昭和大学藤が丘病院小児科

繰り返す凍結および解凍が長期間保存された  造血細胞移植用臍帯血の品質に与える影響の検討

昭和大学藤が丘病院小児科

外山 大輔^＊  山本 将平  小金澤征也 

金子 綾太  秋山 康介  池田 裕一 

  磯山 恵一

抄録：非血縁臍帯血移植は近年移植数が増加しているが，その欠点としてドナーリンパ球輸注 などの細胞治療を行えないことがある．以上より，臍帯血の一部から T 細胞を増幅培養して，

輸注する細胞治療が考案されてきた．通常，移植時に解凍した臍帯血の一部を用いるが，培養 開始時期を選択できないといった問題がある．いったん解凍した臍帯血の一部を再凍結してこ れらに用いることが可能であれば使用時期を容易に選択できる．本研究では，長期間保存され た移植用臍帯血を用いて，繰り返しの凍結および解凍が造血能などの品質に与える影響につい て検討した．10 年以上長期保存された移植用臍帯血で品質の検討後に，その残検体を再凍結 し 6 年以上保存された 18 検体を対象とした．初回凍結前（PF），初回解凍後（PT1）および 再解凍後（PT2）の総細胞数，CD34 陽性（CD34＋）細胞数，顆粒球マクロファージ由来コロ ニー数（CFU-GM），生細胞率，CD34 陽性かつ CD38 陰性（CD34＋/CD38

−

^{）細胞の割合，}

CD34 陽性かつ CXCR4 陽性（CD34＋/CXCR4＋）細胞の割合を測定した．総細胞数，CD34＋

細胞数，CFU-GM 数は PT1 で各々 5.47

±

^2.14

×

^{108個，0.66}

±

^0.33

×

^{106個，1.96}

±

^1.32

×

^106個，

PT2 で 各 々 5.31

±

2.12

×

10⁸個，0.60

±

0.34

×

10⁶個，1.27

±

0.52

×

10⁶個（p＝0.45，p＝0.33，

p＝0.69）であり PT2 は PT1 と比較していずれも有意差を認めなかった．生細胞率，CD34＋/

CD38

−

細胞率，CD34＋/CXCR4＋細胞率は PT1 で各々 83.7

±

9.45％，9.11

±

4.13％，81.65

±

10.82％，PT2 で各々 64.45

±

^{8.0％，10.22}

±

3.76％，76.79

±

8.36％ （p ＜ 0.01，p＝0.16，p＝0.09）

であり，PT2 の生細胞率は PT1 と比較して有意に低値であった．今回の検討から生細胞率を 除いて，繰り返す凍結および解凍が長期保存された移植用臍帯血の品質に与える影響がないこ とが示唆された．生細胞率が有意に減少していた理由として，再凍結までの時間が長かったこ とが原因として考えられた．移植時に解凍した臍帯血の一部を速やかに再凍結することで，生 細胞率の低下を防ぐことが可能であれば，再凍結された移植用臍帯血を用いた細胞治療が可能 であると考えられた .

キーワード：臍帯血，造血能，臍帯血移植，再凍結，細胞治療

 非血縁臍帯血移植 （UCBT）はドナーの負担がな く移植細胞源を容易に入手できることから近年移植 数が増加している^1‑3）．骨髄バンクを利用した非血 縁者間骨髄移植は，ドナー検索から移植細胞の採取 まで最短でも 3 か月以上要し，病期の進行などによ る緊急性のある移植には適さないことがある．その 一方で，臍帯血はドナー検索から 3 週間程の期間で 入手が可能であり，免疫不全症や非寛解の血液悪性 疾患など移植時期の選択が必要な症例において多く

の UCBT が行われている．しかし，UCBT の欠点 として骨髄移植よりも移植細胞数が少ないことが一 因とされる生着不全や， 移植後感染症，悪性腫瘍再 発などに対する追加治療であるドナーリンパ球輸注 

（DLI）が行えないことなどが挙げられる．以上よ り，臍帯血 CD の一部から T 細胞を増幅培養して 輸注する試みが立案されている^4，5）．Miyagawa ら は臍帯血から CD4 陽性 T 細胞を培養増幅し，サイ トカイン産生能などを解析した結果，臍帯血由来 T 原  著

＊

責任著者

ている．一度解凍した臍帯血の一部を再凍結してこ れらに用いることが可能であれば移植後の細胞治療 において有益であるため，再凍結された研究用臍帯 血の品質についての検討がなされている^8）．本研究 ではより具体的な臨床応用を目指し，長期間保存さ れた移植用臍帯血を用いて，繰り返しの凍結および 解凍が造血能などの品質に与える影響について検討 した．

研 究 方 法

 対象は神奈川臍帯血バンクにおいて 1998 年 4 月 から 1998 年 9 月の間に調製保存され，保存期間が 10 年以上経過したため公開検索情報から削除され た移植用臍帯血 18 検体である．これらの検体は 2008 年 9 月に解凍後，品質の検討がなされ 10 年間経過 しても品質が維持されていることが確認された^9）． 解凍された移植用臍帯血の一部を再凍結し，2015 年 9 月にこれらを再解凍し，繰り返しの凍結および 解凍が造血能などの品質に与える影響について検討 した．

 臍帯血は造血細胞移植用として凍結保存されてお り採取にあたっては対象妊婦に対して文書で説明し 同意を得た．本研究の実施は昭和大学藤が丘病院臨 床試験委員会によって承認（承認番号 2014107）を 得 て い る． 初 回 凍 結 前（PF） は 総 有 核 細 胞 数，

CD34 陽性（CD34＋）細胞数，顆粒球マクロファー ジ由来コロニー（CFU-GM）数を測定し， 初回解凍 後（PT1）および再解凍後（PT2）は上記に加え，

生 細 胞 率，CD34 陽 性 か つ CD38 陰 性（CD34＋/

CD38

−

）細胞の割合，CD34 陽性かつ CXCR4 陽性

（CD34＋/CXCR4＋）細胞の割合を測定した．これ らの結果より，繰り返しの凍結および解凍が長期間 保存された移植用臍帯血における造血機能に与える 影響を検討し，再凍結された移植用臍帯血が細胞治

され胎盤が娩出される前）に採取を行った．採取 時，臍帯をポピヨンヨード液で消毒後に臍静脈を穿 刺し，抗凝固剤として 28 ml の citrate-phosphate- dextrose を含んだ 200 ml の臍帯血採取専用バッグ 

（CBS-20A; Nipro Co, Osaka, Japan） に自然落下式 に採取した .

 2．臍帯血ユニットの調製および保存

 臍帯血の調製保存には Rubinstein らの方法を 用いた^10）．即ち，抗凝固剤入りの臍帯血に 6％の hydoroxyethyl starch （HES40; Nipro Co）を 1.5％

の最終濃度になるよう添加し，10℃，5 分間 600 g で遠心分離し有核細胞血漿を回収した．10℃，10 分間 400 g で遠心後，血漿成分を除き，有核細胞浮 遊液として 23 ml になるよう調製した．凍結直前に Dimethyl sulfoxide （DMSO ; Cryoserv ; Edwards  Lifesciences, Irvine, CA, USA） 濃度が 10％，Dextran  40 （Terumo, Tokyo, Japan）が 1％となるよう細胞 浮遊液にゆっくり添加し混和，移植用臍帯血  とし て 25 ml を凍結バッグ （F-025; Nipro Co）に注入し た．凍結バッグをアルミニウムキャニスター（以下，

キャニスター）収納し，プログラムフリーザー

（Sanyo Electric, Tokyo, Japan）で凍結後，

−

195℃

液体窒素タンクに移し保存した． プログラムフリー ザーによる凍結速度は以下のとおりである．すなわ ち

−

^4℃まで

−

3℃ / 分で冷却し 5 分間の保冷後

−

1℃ / 分で

−

50℃へ，その後，

−

5℃ / 分で

−

80℃

まで凍結し液体窒素入りタンクへ搬入した .  3．臍帯血の解凍

 液体窒素タンクから当該臍帯血バックに収納され たキャニスターを用手的に搬出し，凍結バックを 37℃恒温槽に 5 分以内静置し解凍した .

 4．検体の採取

解凍の後，臍帯血バックは室温静置し緩徐に混和し た．凍結バックは 70％アルコールを含んだ不織布

で清浄したのち 18G 針付き注射筒で 3 ml を採取，

造血機能測定用に使用した．

 5．臍帯血の再凍結

検体採取後の残検体は凍結バッグに入れたままキャ ニスター収納し，初回と同様 Rubinstein らの方法 で再凍結した．解凍から再凍結開始までの時間は 40 分に設定した .

 6．臍帯血の再解凍と検体採取

各検体の再解凍は，3 と同様の手順で液体窒素タン クから用手的に搬出し，37℃恒温槽に 5 分以内静置 し再解凍した．その後 4 と同様の手順で再解凍後の 検体を採取した．

 7．有核細胞数測定と総細胞数の算定

 有核細胞数は凍結前，解凍後および再解凍後速や かに自動血球計数装置 （Sysmex 2100; Towa，Kobe,  Japan）で測定した．総細胞数の算定は以下のとお りである．総細胞数（個）＝［（有核細胞数／µl）

×

25

×

^106］

 8．生細胞率の測定 （Fig. 1）

 0.2％トリパンブルー染色法を使用し死細胞数を 計測した．単核球分画から CD45 陽性細胞を選択し 

（1），7-AAD と CD34 でゲートされる死細胞数 （2）

（3）を差し引き，生細胞数を算出した．生細胞率算 定は以下のとおり行った．生細胞率（％）＝生細胞 数 / 有核細胞数

×

100

 9．Flow cytometry

 CD34＋細胞数の測定は以下のとおりである．抗 体試薬として抗 CD45 抗体 （FITC），抗 CD34 抗体

（PE）をそれぞれ 10 µl （BD Biosciences, San Jose,  CA, USA）と Via-Prove （7-AAD） （BD Biosciences） 

10 µl を染色ビーズ （Beckman Coulter, Brea, CA,  USA） を含む Trucount tubes （BD Biosciences）に 添加した．次に室温，暗所で検体 50 µl を加え混和 し，15 分間静置後に赤血球溶血剤 1 ml を加え，混 和し，5 分間静置後に FACS Calibur （BD Pharmingen,  San Diego, CA, USA）で測定を行い，Cell Quest

（BD Biosciences） で 解 析 を 行 っ た．International 

Fig. 1 Representative flow cytometry dot plots show the dead cells （2） （3）.

Society of Hematotherapyand Graft Engineering

（ISHAGE） のガイドラインに従い CD45＋細胞を ゲ ー ト し， そ の う ち CD34＋ 細 胞 を 算 定 し た^11）． CD34＋細胞数は以下のように計算し算出した．

CD34＋細胞数＝CD34＋細胞数/µl

×

テストチュー ブあたりのビーズ数

×

^{ビーズ数希釈因子}

×

^検体量

（50 µl）．

 CD34＋CD38

−

細胞，CD34＋CXCR4＋細胞の測 定は以下の通りである．検体 50 µl に抗体試薬とし て抗 CD

−

34 抗体 （PE） （8G12, Becton‒Dickinson,  San Jose, CA, USA），抗 CD38 抗 体 （APC） （T16,  Becton-Dickinson）， 抗 CD45 抗 体（FITC） （BD  Biosciences, San Jose, CA, USA），抗 CXCR4 抗体 

（Per-Cp） （12G5, Becton-Dickinson, San Jose, CA,  USA）を加え混和し，室温，暗所で 15 分間静置後 に 赤 血 球 除 去 を 行 い，phosphate-buffered saline 

（PBS）で二度洗浄を行った．同様の操作で抗 CD34 抗体 （PE），IgG2a （FITC） を用いてコントロール 検体を作製した．ISHAGE 法で CD34＋細胞をゲー ト し， 同 分 画 か ら 直 接 CD38 陰 性 （ ％） お よ び CXCR4 陽性 （％）を測定した .

 10．CFU-GM 数測定

 MethoCult 培養液 （MethoCult GFH4434V; Stem  Cell Technologies, Vancouver, BC, Canada）を使用 し，CFU-GM 数 を 測 定 し た． す な わ ち， 培 養 液 1 ml 入り 35 mm プラスチックペトリ皿に 5

×

¹⁰⁴ 個の有核細胞を分注，攪拌し，100％湿度，37℃，5％

CO2培養器に孵置した．

 培養 10 〜 14 日後に倒立顕微鏡下で CFU-GM 数 を算定した．総 CFU-GM 数は以下のとおり算定し た．総 CFU-GM 数（個）＝CFU-GM 数

×

［総細胞数／

5

×

^104］  11．統計解析

 PF, PT1, PT2 （CFU-GM 数のみ PT2 の 2 時間後，

6 時間後）の各項目の平均値

±

標準偏差（SD）を 測定し，各ポイントについて反復測定分散分析を用 いて比較検討を行った．生細胞率，CD34＋/CD38

−

細胞，CD34＋/CXCR4＋細胞率は PT1, PT2 の 2 ポ イントの測定であり，対応のある t 検定を用いて比 較検討した．p ＜ 0.05 を有意水準とし，解析には JMP^Ⓡ 11 （SAS Institute Inc, Cary, NC, USA）を使 用した．

結  果  1．凍結期間

 臍帯血採取後の凍結期間は以下のとおりである．

初回解凍までの期間 10

±

0.22 年，再凍結から再解 凍までの期間は 6

±

0.34 年であった．

 2．総細胞数 （Fig. 2）

 PF, PT1, PT2 の総細胞数の平均値は，各々 6.16

±

2.35

×

10⁸ 個，5.47

±

2.14

×

10⁸ 個，5.31

±

2.12

×

10⁸ 個であった．PT1，PT2 の総細胞数は，凍結前に比 較し有意（いずれも p ＜ 0.01）に低値であったが，

PT2 の総細胞数は PT1 と比較して有意差はなかっ た （p＝ 0.46）．

 3．CD34＋細胞数 （Fig. 3）

 PF, PT1, PT2 の CD34＋細胞数の平均値は，各々

Fig. 2 Total nucleated cells （TNC）. ＊ p ＜ 0.01（n＝

18） PF ;  pre-freeze,  PT1 ;  initial  post-thaw,  PT2: second post-thaw 

There were no significant differences inthe numbers  of TNC between PT1 and PT2 （p＝0.45）.

Fig. 3 CD34＋ cells. ＊ p ＜ 0.01 （n＝18）

There were no significant differences inthe numbers 

of CD34 cells between PT1 and PT2 （p＝0.33）.

1.0⁶

±

0.62

×

10⁶個，0.66

±

0.33

×

10個，0.60

±

0.34

×

10⁶個であった．PT1, PT2 の数は，PF に比較し有 意（いずれも p ＜ 0.01）に低値であったが，PT2 の CD34＋細胞数は PT1 と比較して有意差はなかっ た （p＝0.33）．

 4．CFU-GM 数 （Fig. 4）

 PF, PT1, PT2 の CFU-GM 数の平均値は，各々 6.40

±

^2.94

×

^{105個，1.96}

±

^1.32

×

^{105個，1.27}

±

^0.52

×

10⁵個 で あ っ た．PT1, PT2 の CFU-GM 数 は，PF に比較し有意（いずれも p ＜ 0.01）に低値であった が，PT2 の CFU-GM 数は PT1 と比較して有意差は

なかった （p＝0.69）．

 PT2 の 2 時間後，6 時間後の CFU-GM 数はそれ ぞれ 1.05

±

0.55

×

10⁵個，0.77

±

0.35

×

10⁶個であり 減少していたが，PT2 と比較して有意差はなかっ た （それぞれ p＝0.63，p＝0.29）．

 5．生細胞率 （Fig. 5） 

 PT1, PT2 の生細胞率はそれぞれ 83.7

±

9.45％，

64.45

±

8.0％であり，PT2 の生細胞率は PT1 と比 較して有意 （p ＜ 0.01）に低値であった .

 6．CD34＋/CD38

−

細胞率および CD34＋/CXCR4 細胞率 （Fig. 6）

Fig. 4 CFU-GM cells. ＊ p ＜ 0.01 （n＝18）

There were no significant differences inthe numbers of  CFU-GM cells between PT1 and PT2 （p＝0.69）.

Fig. 6

（A） CD34＋CD38 −  cells. （n＝18）

（B） CD34＋ CXCR4 −  cells. （n＝18）

 There were no significant differences inthe numbers of both CD34＋CD38 −  cells and  CD34＋ CXCR4 −  cells between PT1 and PT2 （p＝0.16 and p＝0.09, respectively）.

Fig. 5 Viability. ＊ p ＜ 0.01（n＝18）

The mean basal percentage of viable cells was 

significantly lower at PT2 than at PT1.

ますます増加していくことが予想される．また，移 植後再発，ウイルス感染症などに対する DLI が行 えないという欠点を克服すべく，臍帯血 CD34＋細 胞から T 細胞や間葉系細胞を増幅培養して輸注す る細胞治療が立案されている^4，5）．解凍された臍帯 血を再凍結し，これらの細胞治療に使用できれば治 療開始時期を自由に選択できる .

 われわれの検討では，長期間凍結保存された臍帯 血の総細胞数，CD34＋細胞数，CFU-GM 数のいず れも解凍後は凍結前と比較して有意に低値であっ た．しかし，凍結期間が 1 か月の対照検体において も解凍後に同様の低下が見られたことから長期間凍 結保存された臍帯血の品質は維持されていたと結 論づけている^9）．一方で，再解凍後の総細胞数，

CD34＋細胞数，CFU-GM 数は解凍後と比較してい ずれも有意差を認めず繰り返しの凍結および解凍が これらの項目に与える影響はないと言える．Timeus らは 9 件の研究用臍帯血を用いて 1 か月間隔に合計 3 回の凍結，解凍を行い造血細胞の品質に与える影 響を検討している^8）．われわれの結果と同様に初回 解凍後のこれらの各項目の数値は 2 回目解凍後と比 較して有意差はなかった．CD34＋細胞は造血再構 築を担うのみでなく，T 細胞への分化能を有する細 胞である^4，5）ことから，繰り返す凍結融解で影響が 軽微にとどまったことは前述の細胞療法への利用に 有用な結果となる .

 われわれの検討では再解凍後の生細胞率は解凍後 と比較して有意に低値であった．Timeus らは 3 回 の凍結，解凍後も生細胞率に差がなかったと報告し ており^8），われわれの結果と異なっていた．再凍結 までの時間が長かったこと，再凍結から再解凍まで 5 年以上経過していたこと，凍結速度が異なってい たことなどが要因として考えられる．Huang らも 同様に臍帯血の生細胞率は解凍後の室温放置時間の

らも同様の結果を報告しており ，繰り返しの凍結 および解凍がより未分化な造血幹細胞に与える影響 は少ないと考えられる．再解凍後の室温静置時間が コロニー形成能に及ぼす影響を検討すべく，再解凍 後，再解凍 2 時間後，6 時間後に CFU-GM 数を測 定した．再解凍直後と比較して有意差は認めなかっ たが，時間とともにコロニー形成能が低下してい た．DMSO はコロニー形成能にも影響を与えると されており^18），再解凍後は速やかに使用する，もし くは再凍結することが重要である .

 長期間保存された移植用臍帯血を用いて繰り返し の凍結および解凍が造血能に与える影響についての 検討を行った．再凍結までの時間が長かったが生細 胞率以外の造血能に影響はなかった．生細胞率は T 細胞を増殖培養するために必須であることから^4）， 解凍された移植後臍帯血の一部を速やかに再凍結す ることで生細胞率の低下を防ぐことができれば，こ れらを増殖培養後に細胞治療として使用できる可能 性があると考えた．臨床応用を行うためには，再凍 結の方法や手順についても一定の基準を設けること が必要となり，今回の検討はその一助となり得るも のと考える．

利益相反

 本研究に関し開示すべき利益相反はない．

文  献

1） Ballen KK, Gluckman E, Broxmeyer HE,  .  Umbilical cord blood transplantation: the first  25 years and beyond.   2013;122:491‑498.

2） Laughlin  MJ,  Eapen  M,  Rubinstein  P,  .  Outcomes after transplantation of cord blood  or  bone  marrow  from  unrelated  donors  in 

adults  with  leukemia.   

2004;351:2265‑2275.

3） Rocha V, Labopin M, Sanz G,  . Transplants 

of umbilical-cord blood or bone marrow from  unrelated donors in adults with acute leuke- mia.   2004;351:2276‑2285.

4） Aliyari Z, Soleimanirad S, Sayyah M,  . IL- 2rg  cytokines  enhance  umbilical  cord  blood  CD34＋  cells  differentiation  to  T  cells. 

2015;5 （ Suppl 1 ） :615‑619.

5） 藤原成悦．臍帯血 DLI の実用化と細胞治療の医 薬品化へ向けてのトランスレーショナルリサー チ．平成 20 年度政策創薬総合研究（重点研究・

若手研究者奨励研究）研究報告書．東京: ヒュー マンサイエンス振興財団; 2009. pp309‑318.

6） Miyagawa Y, Kiyokawa N, Ochiai N,  . Ex  vivo expanded cord blood CD4 T lymphocytes  exhibit  a  distinct  expression  profile  of  cyto- kine-related  genes  from  those  of  peripheral  blood origin.  2009;128:405‑419.

7） Berglund S, Gertow J, Uhlin M,  . Expanded  umbilical cord blood T cells used as donor lym- phocyte  infusions  after  umbilical  cord  blood  transplantation.  . 2014;16:1528‑1536.

8） Timeus F, Crescenzio N, Saracco P,  . Re- covery of cord blood hematopoietic progenitors  after successive freezing and thawing proce- dures.   2003;88:74‑79. 

9） Yamamoto S, Ikeda H, Toyama D,  . Quali- ty of long-term cryopreserved umbilical cord  blood units for hematopoietic cell transplanta- tion.  2011;93:99‑105.

10） Rubinstein P, Dobria L, Rosenfield RE,  .  Processing and cryopreservation of placental/

umbilical cord blood for unrelated bone mar- row reconstitution. 

1995;92:10119‑10122.

11） Keeney M, Chin-Yee I, Weir K,  . Single  platform flow cytometric absoluteCD34＋ cell  counts based on the ISHAGE guidelines. Inter- national Society of Hematotherapy and Graft  Engineering. 1998;34:61‑70.

12） Gluckman  E,  Ruggeri  A,  Volt  F,  .  Mile- stones in umbilical cord blood transplantation. 

 2011;154:441‑447.

13） Huang L, Song GQ, Wu Y,  . Optimal length  of time of cryopreserved umbilical cord blood  infusion after thawing.   2014;19:73‑

79.

14） Laroche V, McKenna DH, Moroff G,  . Cell  loss and recovery in umbilical cord blood pro- cessing: a comparison of postthaw and post- wash samples.   2005;45:1909‑1916.

15） Regan DM, Wofford JD, Wall DA.Comparison  of cord blood thawing methods on cell recov- ery,  potency,  and  infusion. 

2010;50:2670‑2675.

16） Bhatia M, Wang JC, Kapp U,  . Purification  of primitive human hematopoietic cells capable  of repopulating immune-deficient mice. 

 1997;94:5320‑5325.

17） Peled A, Petit I, Kollet O,  . Dependence of  human stem cell engraftment and repopulation  of  NOD/SCID  mice  on  CXCR4.  

1999;283:845‑848. 

18） Goldman JM, Th ng KH, Park DS,  . Collec- tion, cryopreservation and subsequent viability  of haemopoietic stem cells intended for treat- ment  of  chronic  granulocytic  leukaemia  in  blast-cell  transformation.   

1978;40:185‑195.

Department of Pediatrics, Showa University Fujigaoka Hospital

 Abstract    Although umbilical cord blood （UCB） is increasingly used for stem cell transplantations 

（SCT）, one of the main disadvantages of this approach is that it makes performing cell therapies, such as  donor lymphocyte infusions, difficult.  Therefore, the expansion of UCB-derived T cells is being consid- ered as an alternative method.  In general,  T cells are expanded from a sample of thawed UCB  during SCT.  However, it is difficult to select appropriate cells for culturing.  The best method of cryopre- serving UCB units for expansion purposes is to refreeze some thawed UCB during SCT and to thaw  them when needed.  The aim of this study was to evaluate the effects of repeated freeze-thaw cycles on  the quality of long-term cryopreserved UCB units.  Eighteen UCB units for SCT that had been cryopre- served for more than 10 years were thawed and analyzed.  These units were then refrozen for more  than 6 years, and the effects of repeated cryopreservation procedures were analyzed.  The UCB units  were thawed to allow assessments of the numbers of total nucleated cells （TNC）, CD34＋ cells, CD34＋

CD38

−

  cells,  and  CD34＋CXCR4＋  cells ;  colony-forming  unit-granulocyte/macrophage （CFU-GM） 

counts; and cell viability rates at three points: pre-freeze, the initial post-thaw （PT1）, and the second post- thaw （PT2）.  There were 5.47

±

2.14

×

10⁸, 0.66

±

0.33

×

10⁶, 1.96

±

1.32

×

10⁶ TNC, CD34＋ cells, and CFU- GM at PT1 and 5.31

±

2.12

×

10⁸, 0.60

±

0.34

×

10⁶, 1.27

±

0.52

×

10⁶ of these cells at PT2  （p＝0.45, p＝0.33,  and p＝0.69, respectively）.  There were no significant differences in the numbers of TNC, CD34＋ cells,  or CFU-GM between PT1 and PT2.  The mean basal percentages of viable cells, CD34＋CD38

−

 cells,  and CD34＋ CXCR4

−

 cells were 83.7

±

9.45, 9.11

±

4.13, and 81.65

±

10.82％ at PT1 and 64.45

±

8.0, 10.22

±

3.76, and 76.79

±

8.36％ at PT2 （p ＜ 0.01, p＝0.16, and p＝0.09, respectively）.  The mean basal percentage  of viable cells was significantly lower at PT2 than at PT1.  These results indicate that repeated freeze- thaw cycles do not negatively affect the quality of long-term cryopreserved UCB units for SCT, except in  terms of the viability rate.  The reason for the significantly lower number of viable cells at PT2 was sug- gested to be the longer time to refreezing.  In conclusion, refrozen UCB could be used to devise new op- tions for expansion procedures and for cell therapy, if the viability rates of such products could be  prevented from deteriorating.

Key words:  umbilical cord blood, hematopoietic cell function, cord blood transplantation, refreeze, cell 

therapy

〔受付：6 月 18 日，受理：7 月 12 日，2016〕