書 ) 謂 孟蔓聖霊 雷雲 撃品 讐空 (雷雲志

金 沢 大学 十全医学 会 稚 誌 第88巻 第2 ^･ 3号 4 21 ^‑4 51 (1 9 7 9)

腫瘍 細 胞^の変 性 過 程^の研究

一 胸 ^｡ 腹 水 中^{の ヒ}ト臆 瘍 細 胞の変 性 過 程 ^一

金 沢 大学 大 学^院医学研 究科内科 学 第三講座 ( 主 任^: 服 部 絢^一教 授)

三 田 村 英

(雷雲志謂孟蔓聖霊芸雷雲^王守撃品書讐空空^{地学会総会 お よび昭和5 4年 第2 附})

細胞診^では, 各 種臓器 か ら^の生 検塗沫や内視鏡直 視 下擦過 法等の検 体 採取 法^の進 動こと も な^い比較 的に新 鮮な状態^の細胞を採取, 観 察す る機会が多く な り^. 腫

の po oI s m e a r や嗜 癖な どの変 性し た細胞を対象にし

た P^apa nic ola o uH の ^"c rite ria of m align a n cy

l 一 のみ

では 律 し き れ な^い細胞の存在が注目 さ れ^. 新鮮な細 胞

の所見 を加 味し^た悪性 判 定基 準の再検 討が行な わ れて い る^2曲.

一 方^, 主に婦 人科領 域では集団 検診^の普及によ り細

胞 診の自 動化に関す る 研究も 進 め ら れて いる^4削. 集団 検 診では検 体^の採 取仁標 本作 製の過程な ど か ら変 性を と も な^っ た細胞を扱うこと が多く細 胞^の変 性過程^の検 討 が 必要であ る. ま た自 動 化細胞 診で は 悪性^の最 も有 力な情 報を^.細胞のD N A 量 や核 構 造^に求めてお り^,変 性過程^{で の}D N A 量^の変 化と形態 学 的 変 化^との比較 検 討も 必要であ る.

細胞^の変 性過 程 を 形 態学的に観 察し た報 告は多^い が^. D N A 量^の変化^につ い て の報 告は 比較 的^に少ない.

さ らに, 形態学的 所 見と D N A 量 を 比較 検 討し た報告 は Le u ch^te nbe rge r^{6 )}, A lfe rt^{7 )}, Be r e nbo m ら^{8 )9l}

,C ha ng ら^{川 J} , Ve ndr ely ら^IHお よ び吉田^一2)らの も^の をみ るにす ぎ ない . し か も^{. こ}れ ら はいず れ も動物 材 料^の一 種類の細胞^{につ い て の}検討であ り, ヒ ト の数 種 類^の細 胞につい て比較 検 討^{し た}報 告は み ら れ な^い.

体腔 液^の細 胞診 は 現在 広く行な わ れ^, 診断^, 治療 効 果^の判定な どに役立^って いる が, 胸 ^● 腹 水 中の細胞の

変性^につい ては 谷 田^‖トの報告 を み るにす ぎ な^い. ま た 細 胞^の生死の判定は^, 最近^の臓器 移 植 や^それに と も な う臓 器や細胞の保 存. 薬剤の効果 や副 作用^の検 討, さ らには免疫学的機 序の解明 な ど極めて広汎 な領 域で利用 さ れ^. 判定には色素 排 泄能. 運動 機 能, 代 謝 徳性. 成 長能な^い し は 移 植能な ど が 用 ^いら れて い る^刷､l引

421

細胞はそ の変 性過程におい て, ま ず細 胞 分裂, 高 分 子物 質 合 成 能^. 色素 排 泄 能な ど^の機能^を失ない, 次い で形 態学 的 変化 を来た し, その後D N A 巌の減 少を み ると さ れて いる^{== 鋸}

本実 験で は, 胸^･ 腹 水 申の豊 膿 細胞^{お よ び}腫 瘍 細 胞

の変性過 程で の機能あ る^いは 形態の変 化を知る た め に, 細 胞^の生死 の 判 定^に は色 素 排 泄 能お よ び

a uto r ad iogr aphy 法によ る細 胞 分裂 能と高分 子 物 質 合成 能^の検 討を行ない, 以後の変 性過程^では 形態 学 的 変 化 と D N A 量^の変化 を対比検 討し た.

実 験 材 料

本実 験^に使用 し た 胸 ^･腹 水は,昭 和5 1 年5月か ら昭 和5 3 年 5 月 まで に金 沢大 学医学 部 附属 病 院に入 院し^, 胸 ^｡腹 水^の細 胞 学 的 検索お よ び病理組 織 学的^に診 断 が 確 定 し^, 採取 前^に放 射線 治 療や抗腫 瘍 剤^{. ホル モン}剤 な ど^の投 与の行な わ れて いない こと を 確 認でき た計7 症 例 を 選 び採取 し た^. そ の内 訳は, 腺がん2 例 ( 胃 原 発分化型腺が ん^の腹 水. 2 例 )^. 扁平 上 皮がん2 例(子 宮 原 発 低分化 型扁平 上皮が ん^の腹 水^, 1 例^, 肺原 発分 化 型扁平上 皮がん の胸 水^. 1例), 小 細 胞が ん 1 例( 肺 がん の胸 水), 細 綱 肉 腫症1例 ( 系統 的リ^{ン パ}節 腫^の胸 水) お よ び欒膜 細胞^の観 察のた めの肝 硬変症 1 例(腹 水) ^であ る^,

実 験 方 法

Ⅰ^. 細 胞死^の観察 1. 色素排 泄 能

採 取直 後の胸 ^･ 腹 水および試験管内で 37⁰c, 2 0⁰C および 4⁰C に可 及的 無 菌 的に保存し, 3 7⁰C では. 1.

3, 6,1 2 時 間 後お よ び 1, 2^, 4^. 7^, 1 4^, 2 1 ^, 2 8 日 後^, 2 0⁰c と 4⁰C では 1 2 時 間後および 1,2, 4,7,1 4.

2 1, 2 8 日後に そ の ^一部を 試験 管よ り取り出し た も^の Studie s o n Deg^{e n e r a}tio n Pr o c e s s of H um a n T u m o r C ells･ E iichi M ita mu ra, D ep^{a r‑} tm e nt of Inte rn al M edicin e (^ⅠII) (^{Dire ctor: P rof. K .H at to ri})^{,SchQ Ol of M edicine}, K a n a^‑

Za W a U niv e r sit y^.

4 2 2

を 80 0rpm で 5 分 間 遠 _心 し^, そ の 沈 査 に 0.5 % e ry thr o sin B 液 を等量 加 えて混合し. その ^一 を Biirke トTurk 血 球 計 算板の計 算室^に入 れ約1 0 抄 後^に2 08 偶^の細胞^につ い て e r sthr o sin B によ り赤 染 し た細胞^の百分率 (e ry thr o sin inde x,以下E^.Ⅰ. と す る) を求め^, Viabi lit y を( 1 0 0^‑E^.I^.) % ^で表わ し た^.

2 . 細 胞の分裂能と高 分 子 物 質 合 成 能

上述の実 験Ⅰ^.の1^. に用^いた 胸 ^･ 腹 水^のう ち 保存7 日白まで の それ ぞ れ 1 扉に.

3H^‑thymi d in e 3pC i,

3H^‑u ri d in e 5JIC i を加えて無 菌 的に3 7⁰c で 1時 間培 養 し^{, ハ ン ク ス}Ⅲ液^で3 回洗 浄, さ ら^にF C S O^.5^mエで

洗 浄 後塗沫 乾 燥, メ タノ ^ー ル で 1 5 分 間固定 後 乾 燥, S A K U R A N R^‑M^, 乳 剤を 用 い て d ip ping 法で

a uto r ad iogr aphy 模 本を作 製し た. 榎本は乾 燥 剤入 りの暗 箱 申で 4⁰c, 4 日間 露 出し た後D 19 を 用 ^{い て} 1 8⁰C で5分 間現像. 9 % 酢酸で停 止. コ ^エ フィ ク ス で 20⁰C l O分 間 定 着後 流 水で3 0 分 間 水 洗,乾燥 後ギ^ム ザ 染色を施し た.各 棟 本^につ い て そ れ ぞ れ 1 0 00 偶^の細胞 を数え^,銀粒 子5個以上を陽 性と して百分 率を求め た^.

Ⅲ. 細胞の変性過 程 1^, 形態学 的変 化

実 験Ⅰで用^いた と同 様に. 採取 直 後お よ び試 験 管に

保 存し た胸^･ 腹水を経 時 的に取り出し, 8 0 0rpm で 5 分 間遠心 し沈 壇よ り薄 層 標 本を作 製, 位 相差顕 微 鏡 下

で観察し た. 位相差顕 微 鏡は 日本 光 学^{K K} 製で対 物^レ

ン ズは Da rk Med iu m x l O O を 用い緑 色フィ ル タ ^ー を 透 して観 察し 写真 撮影には ネ オ^{パ ン} F を使用 し た^. 同時に塗沫標 本を作 製し,

一

つ は 9 5 % ^エ タノ ^ー ル ^･ エ

ー テ ル 等量 液 で 蘭=遡 定 後, W alte r^‑Re ed^‑Ar m y

Ho spital 変態^によ る P^apa nic ola o u 染 色を施す と と もに. 他^{の 一} つ はカル ノ ア液で湿 固定 後, Fe ulge n 反 応を施し^, いず れ も 形態 学 的 観 察を行な^っ た^.

2, D N A 量の測定

上記^の形態 学 的観 察に使用 し た Fe ulge n 反応 標 本

につい て. N i ko n^‑V icke r s M ^･8 5 ^{s c a n n}ing mic r o^‑

de n sitophoto m ete r で波 長5 6 0 ^{n m}/SpOtlfL,対 物^レ

ンズ×1 0 0 に より, 多核 白血 球を除い て連 続 的^に2 0 0 個^の細 胞を測定し,縦 軸に細 胞 数,槙 軸に D N A 量 を任 意^の単位^にと りヒ ス トグ^ラム を作 製し た^.

実 験 成 績

Ⅰ^. 奨 膜 細 胞

1 ^. 色 素 排 泄能^{によ るviab ili}t y (F ig^.1^.a) 1) 採取 直 後^の細胞

E.I^, は 4^.5 % ^{で v}iab ilit y は 9 5^.5 % であ^った^. 2 ) 3 7⁰C に保 存し た細胞

田 村

E^.Ⅰ. は時 間^の経過 と と もに上 昇 し. viab ilit y は 1 日後4 4^.0 % ^. 1 4 日後4^.0 % ^, 2 1 日後0 % と な^っ た.

3 ) 2 0⁰C に保 存し た細 胞

viab ilit y は 7 日後5 3^.5 % ^, 1 4 日後1 1^.5 % と著 滅 し.2 8 日後には 0 % と な^った.

4 ) 4⁰C に保 存し た細 胞

1 4 日後^に23 ^.0 % と著滅, 2 8 日後^に0 % と な^った.

2^{. a uto r a}d iogr aphy 法に よ る Labeling Inde x の測定 (F ig^.2^.a)

1) 採取直後の細 胞

3H^‑thy mi d in e お よ ぴ³H^{‑u r}i d in e の L^abeling Inde x ( 以 下³H^･T d R ^.L I^. お よ び³H^･U d R^.L^.Ⅰ^.と略す)

は, それ ぞ れ 1 1 .5 % ^, 6 8.4 % ^であ^っ た.

2 ) 3 7⁰C に保 存し た細 胞

i) ³H^‑T d R^.L^.Ⅰ^{. :} 1 2 時 間 後^に1 ^.5 % と著 減, 1 日 後^に0 % と な^った.

ii) ³H ^･U d R ^.L^.Ⅰ^, : 1 2時 間 後に3 ^.7 % ^, 2 日後に0

% と な^った.

3 ) 2 0⁰C に保 存し た細 胞

i ) ³H^‑T d R^.L^.I^{. :} 1 2 時 間 後^に 3^.7 % と著減^, 2 日 後^に0 % と な^っ た.

ii) ³H^‑U d R^.L^.Ⅰ^. : 1 2 時 間 後^に1 8^.4 % と著 滅. 4 日 後に0 % と な^っ た.

4 ) 4⁰c に保 存し た細 胞

i) ³H^‑T d R^.L^.Ⅰ^. : 1 日後^に2^.1 % と著滅^. 4 日後に 0 % と な^った.

ii) ³H ^‑U d R^.L^.Ⅰ^{. :} 4 日後に1 2^.5 % ^. 7 日後^に0 % と な^った^.

3^. 形 態学 的 観察 1 ) 採 取 直 後^の細 胞 i) 位 相差 顕 微鏡によ る観 察

細胞 質^には細 賊粒状^の糸 粒体を核周囲^に認 め, 核 は 類円 形, 核線は 円滑^で薄く^, 核内には 1 ^〜 3 個^の小形 の核 小 体と少 数の凝 集 塊を 認 め た.

ii) Papa nic ola o u 染 色によ る観 察

細胞 質は広く 層状を 呈 し^, 核 縁は薄く円 滑で核内^は 細顆粒 状^で矯円形^の核小 体を み た.

i ii) Fe ulge n 反 応によ る観 察

核形^は円 形 な^いし類円 形, 核縁は 薄 く 円滑. 核^の網 工 は純綿状あ る^いは細 顆 粒 状^で均 等^に分布し, 核小体

の部 分はぬけ^. その周囲^に凝 集 塊を み た^. 2 ) 3 7⁰C に保 存し た細 胞

i) 位相差 顕 微鏡^によ る観察

a. 1 時間後 ^: 細 胞 質^では糸粒 体が膨化 し.光輝性轍 粒 も出現^, 核は採取直 後と著 変を み な か^った^.

b^. 3時 間 後 : 細 胞 質^の光 輝 性 顆 粒が増 多, 核 径^は

腫 瘍 細 胞^の変性 過 程^の研 究

t 2 句 7 日 2 t ‡一 伽i

12 q 7 川 21 2 且 伽S

4 2 3

1 Z q 7 l q 2 1 劫 如

1 2 q 7 =1 2 t 油虫lyt

F ig^･1^･ Sequ e ntfal cha nge in c ell viabilit y ^{e x am} i^‑

n ed by e ry thr o sin B e x clu sio n m ethod.

㌦ Viable c ells w e r e e xpr e s s ed by(1 0 0^‑

e ryth r o sin B stain ed c ells) %

⑳ ^‑ ◎ kep t at 3 7 ℃

◎ ^{… 一‑･}◎ kep t at 2 0 ℃

⑳ ^{… …･･}⑳ kep t at 4 ℃

a . M e s othelial c ells fr o m a s cit_{e s}.

b . W ell diffe r e ntiated ade n o c a r cin o m a c ells of

StO m a Ch fr o m a s cite s.

C ^. W ell diffe r e ntiat_ed ade n o c ar Cin o ma c ells of

StO m a Ch fr o m a s cite s.

d . Po o rly d iffe r e ntiated squ a m o u s c ell c a rin o m a C ells of ute r u s fr o m a s cite s^.

e . We11 dif fe r e ntiated squ a m o u s c ell c a r cino m a C ells of lun g fr o m ple u r al fluid.

f ･ Sm all c ell c a r cino m a c ells of lu ng fr o m ple^‑ u

r al fluid.

g ･ Retic ulum C ell s a r c o m a c e11s of l_{ym p}hn ode

fr o m ple u ral fluid.

4 2 4

1 2 q

1 2 勺

7 doY l

田 村

l コ q

+ ^▲

7 血y $

1 2 q 7如l

F ig^.2. Sequ e ntial cha ng^{e s} in labeling in d ic e s of ³ H^‑T d R (up pe r)

a

nd ³ H^‑U d R (lo w e r)

◎ ^一 ◎ kep t at 3 7 ℃ ^{匂ぃ=‥=り砂} kep t ^at 2 0 ℃

● ^{… ‑}‑^{･ ● kep t at 4 ℃}

a. Me s oth elial c ells fr o m a s cite s.

b^. W ell diffe r e ntiated ade n o c a r cin o m a c e11s of sto m a ch fr o mr

a s cite s.

c^. W e11 diffe r e ntiated ade n o c a r cin o m a c ells of sto m a ch fr o m a s cite s.

d. Po o rl_y diff^{e r e nt}iated ^sq^{u a m o u s c e}ll c a r cin o m a c ells of ute r u s

fr o m a s cite s.

e. W ell diffe r e ntiated squ a m o u s c ell c a r cin o ma c ells of lu ng fr o m ple ur al fluid^.

f. Sm all c ell c a r cin o m a c ells of lun g fr o m ple u r al fluid^. g^. Retic ul um C ell s a r c o ma c ells of lym phn ode fr o m ple u r al

fluid^.