Title
Premature termination of reprogramming in vivo leads to cancer
development through altered epigenetic regulation( 内容と審査
の要旨(Summary) )
Author(s)
大西, 紘太郎
Report No.(Doctoral
Degree)
博士(医学) 甲第948号
Issue Date
2014-03-19
Type
博士論文
Version
none
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/49082
※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。氏名（本籍） 学 位 の 種 類 学位授与番号 学位授与日付 学位授与要件 学位論文題目 審 査 委 員 大 西 紘太郎（岐阜県） 博 士（医学） 甲第 948 号 平成 26 年 3 月 19 日 学位規則第４条第１項該当
Premature termination of reprogramming in vivo leads to cancer development through altered epigenetic regulation
（主査）教授 長 岡 仁 （副査）教授 秋 山 治 彦 教授 山 口 瞬 論 文 内 容 の 要 旨 遺伝子変異の蓄積は発癌に深く関与している。各種の細胞へと分化することが可能なiPS 細胞は， 遺伝子の変異を伴わずに樹立することが可能であるが，同細胞の特徴として，癌細胞と同様な「無 制限の細胞増殖能の獲得」が挙げられる。そこで申請者は，体細胞の初期化過程と癌の発生・増殖 の過程において，共通するメカニズムがあるのではないかと考えた。本研究では，生体内で初期化 因子を強制的に発現することができるマウスモデルを作製し，生体内での細胞初期化と発癌の関連 を検討した。 【対象と方法】 生体内で体細胞を初期化できるマウスモデルを作製するために，ドキシサイクリン誘導性に細胞 初期化因子（Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc）及び蛍光タンパク質を生体内で強制発現することができ るマウスを作製した。マウス生体内での初期化因子の誘導は，ドキシサイクリンの飲水投与（2mg/ml） により行った。マウスは安楽死処理後，病理組織学的解析とともに，免疫染色にてタンパク質発現 を検討した。各臓器から抽出した mRNA を用いて，qRT-PCR 解析とともに，マイクロアレイを用いた 網羅的な遺伝子発現解析を行った。網羅的 DNA メチル化解析は，バイサルファイト処理後に次世代 シークエンサーにて行った。遺伝子変異については，癌関連遺伝子の exon sequencing，アレイ CGH にて解析した。 【結果】 細胞初期化因子誘導可能マウスにドキシサイクリンを飲水投与することで，様々な臓器での細胞 初期化因子，および蛍光タンパク質の発現を確認することができた。さらに 4 週間のドキシサイク リンの投与にて，腎臓，膵臓等の臓器に腫瘤が形成された。これらの腫瘤は三胚葉への分化傾向を 示す奇形腫であった。奇形腫腫瘍細胞を試験管内で培養したところ，キメラマウスへの寄与能を有 する多能性幹細胞が樹立された。これらの結果より，生体内で体細胞を初期化できるマウスモデル の樹立に成功したことが確認された。次に，不完全な細胞初期化を誘導するために，初期化因子誘 導可能マウスにドキシサイクリンを一週間投与し，続いて一週間休薬した後解剖し観察したところ， 腫瘤形成を認めた。これらの腫瘤は奇形腫とは異なる，未分化な細胞にて構成されていた。同腫瘤 における異型細胞は，癌細胞と同様に他臓器への浸潤傾向を示していた。この浸潤性異型細胞の増 生は，癌遺伝子であるc-Mycを除く 3 因子でも誘導された一方で，細胞初期化に重要なOct3/4以外 の 3 因子では誘導されないことが確認され，癌類似病変の形成には多能性幹細胞へと向かう細胞初 [ ]
期化が関与していることが明らかとなった。不完全な細胞初期化にて誘導された，腎臓腫瘍の遺伝 子発現をマイクロアレイにて網羅的に解析すると，腎臓特異的な遺伝子の発現が低下する一方，
Nanog やLin28a など多能性幹細胞で特異的な遺伝子（群）の発現が上昇していた。しかしながら， 多能性幹細胞では発現が抑制されている Polycomb repressive complex の標的遺伝子群の一部は， むしろ活性化していることがわかった。細胞の初期化には DNA メチル化を含めたエピゲノムの改変 が広く生じることが知られているが，腎臓腫瘍では，すでに多能性幹細胞でメチル化されている領 域にメチル化が付加されている一方で，腎臓の細胞でメチル化されている領域の脱メチル化はそれ ほど認められなかった。不完全な細胞初期化により誘導される腎臓腫瘍は，小児腎腫瘍の代表であ る Wilms 腫瘍に組織学的に類似するのみならず，遺伝子発現のパターンも類似することが分かった。 不完全な細胞初期化による腎臓腫瘍の遺伝子変異解析では，明らかな癌遺伝子での変異や染色体異 常は確認されなかった。腎臓腫瘍細胞から iPS 細胞を樹立しキメラマウスを作製すると，腫瘍細胞 由来 iPS 細胞は非腫瘍性の腎臓細胞へと分化することが確認された。 【考察】 今回の研究結果より，不完全に初期化された細胞は癌細胞と非常に類似した性質をもち，生体内 で腫瘍を形成することが明らかになった。発生した腫瘍は元の細胞の性質を失い，脱分化が積極的 に発癌を促進することが示唆された。腫瘍細胞において明らかな遺伝子配列異常が確認されず，ま た腎臓腫瘍細胞から作製した iPS 細胞が非腫瘍性の腎臓細胞に分化したという事実から，この発癌 は遺伝子変異ではなく，エピゲノム制御機構の変化により生じた可能性が示唆された。さらに，今 回観察された腎臓腫瘍は，その組織学的所見と遺伝子発現のパターンが Wilms 腫瘍に類似していた ことより，Wilms 腫瘍の発生においても，エピゲノム制御の変化を背景とした分化異常が重要な役 割を果たしている可能性が示唆された。 【結論】 申請者は，生体内で細胞初期化因子を強制発現することができるマウスを作製した。同マウスモ デルにおいて，生体内で一過性に細胞初期化因子を発現させることで，生体内に DNA メチル化の 変化を伴った腫瘍が形成された。不完全な細胞初期化により発生した腎臓の腫瘍は，小児腫瘍の一 つであるWilms 腫瘍に類似していた。また腎臓の腫瘍細胞は，完全な初期化により非腫瘍性腎臓細 胞に分化したことより，この発癌がエピゲノム制御の変化によるものであることが示唆された。本 研究結果は，癌細胞発生機構の解明，およびWilms 腫瘍の発生機序の理解やその治療法開発を進め ていく上で，非常に意義深い研究結果であると考えられる。 論 文 審 査 の 結 果 の 要 旨 申請者 大西紘太郎は，生体内で体細胞を初期化できる遺伝子改変マウスを用いて，不完全な細 胞初期化がエピゲノム制御の変化をもたらし，細胞を腫瘍化させ得る事を示した。この研究成果は 細胞癌化機構の解明や治療法の開発に繋がる重要な成果であり，腫瘍学・消化器病態学の進歩発展 に少なからず寄与するものと認める。 ［主論文公表誌］
Kotaro Ohnishi, Katsunori Semi, Takuya Yamamoto, Masahito Shimizu, Akito Tanaka, Kanae Mitsunaga, Keisuke Okita, Kenji Osafune, Yuko Arioka, Toshiyuki Maeda, Hidenori Soejima, Hisataka Moriwaki, Shinya Yamanaka, Knut Woltjen,
Yasuhiro Yamada: Premature termination of reprogramming in vivo leads to cancer development through altered epigenetic regulation
