薬剤耐性菌感染症治療薬の探索研究

論 文 内 容 の 要 旨

ペ ニ シ リ ン の 発 見 以 来 、多 く の 抗 菌 薬 開 発 に よ り 、感 染 症 に よ る 死 亡 率 は 低 下 し た 。し か し 、 高 齢 化 社 会 に 伴 い 、 近 年 、 肺 炎 が 死 亡 原 因 の 第 3位 と な り 、 感 染 症 治 療 は 医 療 現 場 で の 重 要 性 が 増 し て い る 。ま た 、薬 剤 耐 性 菌 に よ る 感 染 症 の 治 療 は 困 難 な 場 合 が 多 く 、新 規 感 染 症 治 療 薬 の 開 発 が 望 ま れ て い る 。本 研 究 で は 、薬 剤 耐 性 緑 膿 菌 お よ び メ チ シ リ ン 耐 性 黄 色 ブ ド ウ 球 菌 （ MRSA） に 着 目 し 、 こ れ ら の 感 染 症 に 有 効 な 治 療 薬 の 創 製 を 目 的 に 新 規 ア ミ ノ グ リ コ シ ド 系 抗 菌 薬（ AG薬 ）お よ び メ タ ロ β -ラ ク タ マ ー ゼ（ MBL）阻 害 剤 の 探 索 を 行 っ た 。 第 １ 章 新 規 ア ミ ノ グ リ コ シ ド 系 抗 菌 薬 の 探 索 1 ) , 2 ) , 3 ) AG薬 は 、細 菌 の rRNAと 結 合 し 、タ ン パ ク 質 合 成 の 阻 害 に よ り 、抗 菌 作 用 を 示 す 。し か し 、AG薬 は 、細 菌 が 産 生 す る AG修 飾 酵 素 に よ る 不 活 化 を 受 け 、そ の 効 力 が 低 下 す る こ と が 知 ら れ て い る 。特 に MRSAは 、二 機 能 性 酵 素 AAC(6')‒ APH(2")を 産 生 し 、多 く の AG薬 に 対 し て 薬 剤 耐 性 を 有 す る 。AG薬 の 中 で 、ア ル ベ カ シ ン (ABK)は 、AAC(6')‒ APH(2")に 対 す る 高 い 安 定 性 を 有 し 、 抗 MRSA 薬 と し て 使 用 さ れ て い る 。 し か し 、 ABK は 、 AAC(6') ‒ APH(2")お よ び AAD(4',4")を 大 量 に 産 生 す る 一 部 の MRSA株 に 対 し て 、MIC値 が 高 値 を 示 す こ と が 知 ら れ て い る 。 rRNAと の 結 合 力 を 維 持 し 、 こ れ ら の 修 飾 酵 素 に 対 す る 安 定 性 を さ ら に 高 め る こ と が で き れ ば 、広 い ス ペ ク ト ル を 有 す る AG薬 の 創 製 に 繋 が る と 考 え ら れ る 。 そ こ で 本 研 究 で は 、 ABK を リ ー ド 化 合 物 と し た 以 下 の 化 学 修 飾 を 検 討 し 、 AAC(6') ‒ APH(2")に 対 す る 高 い 安 定 性 お よ び 強 い 短 時 間 殺 菌 力 を 有 す る AG薬 の 創 製 に 成 功 し た 。

1-1 化 学 修 飾 の デ ザ イ ン

AG薬 と rRNAと の 共 結 晶 の X線 結 晶 構 造 情 報 か ら 、 ABKの 5位 ヒ ド ロ キ シ 基 は rRNAと の

結 合 に 直 接 関 与 し て い な い こ と が 推 測 さ れ た 。そ こ で 、5 位 ヒ ド ロ キ シ 基 近 傍 の 化 学 修 飾 を 行 っ た 。 化 学 修 飾 の デ ザ イ ン は 、5位 ア ク シ ャ ル 配 置 へ 置 換 基 を 導 入 す る と 、2'' 位 の ヒ ド ロ キ シ 基 が 立 体 的 に 遮 蔽 さ れ 、 AAC(6') ‒ APH(2") に 対 す る 安 定 性 が 増 強 す る と の 作 業 仮 説 に 基 づ い て い る （ Fig. 1）。 1-2 ABK類 縁 体 の 抗 菌 活 性 以 上 の 作 業 仮 説 に 基 づ き 、 5位 ヒ ド ロ キ シ 基 の 付 け 根 炭 素 に ア ク シ ャ ル 配 置 に 置 換 基 （ R）を 導 入 し た ABK類 縁 体 1、5位 ヒ ド ロ キ シ 基 を 除 去 し て ア ク シ ャ ル 配 置 に 置 換 基（ R） を 導 入 し た ABK類 縁 体 2お よ び ABK類 縁 体 2の 4''位 の ヒ ド ロ キ シ 基 を 立 体 反 転 さ せ た ABK 類 縁 体 3を 合 成 し た 。 Table 1に 代 表 的 ABK類 縁 体 1a-3aの 構 造 と そ の 抗 菌 活 性 を 示 す 。

Table 1. Structures and MICs of ABK and ABK derivatives

ABK類 縁 体 1a、 2aお よ び 3aの 抗 菌 活 性 は 、 グ ラ ム 陽 性 菌 お よ び グ ラ ム 陰 性 菌 に 対 す る 最 小 発 育 阻 止 濃 度 （ MIC） で 評 価 し た 。 ABK類 縁 体 1aは 、 予 想 ど お り AAC(6')‒ APH(2") お よ び AAD(4',4")産 生 MRSA株 (S. aureus MF490)に 対 す る 抗 菌 活 性 が ABKよ り も 向 上 す る 傾 向 が み ら れ た 。し か し 、 緑 膿 菌 (Pseudomonas aeruginosa PAO1)に 対 す る 抗 菌 活 性 は 低 下 し た 。こ の 傾 向 は 他 の 置 換 基 を 導 入 し た ABK類 縁 体 1で も 観 察 さ れ た 。こ の 結 果 は 、5位 近 傍 に 極 性 基 が 多 く 存 在 す る た め 分 子 の 極 性 が 変 化 し 、緑 膿 菌 の 菌 体 内 へ の 透 過 性 が 低 下 し た 為 と 考 え ら れ る 。 一 方 、 5位 エ ク ア ト リ ア ル 配 置 の ヒ ド ロ キ シ 基 を 除 去 し て 極 性 を 低 減 さ せ た ABK類 縁 体 2aは 、 S. aureus MF490(MRSA)に 対 す る 抗 菌 活 性 が さ ら に 向 上 し た 。 ま た 、 P. aeruginosa PAO1に 対 す る 抗 菌 活 性 も ABKと 同 等 の 活 性 ま で 向 上 す る こ と が 明 ら か と な っ た 。ABK類 縁 体 3aは 、S. aureus MF490(MRSA) お よ び 、グ ラ ム 陰 性 菌 に 対 す る 抗 菌 活 性 が 、 さ ら に 向 上 す る 傾 向 が 認 め ら れ た 。 1-3 ABK 誘 導 体 3a の 高 次 評 価 O HONH2 HO OH O NH2 HN NH₂ O HO HOO O NH2 H2N 5 2"

R

4" Fig 1 D e s i g n of n e w A B K d e ri v a t iv e s ( A B K : R = H ) O OH H2N NH2 O O H2N NH2 O OH HN O H2N HO A Y X 5 4 B A B X Y 1a CH2OH OH H OH 2a OH H H OH 3a OH H OH H ABK H OH H OH 1a 2a 3a ABK Staphylococcus aureus 209P JC-1 0.25 0.06 0.06 0.06 S. aureus MF490 (MRSA) 32 2 1 64

Escherichia coli NIH JC-2 4 1 0.5 1

Pseudomonas aeruginosa PAO1 8 2 1 2

P. aeruginosa N101 (mexXY of PAO1) NT 0.25 0.25 0.25

3a お よ び 既 存 の AG 薬 を 用 い て 、 AAC(6')‒ APH(2")触 媒 下 の 酵 素 反 応 生 成 物 の LCMS

る 42dは 強 い 阻 害 活 性 と BIPMの 抗 菌 活 性 の 強 い 保 持 効 果 が 観 察 さ れ た 。し か し 、水 溶 解 性 が 低 い 難 点 が あ っ た 。 3O-フ タ ル 酸 誘 導 体 43で は 、末 端 に 脂 溶 性 の 高 い フ ェ ニ ル 基 を 有 す る ア ル キ ル 鎖 を 導 入 し た 誘 導 体 43g が 強 い IMP-1阻 害 活 性 を 示 し た 。 し か し 、43g共 存 下 で 、BIPMの 抗 菌 活 性 は mexAB 欠 損 株 に 対 し て は 強 か っ た が 、mexAB発 現 株 に 対 し て は 低 下 し た 。 43gは 異 物 排 出 ポ ン プ に よ り 排 出 を 受 け や す い 誘 導 体 と 考 え ら れ た 。 一 方 ヒ ド ロ キ シ プ ロ ピ ル 基 を 有 す る 43kは 、IMP-1阻 害 活 性 が 弱 い も の の 、異 物 排 出 ポ ン プ の 影 響 を 受 け に く い こ と が 示 唆 さ れ た 。2級 ア ミ ン を 置 換 し た 誘 導 体 の IMP-1阻 害 活 性 は 弱 く 、ま た 、 異 物 排 出 ポ ン プ の 影 響 を 受 け や す い こ と が 示 唆 さ れ た 。 し か し 、 3級 ア ミ ン 誘 導 体 44eは 、 IMP-1阻 害 活 性 は 低 い も の の 、共 存 下 で 、異 物 排 出 ポ ン プ mexABの 有 無 に 関 わ ら ず 、BIPM の 抗 菌 活 性 を 保 持 す る 効 果 が 観 察 さ れ た 。 44eは 異 物 排 出 ポ ン プ の 影 響 を 受 け に く い こ と が 明 ら か と な っ た 。そ こ で 3級 ア ミ ン 誘 導 体 に つ い て 更 に 構 造 展 開 し た と こ ろ 、フ タ ル 酸 3 位 に 4-ヒ ド ロ キ シ ピ ペ リ ジ ニ ル 基 を 有 す る 45eは 高 い IMP-1阻 害 活 性 を 示 す こ と を 見 出 し た 。 ま た 、 45eは 、 IMP-1産 生 緑 膿 菌 に 対 す る BIPMの 強 い 抗 菌 活 性 を 保 持 し 、 水 溶 解 性 に も 優 れ て お り 、 IMP-1阻 害 剤 と し て 優 れ た プ ロ フ ァ イ ル を 有 し て い る こ と が 確 認 さ れ た 。

2-3 3N-フ タ ル 酸 誘 導 体 45e の 高 次 評 価

IMP-1と 45eの 複 合 体 の X線 結 晶 構 造 解 析 を 行 っ た 。 こ の 解 析 結 果 を も と に 、 フ タ ル 酸 3 位 と 6位 へ 4-ヒ ド ロ キ シ ピ ペ リ ジ ニ ル 基 を 導 入 し た フ タ ル 酸 誘 導 体 67を 合 成 ・ 評 価 し た 。

67の IMP-1阻 害 活 性 は 45eと 比 較 し 、約 10倍 向 上 す る こ と を 確 認 し た 。し か し 、67共 存 下 で

の IMP-1産 生 緑 膿 菌 に 対 す る BIPMの MICは 、45e共 存 下 で の MIC値 と 同 等 で あ っ た 。そ こ で 、

45eを 開 発 候 補 化 合 物 と し て 選 択 し 、45e共 存 下 で 、β -ラ ク タ ム 系 薬（ CAZ、MEPM、お よ

び BIPM） の IMP-1産 生 緑 膿 菌 （ 臨 床 分 離 株 ） 14株 に 対 す る 感 受 性 分 布 試 験 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、 単 剤 で の 抗 菌 活 性 と 比 較 し 、す べ て の 薬 剤 で 抗 菌 活 性 が 向 上 し た 。中 で も 、BIPMと の 組 み 合 わ せ が 最 も 好 ま し い こ と が 明 ら か と な っ た 。

結 論

以 上 、 ABK の 4"位 お よ び 5 位 の 水 酸 基 を 立 体 反 転 さ せ た 3a は 、 AAC(6')‒ APH(2")に 安 定 で あ り 、 緑 膿 菌 お よ び MRSA の 臨 床 分 離 株 に 対 し て 強 い 抗 菌 活 性 を 示 す こ と を 明 ら か に し た 。ま た 、HTS で 見 出 し た リ ー ド 化 合 物 A の 合 成 展 開 に よ り 、菌 体 内 へ の 薬 物 透 P.aeruginosa KG5002/ pMS363 mexAB P.aeruginosa PAO1/ pMS363 mexAB(wild type) 42b R= 1.00 ≦0.5 2 42d R= 1.50 ≦0.25 1 43g R= 1.70 0.5 64 43k R= 21.4 16 16 44e R= 94.5 4 4 45e R= 2.70 ≦0.25 1

過 性 な ど で 優 れ た 物 理 化 学 的 特 性 を 有 す る MBL(IMP-1)阻 害 剤 45e の 創 製 に 成 功 し た 。 45e は 、 IMP-1 産 生 緑 膿 菌 に 対 し て 、 β -ラ ク タ ム 系 薬 と 共 に 使 用 す る と 、 β -ラ ク タ ム 系 抗 菌 薬 の 抗 菌 活 性 を 保 持 す る 機 能 を 有 す る こ と が 明 ら か と な っ た 。 本 研 究 で 得 ら れ た 知 見 は 、MRSA お よ び 耐 性 緑 膿 菌 に 対 す る 治 療 薬 の 新 し い 選 択 肢 の 一 つ を 提 供 す る も の で あ り 、 学 術 的 な 意 義 を 有 す る と も の と 考 え て い る 。 【 研 究 結 果 の 掲 載 誌 】

1) Heterocycles (2007), 71(8), 1715. 2) Bioorg. Med. Chem. Lett. (2007), 17, 3540. 3) Bioorg.