細胞質局在化コンジュゲートsiRNAによる遺伝子発現制御
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(2) 在化. として，医学，分子生物学上大きな注目を集 めている。ゲノム医療、ポストゲノム研究の ための基盤技術として，細胞に効率よく導入 でき、特定の遺伝子のみを持続的に強力にノ ックダウンする技術の開発が急務である。. H I V l tat タンパク，ショウジョウパエホメ オボックスタンパク，インフルエンザウイル ス核タンパクなどに由来する各種核局在化 シグナルペプチドをオリゴ DNAの様々な位置 にコンジュゲートし，細胞への導入効率と細 胞内での所在について共焦点走査型蛍光顕. 2. 研究の目的. 微鏡およびフローサイトメトリーを用いて. 申請者はすでに独自に開発した固相フラグ. 観察する。最も効率の高いペプチドを探索す. メント縮合法を用いてオリゴ D N A / R N Aにシグ. る 。. ナルペプチドなどの様々な機能を持った生 体分子をコンジュゲートすることにより，オ. (3) オリゴ. D N A / R N Aの細胞質内への選択. 的局在化. リゴ D N A / R N Aを効率よく細胞内に導入し、し. H I V l revタンノ《ク， PKI.タンノえク， MAPKK. かも、その細胞内での局在化を制御できる手. タンパクなどに由来する各種核外輸送シグ. 法の開発に成功している。また、この技術に. ナルペプチドをオリゴ DNAの様々な位置にコ. よりヒト白血病細胞中のテロメラーゼ、を 1 週間にわたり 9 9 .回以上の効率でノックダウ ンできることを明らかにしている。. ンジュゲートし，細胞への導入効率と細胞内 での所在について共焦点走査型蛍光顕微鏡 およびフローサイトメトリーを用いて観察 する。最も効率の高いペプチドを探索する。. 本研究では、この技術をさらに発展させオリ ゴD N A / R N Aの細胞核内、細胞質、ミトコンド リアへの選択的輸送を制御し、それぞれ、遺 伝子 DNA，mRNA， ミトコンドリア mRNA を標. (4)オリゴ D N A / R N Aのミトコンドリアへの. 選択的局在化 オリゴ DNA ミトコンドリア輸送、ングナルペ プチドをコンジュゲートし、細胞への導入効. 的とした高効率遺伝子ノックダウン法を開 発する。. 率と細胞内での所在について共焦点走査型 蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーを 用いて観察する。最も効率の高いペプチドを. 3. 研究の方法. 探索する。. (1) 固相フラグメント縮合法の拡張とマ ルチコンジュゲート DNAの合成 オリゴ DNAの 5 ' 一末端， 3 ' 一末端，中間など. (5) 導入効率，細胞内での分解酵素耐性 の向上. 複 数 の 位 置 に 機 能 性 分 子 を 結 合 さ せ たマル. 細胞導入効率向上のためにはウイルス由来. チコンジュゲート DNA の合成法を確立する。. の膜融合ペプチド，人工両親媒性ペプチド，. D N A / R N A 自動合成機により合成されたオリゴ. 脂質をコンジュゲートし，細胞内分解酵素耐. DNA を用いてコンジュゲート体を作成する。. 性の向上のためにはスペルミン，グルコサミ. 化 合 物 の 分 離 は 逆 相 HPLC を ， 同 定 は. ン，ガラクトサミンなどをコンジュゲートし，. MALDI-TOF質量分析計を用いて行う。. 評価する。細胞導入効率は共焦点走査型蛍光 顕微鏡およびフローサイトメトリーを用い. (2) オリゴ D N A / R N Aの核内への選択的局. て観察する。分解酵素耐性は血清中での安定.
(3) 性を逆相 H P L C分析により追跡する。. 法では最高 95%の効率で遺伝子発現を抑制 することに成功した。. (6)細胞質内での高効率アンチセンスノッ クダウン法の開発. (4). シグ?ナノレペフ チドやポリアミン、糖をコンジ. 末端に HIV-ITatタンパク質由来核局在化シ. ュゲートしたアンチセンスオリゴ DNAにより. グナルペプチドをコンジュゲートしたアン. O. ヒト白血病細胞に発現する bcr/abl 遺伝子 mRNA を標的としたアンチセンス阻害活性を. 固相フラグメント縮合法により 5 '. チジーンオリゴヌクレオチドを合成するこ とに成功した。. 評価する。 mRNA をターゲットとするアンチ センス法においてその局在化と阻害活性と の相聞を明らかにする。チロシンキナーゼタ ンパクの発現量は蛍光標識抗体法を利用し， マイクロプレートリーダーにより定量する。 細胞導入効率，細胞内分解酵素を高めること により細胞系外から導入して効率の高い DNA. ーンオリゴヌクレオチドを用いてヒト慢性 骨髄性白血病細胞に発現する bcr/abl (P210 )遺伝子 DNAを標的としてノックダウン効果 を評価したところ、従来法と同様に顕著な遺 伝子発現抑制効果は見られなかった。. エンザイムを創製する。 4. 研究成果 (1). (5) 合成したコンジュゲートアンチジ. 当グループが開発した固相フラ. 5. 主な発表論文等 (研究代表者、研究分担者及び連携研究者に は下線). グメント縮合法を応用して、センス鎖お. 〔雑誌論文] ( 計. よ び ア ン チ セ ン ス 鎖 の 5' 末 端 に HIV-l. (1) R e c o g n i t i o n of t h eb a s ep a i r m i m i c. 6件). Revタ ン パ ク 質 由 来 核 外 輸 送 シ グ ナ ル ペ. n u c l e o s i d e s by DNA p o l y m e r a s e . S h u i c h i. プ チ ド お よ び TF3A由 来 核 外 輸 送 シ グ ナ. Nakano Yuuki U o t a n i，YTuichi S a t oH i r o h i t o. ル ペ プ チ ド を コ ン ジ ュ ゲ ー ト し た siRNA. Oka ，KazuyaUenishi MasavukiF u i i ia n dNaoki. を合成することに成功した. Sugimoto，N u c l e i cA c i d s砂m p .Se ， . r 2006，50，. O. ラ. ラ. ラ. 201・2 0 2 . 査読なし (2). 合 成 し た コ ン ジ ュ ゲ ー ト siRNA. の細胞膜透過性，分解酵素耐性を従来の RNA. 2. S y n t h e s i s of P h o s p h o r o t h i o a t e. i 法と比較したところ、分解酵素耐性におい. oligonucleotide-P叩 tide Conjugates. ては著しい向上が見られた。細胞膜透過性に. P h a s e Fragment C o n d e n s a t i o n . I r m i n aD i a l a. ついては細胞導入剤を用いない場合には従. A k i r aOsada，S h i n j i Maruoka，T a k a s h iI m a n i s i，. 来法と同様に細胞膜透過性は見られなかっ. S a t o s h i Murao，T a i s h i Ato，H i d e k i Ohba and. た 。. h t 1a s a v u k iF u i i 1 ，Bioor g . & Med .C hem. L e t t .，. by S o l i d ラ. 2007，1 7( 2 3 )， 6 5 7 6 6 5 7 8 . 査読あり. (3) 合成したコンジュゲート siRNAを用. いてヒト慢性骨髄性白血病細胞に発現する b. (3) The b a s e p a i r i n ga b i l i t yi ft h eb a s e. cr/abl ( P 2 1 0 ) 遺伝子mRNAを標的としてノッ. p a i r m i m i c n u c l e o s i d e s . S h u i c h i Nakano，. クダウン効果を評価したところ、従来法では. Kazuya U e n i s h i， Masavuki Fuiiand Naoki. 60%程度の効果しか見られなかったが、本方. Sugimoto N u c l e i cA c i d s砂m p .Se ， . r 2007，5 1 ラ. ラ.
(4) 7 1・7 2 . 査読なし. 開発.大上博子、土井佳子、清水政道、原口 正人、明日山康生、大庭英樹、産主藍圭，第. (4) F u n c t i o n a l i z a t i o n ofDNAby t h eb a s e. ，S h u i c h i p a i r m i m i cn u c l e o s i d e s .H i r o h i t o Oka Nakano ラ. Yuuki U o t a n i， Kazuya U e n i s h i. u c l e i c Masavuki Fuiiand Naoki Sugimoto，N A c i d s砂m p .Se ， . r 2007，5 1，1 5 1・ 1 5 2 査読なし. 4 3固化学関連支部合同九川大会、北九川、 平成 18年 7月 8日 ( 5 ) 多価陽イオン性新規遺伝子導入剤の開. 発.岩本友樹、土井佳子、清水政道、原口正 人、明日山康生、大庭英樹、産主監圭，第 4 3固化学関連支部合同九川大会、北九川、平. (5) S u p p r e s s i o n of b c r a b l mRNA by. 成 18年 7月 8 日. . S a t o s h i Murao， Chemically M o d i f i e d siRNA. I n n i n aD i a l a，Masavuki F u i i . i Nucleic Acids. ( 6 ) 芳香族多価陽イオン性新規遺伝子導入. 剤の開発.徳都、土井佳子、清水政道、原口. 砂m p .Se ， . r 2008，5 2，499・ 5 0 0 . 査読なし. 正人、明日山康生、大庭英樹、産主藍圭，第. 4 3固化学関連支部合同九川大会、北九州、￨、 (6). A n t i s e n s e. T e l o m e r a s e. I n h i b i t i o n of Human. by. O l i g o n u c l e o t i d e P e p t i d e. 平成 18年 7月 8 日. P h o s p h o r o t h i o a t e I r m i n a. ( 7 ) Specific Suppression ofBcr/abl Gene. D i a l a，S a t o s h i Murao Masavuki F u i i iN u c l e i c. i n Human Cells by synthetic DNAEnzymes.. A c i d s砂m p .Se ， . r 2008，52，679-680 査読なし. KengoTakamori，TakanoriKubo，HidekiOhba. ラ. C o n j u g a t e s . ラ. i . i ， i TheFukuokaSymposium， andMasayukiFu 計 13件) 〔学会発表] ( (1)新規多価陽イオン遺伝子導入剤.高須 奏江、土井佳子、清水政道、原口正人、明日 山康生、大庭英樹、塵王監圭，遺伝子・デリ パリー研究会第 6回シンポジウム、福岡、平 成 1 8年 5月 18-19 日 ( 2 ) 新規芳香族性多価陽イオン遺伝子導入. 剤.徳、都、上園由希子、大上博子、岩本友樹、 高須奏江、土井佳子、清水政道、原口正人、 明日山康生、大庭英樹、藤井政幸，遺伝子・ デリパリー研究会第 6回シンポジウム、福岡、 8年 5月 18-19 日 平成 1 ( 3 ) 陽イオン性新規遺伝子導入剤の開発.. 高須奏江、土井佳子、清水政道、原口正人、 明日山康生、大庭英樹、産主藍圭，第 4 3固 化学関連支部合同九州大会、北九州、平成 1 8年 7月 8 日 ( 4 ) 芳香族陽イオン性新規遺伝子導入剤の. New Horizon of Natural Product and Biological Chemistries， Fukuoka， 2006 July 3 0-31. ( 8 ) Synthesis， Controlled Delivery and Antisense. Effects. of. Oligonucleotide-Peptide Conjugates. ， i TaishiAto， MasamichiShimizu，KeikoDo Irmina Diala， Masato Haraguchi， Mari Watanabe，YasuoAkebiyama，TakanoriKubo， Bakarova Rumiana， Zhivko Zhelev， Hideki. i . i 1，膜透過ペプチド国際 Ohba，Masayuki Fu ミニ、ンンポジウム、京都、平成 1 8年 1 1月 1 0 1 1日 ( 9 ). Antisense. Telomerase. Inhibition by. of Human. Phosphorothioate. Oligonucleotide-Peptide Conjugates Akira Osada， Masamichi Shimizu， Irmina Diala，Keiko Doi，Masato Haraguchi，Mari Watanabe，YasuoAkebiyama，TakanoriKubo， Bakalova Rumiana， Zhivko Zhelev，Hideki.
(5) O h b a，M a s a y u k iF u i . i i，第 1 6 回アンチセン 8年 1 1月 2 7 スシンポジウム、京都、平成 1 -28日 ( 10 ). ( 3 )連携研究者 なし. 細胞内精密デリパリー制御のため. の D N A / R N Aペプチドコンジュゲートの合成. 阿藤高志、原口正人、渡辺真理、松木園美穂、 明日山康夫、丸岡慎治、今西高司、長田聡、. D i a l aI r m i n a、 村尾聡、. 大庭英樹、産主些. 幸，遺伝子・デリパリー研究会第 7回シンポ. 9年 5月 1 8日 ジウム、東京、平成 1. ( 1 1 ). アンチセンスペプチド D N A コンジ. ュゲートによるテロメラーゼ阻害. I r m i n a. D i a l a， 村 尾 聡 ， 童 生 監 圭 ， 第 45固化学関 連支部合同九州大会、北九州、平成 2 0年 7 月 5日 ( 12 ) 鎖交換による遺伝子変異検出法.大上. 博子，岡本小百合，村尾聡，藤井政幸， 第 45固化学関連支部合同九川大会、北九州、￨、 平成 2 0年 7月 5日 ( 13 ). A n t i s e n s ei n h i b it i o no fh u m a n. t e l o m e r a s e. b y. P h o s p h o r o t h i o a t e. o l i g o n u c l e o t i d e p e p t i d e. c o n j u g a t e s .. I r m i n aD i a l a， S a t o s h iM u r a o， 盟主三豆工旦k i. E 旦j i i，X V I I II n t e r n a t i o n a lR o u n dT a b l eo n N u c l e o s i d e s，N u c l e o t i d e s&N u c l e i cA c i d s， K y o t o， 8 1 2， S e p t e m b e r2 0 0 8 ( 14 ). ( 2 )研究分担者 なし. S u p p r e s s i o no fb c r / a b lm R N Ab y. c h e m i c a l l ym o d i f i e ds i R N A .S a t o s h iM u r a o， I r m i n a D i a l a， M a s a y u k i F u j i i， X V I I I I n t e r n a t i o n a lR o u n dT a b l eo nN u c l e o s i d e s， N u c l e o t i d e s&N u c l e i cA c i d s，K y o t o，8 1 2， S e p t e m b e r2 0 0 8. 6. 研究組織 (1)研究代表者 藤井政幸 ( M A S A Y U K I F U J I I ) 近畿大学・産業理工学部・教授 研究者番号:6 0 1 9 9 2 9 7.
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