PowerPoint プレゼンテーション

BioCMOS.com

半導体チップを用いた

生体分子のラベルフリー・電気的検出

名古屋大学大学院工学研究科

電子情報システム専攻 教授

中里 和郎

BioCMOS.com

化学集積素子 － チップ上に化学を集積

化学反応

制御

検出

輸送

smart lab-on-a-chip

化学反応の検出 化学反応の制御 特定の分子のセンシング 特定の分子の増幅 輸送 分子の搬送と選別 ・ ノイズに強く微小信号を捉えるこ とができる ・ 高速（1ms)・局所（1~100mm)計測 ・ 同時並列計測が可能 化学反応分布の実時間観測 多種反応の同時計測 ・ 化学反応の制御 温度・電界・磁界・溶液の流れ ・ 小型（1cm2₎

特長

～1cm

BioCMOS.com

センサ・アレイによる化学反応の検出

センサ・アレイ

・同時並列計測 ・反応の2次元可視化

研究方針

・ 半導体チップは標準CMOS製品ラインで作製 ・ ポストプロセスとして膜形成等、数ステップを付加 ・ アレイのユニット・セル回路に注力 ○ 化学反応系に干渉しない ○ 高密度（最小素子数） ○ 低消費電力(弱反転動作） ○ 安定動作（低出力抵抗） pH9 pH6 不良セル 大きな信号を検出 平均では信号弱い 出力信号 頻度 欠陥があっ てもほとんど 影響を受け ない 欠陥があると 信号が検出 できなくなる ・冗長性

BioCMOS.com p n+ _n+ 金属 酸化膜 半導体

MOSFET 構造

■ _{現在の集積回路はMOSFETで構成} ■ _{1cm角のチップに10億個以上の} MOSFETが搭載可能 ■ _{一度に大量のチップの作製が可能} （1万チップ/ロット）

MOSFET

半導体のメリットを活かすには標準化が必要 初期費用が高い 量産化によりチップ単価は非常に安くなる 標準製造工程以外の工程は困難 加工レベル 初期費用 チップ単価 0.6mm 130 万円 150円/チップ 0.25mm 750万円 210円/チップ 0.18mm 1,900万円 260円/チップ 0.13mm 4,800万円 400円/チップ 初期費用 ：ホトマスク代 チップ単価 ：チップサイズを固定(1cm角）した ときの単価 少量生産には向かない

BioCMOS.com 食の安全 健康に対する不安 感染症の拡大防止 体質にあった投薬・ケア 在宅医療 小型可搬型・遺伝子ベース診断システム 半導体集積回路の新しい展開

More than Moore

従来のDNAチップ 蛍光体検出 ・蛍光体をつけるのに専門技術が必要 ・光学装置のため高額・携帯困難 system-on-a-chip + lab-on-a-chip 誰でもどこでも直ちに label free, 電気的検出 のDNAチップの実現 ● 小型・携帯型 医療検査装置（在宅医療） ● 感染症の水際阻止 ● ケア（健康、食品、運動、ペット） ● 食の安全 ●環境

小型可搬型・遺伝子ベース診断システム

BioCMOS.com

potentiometric

amperometric

impedimetric

電位もしくは電荷

酸化還元電流

インピーダンス

電気化学計測法

BioCMOS.com prove の固定 ○ 素性の判っている分子 ○ 特定の分子とのみ結合

immobilization

target ○ 調べたい分子 ○ 電荷 Q を持つ

hybridization

反応させた後、結合しなかった分子は 洗い流す もしtarget の中に特定の分子が含ま れていれば電位の変化として検出

直接電荷検出法

BioCMOS.com

Potentiometric sensor 回路

参照電極 溶液 電極 センサ・トランジスタ 分子 入力インピーダンスが DC, AC 共に大きいこと

CMOS source-drain follower

被測定対象に影響を与えないこと 理想的な検出 V_G

V

_S

= V

_G

+ const.

V

_D

= V

_G

+ const.

V_G V_OUT = V_G V_S V_D 従来回路と比較して 面積 1/30 消費電力 1万分の1 精度 100倍

K.Nakazato, M.Ohura & S.Uno IEICE Trans. Electron. E91-C (2008) 1505

BioCMOS.com Y decoder RAS CAS inpu t add res s OUT MUX X dec oder address buf fer REF 16 x 16

sensor cell array reference cells current reference (50nA) address buffer

16 x 16 sensor array

5mm 112 mm 81.4 m m sensor unit sensing area 1.2mm 標準 CMOS プロセス チップ消費電力 0.5 mW

BioCMOS.com

Catalytic-CVD Si

₃

N

₄

を用いた pH 測定

- 60 - 50 - 40 - 30 - 20 - 10 0 C u m u la tiv e P robab ility [% ] 99.9 99 95 90 80 70 50 30 20 10 5 1 0.1 pH sensitivity [mV/pH] pH9 pH6 flow pH VOUT [V] - 40mV/pH 5 6 7 8 9 0 - 0.2 - 0.18 - 0.16 - 0.14 - 0.12 - 0.10 - 0.08 - 0.06 - 0.04 - 0.02 0.02 Cu mulative Pr ob abili ty [ %] 0 0.05 -0.1 -0.15 -0.2 99.9 99 95 90 80 70 50 30 20 10 5 1 0.1 V_OUT[V] -0.05 pH5 pH6 pH7 pH8 pH9 参照電極 溶液 電極 センサ・トランジスタ H＋ Si₃N₄

BioCMOS.com

乳酸菌の測定

乳酸菌投入 37℃インキュベータ内 培地（培養液：糖類あり_） リン酸緩衝液（糖類なし_） 採材→検体処理→分離培養→ 純培養→鑑別検査→菌の特定 菌の特定までに長時間が必要 測定対象： _{測定内容： 乳酸菌の資化反応か}乳酸菌 ら生じる酸による ｐＨ 変化を観測

細菌の生体反応

現在の細菌検査方法 短時間（数時間）での菌の特定が 目標

BioCMOS.com 11.2mm PECVD Si3N4(750nm) SiO2(400nm) Au (50nm) / Ti(20nm) Al (1mm) 4.2 mm 6.5 mm

DNA hybridization の検出

probe: 5’ thiol modified GGGAAAAAAAAAAAAAAGGG

target: CCCTTTTTTTTTTTTTTCCC

buffer: 1mM NaCl & 1uM EDTA & 1mM KH₂PO₄& 1mM K₂HPO₄(pH7.0) Immobilization Hybridization -- -Probe

ssDNA target ssDNA

参照電極

溶液セル K.Nakazato

Sensors 9 (2009) 8831

BioCMOS.com ここまでの配列が probe DNA と相補的で あれば伸長反応が起こる ｄ A T P ｄ T T P ｄ C T P ｄ G T P ｄ A T P ｄ T T P ｄ C T P ｄ G T P ｄ A T P ｄ T T P ｄ C T P ｄ G T P ｄ A T P ｄ T T P ｄ C T P ｄ G T P 電荷量の変化 hybridization _G A T A G T A G T A G C A G T C A T T A G T C A T T 溶液 絶縁膜 半導体 n+ _n+ p

Genetic Field Effect Transistor

T.Sakata & Y. Miyahara Biosensors Bioelectron. 22 (2007) 1311 probe DNA target DNA G A T A G T A G T A G C A G T C A T T C 伸 長 dNTP DNA polymerase

BioCMOS.com

生体分子電荷の直接検出の問題点

構造変化による影響

電荷遮蔽

生体分子の電荷 溶液イオンに よる遮蔽 溶液濃度 遮蔽距離 1 mM 10 nm 100 mM 1 nm 特にフロー系では 溶液中での分子の動き → 信号の不安定 電荷の変化を見てるのか 構造の変化を見てるのか 解らない 電荷を検出しようとすると 溶液濃度 小 → 高インピーダンス状態 → 信号が不安定 電極 hybridization 電極 絶縁膜 or SAM 初期電荷 → 大きな閾値ばらつき

浮遊ゲート

BioCMOS.com

酸化還元電位センサ

0 0.5 1 -50 -40 -30 -20 -10 0 0 0.5 1 -4 -2 0 2 4 電位 [mV] 時間 [hour] 変動 30 mV/hour 変動 0.5 mV/hour 電位 [mV] 時間 [hour] 直接電荷検出方式 酸化還元電位検出方式 信号安定性 ２桁向上 7. 5 m m 7.5 mm フェロセン修飾金電極 Fe S Ox Red Fe S Fe S 金 シリコン基板 絶縁膜 フェロセン 10-4 10-3 10-2 10-1 100 101 102 103 104 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 forward backward Ratio of hexacyanoferrate ( Ⅲ) to (Ⅱ) Int er fa ci al P ot ent ia l [ m V ] 酸化物質(Ox)/還元物質(Red) 出力電圧 [m V]

BioCMOS.com Fe S Fe S Fe S Fe S Fe S 金電極 フェロセン 11-FUT 11-ferrocenyl-1-undecanethiol 酸化物質 還元物質 測定対象物質 反応産物 酵素反応系 酵素 Fe(CN)₆3- _Fe(CN) 64- hexacyanoferrate Fe(II) Fe(III) 利点 ○ 溶液の pH に依存しない ○ 感度大 ○ 安定 ○ 再利用可能 ○ 汎用 𝑉_𝑇 = 𝑉_𝑇0 − 𝑘𝐵𝑇 𝑛𝑞 log𝑒 測定対象物質濃度

FET方式酵素センサ

S P E Ox Red

BioCMOS.com

応用例

Cholesterol + NAD Cholestenon +NADH

Diaphorase コレステロール測定 グルコース測定 グルコース + ATP ｸﾞﾙｺｰｽ6ﾘﾝ酸 + ADP ｸﾞﾙｺｰｽ6ﾘﾝ酸 + NAD ｸﾞﾙｺﾉﾗｸﾄﾝ6ﾘﾝ酸 + NADH HK G6PDH

2[Fe(CN)₆]3- _{+ NADH 2[Fe(CN)}

6]4- + NAD CDH 出力電圧 [m V] コレステロール濃度 [mg/dl] サンプル量： 2.5mL 33±2.5 mg/dl

T.Ishige, M. Shimoda & M. Kamahori Biosensors Bioelectron. 24 (2009) 1096

Diaphorase

2[Fe(CN)₆]3- _{+ NADH 2[Fe(CN)}

6]4- + NAD 0 600 1200 1800 2400 3000 -70 -60 -50 -40 -30 -20 -10 0 10 Time [s] C ha nge i n po te nt ia l [ m V ] 25 mg/dL 50 mg/dL 100 mg/dL 200 mg/dL 出力電圧 [m V] グルコース濃度 時間 [秒]

H. Anan, T.Ishige, M. Kamahori, & K. Nakazato Sensors an Actuators B: Chemical (2013)

BioCMOS.com Fe S Fe S Fe S Fe S Fe S 金電極 11-FUT (11-ferrocenyl-1-undecanethiol) C T T G A A A T dNTP 伸長 Target DNA Probe DNA DNA Polymerase PPi (pyrophosphate) 酸化還元物質 e- 酵素反応系 ビーズ MOS transistor

酸化還元反応検出方式DNAシーケンサ

ビーズ 金電極 ○ 分子反応部と検出部の分離 ○ 信号の増大と安定 ○ 汎用性 ○ 再利用可能

BioCMOS.com

amperometric sensor array

微小電極アレイ 拡散層の形状 Microelectrode array Microelectrode time curre nt 電流の時間変化 time curre nt 電流は減少し続け、定常電流が得られない 平面状 半球状 数秒～数十秒 拡散層の形状 電流の時間変化 < 10-5 _m 定常電流が得られる.

電流検出の原理

微小電極 酸化還元反応で移動した電子を 電流として検出 - -

_

   

e

Ox

Red

n

Electrode Electrolyte Red- _Ox+ e -e -2D mapping Current Current Insulator

BioCMOS.com

微小電極アレイ構造

従来の構造  拡散層が重なり合う  平面状の拡散層が形成される  拡散層が各作用電極付近に 閉じ込められる  拡散層の重なりが低減される 提案する構造 WE WE AE WE : Working electrode 目的の酸化還元反応が起こる

AE: Auxiliary electrode

BioCMOS.com 100 mM Na₂SO₄ 1 mM K₄[Fe(CN)₆] 単体の 微小電極 従来の 微小電極アレイ 提案する 微小電極アレイ

10

-1

10

0

10

1

10

2

3

4

5

6

I

[

nA]

time [s]

単体の微小電極 従来の微小電極アレイ （定常電流が得られず定量化不可） 提案する 微小電極アレイ

微小電極アレイセンサー

双スイッチ方式により 常に電極電位を固定

J.Hasegawa, S. Uno & K. Nakazato Jpn. J. Appl. Phys. 50 (2011) 04DL03

BioCMOS.com

キャパシタンス検出

1 SW SW2 CM V B V 1 SW SW2 1 SW 1 SW 1 SW 1 SW 2 SW 2 SW OUT V X2 C X1 C i C i C Sensing Cell Output Circuit A 1 SW SW2 CM V B V 1 SW SW2 1 SW 1 SW 1 SW 1 SW 2 SW 2 SW OUT V X2 C X1 C i C i C Sensing Cell Output Circuit A V Q=CV Q=0 電流 = fCV

CBCM

(Charge Based Capacitance Measurement)

この繰り返しを周波数 f で実行 C=C_M I₁ = f(C_M+C_p)V I₂ = fC_pV V = A(I₁-I₂) = AfC_MV 実際には差分により精度向上 C=0 電極 4mmx4mm 電極

BioCMOS.com probe DNA immobilization target DNA hybridization bare electrode

キャパシタンスによるDNA検出

Y.B.Yusof, K.Sugimoto, H.Ozawa, S.Uno & K. Nakazato

BioCMOS.com

20mm

金電極

probe DNA _{mercaptohexanol} Probe DNA +

1 mm

Electrochemical Impedance Spectroscopy (EIS)

○ DNAの固定化法に敏感 ○ DNAの状態は単純な キャパシタンスや抵抗の 変化では無く、constant phase element の因子 a の変化として現れる 𝑍 = 1 𝑄 𝑗𝜔 𝛼 𝑗 = −1 −𝑍_{𝑖𝑚𝑎𝑔𝑖𝑛𝑎𝑟𝑦} 𝑍_{𝑟𝑒𝑎𝑙} = tan 𝛼𝜋 2

BioCMOS.com

Constant Phase Element

∝ exp − 𝑡 𝐶_𝑖𝑅_𝑖 ∝ 𝑡−𝛼 time t curr en t R_i C_i R₀ C₀ 分布として捉える必要 _{構造の変化として捉える必要} Y.B.Yusof 名古屋大学 工学研究科 学位論文 （2011年10月）

BioCMOS.com

インピーダンスによる 1 分子検出

細菌、ウィルス 溶液 絶縁膜 電極 細菌、ウィルス捕獲膜 電極実効面積の減少 キャパシタンス減少 抵抗増大 10mm 1mm 100nm 10nm 1nm 細胞 細菌 ｳｨﾙｽ DNA 現在の半導体技術で 1分子サイズの電極の 形成が可能 ナノポア インピーダンス増大 平均値測定と1分子測定では 検出信号に質的な差

BioCMOS.com

インピーダンスによる 1 細菌検出

細菌 電極 R_S C_d C_p 等価回路 log(|Z|) C_d R_S C_p log(|f|) インピーダンス Z の周波数 f 依存性 細菌有 細菌無 寄生容量の削減 電極を直接外部に接続する と大きな寄生容量が付く C_p~100pF 内部回路により 寄生容量3桁低減 C_p~0.1pF 内部回路 I_SS R input f , Hz 10-7 10-6 10-5 10-10 10-8 10-9 , S 1M 1K 10K 100K 10M 100M 100 理想的な特性 回路(a) 回路(b) オペアンプ 回路 専用 回路

BioCMOS.com

細菌カウント チップ

絶縁膜 細菌 抗体 電極 局所インピーダンス センサ回路 半導体 チップ フローセル 流路 MOSFET 細菌B フローセル 流路 半導体 チップ ボンディング パッド 細菌A 細菌C _細菌D 細菌捕獲セル

BioCMOS.com

異種項目同時計測による総合的な分析

インピーダンス検出 pH検出 酸化還元電流検出 電位検出 372.59mm 2 2 2 .7 4 m m 測定項目 記号 測定方式 解説 ヘマトクリット値 Hct インピーダンス 血液中の血球容積 ヘモグロビン Hb 酸化還元電流 赤血球中のヘムタンパク質 グリコヘモグロビン HbA1c 電位 ヘモグロビンb_{鎖のN末端に} グルコースが結合した糖化タンパク質 グルコース GLU 電位 血液中の代表的な糖質

BioCMOS.com Y d ec o d er X decoder MUX address buffer ad d re ss b u ff er sensorarray amplitude detector output buffer RAS CAS current reference digital level shifter ADC CPU Flash memory SRAM G PI O USB interface LCD MCU

chip

PC LCD driver

2cm

14cm x 20cm x 11 cm (H) スタンドアローン・デモ機 フローセル流路を含めた形で プロトタイプを完成（2013年4月）し、 評価していただけるようにしたい

試作機

BioCMOS.com 化学集積素子

IT・通信

流通

医療・看護

生活

オフィス

創薬

食品

環境

金融

小型 低電力センサ 高密度 低消費電力 LSI

交通

認証 チップ _{バイオチップ} lab-on-a-chip

農業

ユビキタス情報社会