2= 0.9523
15.00 17.00 19.00 21.00 23.00 25.00 27.00 29.00 31.00
20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00
PreAmp
試薬を用いたサイトカイン関連遺伝子の発現解析（まとめ）
リアルタイム PCR での
RNAi 効果の検証
未処理
siRNA-HPRT
リアルタイムPCRでのsiRNA効果測定
18s rRNA遺伝子の発現量
未処理、siRNA-HPRT
HPRT遺伝子の発現量
siRNA処理でおよそ２サイクルの変化あり。
18s rRNAで発現比較を行ったところ、
およそ80%のKnock downを確認。
0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20
NC#1 siRNA-HPRT
ドキュメント内
リアルタイムPCRでの 解 析 は 年 々 増 加 ここ 数 年 はRNAi microrna DNAアレイ 解 析 等 での 報 告 が 多 い R
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