4. 新技術説明会について ( 実施後フォローアップ 来年度の実施 ) 産連展開部 ( 産学連携支援 G) 1 Epstein-Barr ウイルス関連癌に 特異的な抗腫瘍剤 島根大学医学部微生物学講座 教授 吉山裕規

Epstein-Barrウイルス関連癌に


特異的な抗腫瘍剤

島根大学　医学部　微生物学講座　　　　　　

教授　吉山 裕規

l 

Epstein-Barrウイルス（EBV）はヘルペスウイルスに属し、

潜伏持続感染した細胞の増殖を促進して腫瘍化する。

l 

EBVに有効な抗ウイルス薬やワクチンの開発は遅れてい

る。

l

 

EBVのBART miRNAsの転写を抑制することで、EBV感染

上皮性腫瘍細胞をアポトーシスに導く抗がん剤を発明した。

l 

例として、YK-4-279などの化合物は、ETS転写因子に結

要

　約

ヘルペスウイルス

科

亜科 種 通称 アルファヘルペスウイルス HHV1 単純ヘルペスウイルス1型 HHV2 単純ヘルペスウイルス2型 HHV3 水痘単純疱疹ヘルペスウイルス ベータヘルペスウイルス HHV5 ヒトサイトメガロウイルス HHV6A HHV6A HHV6B HHV6B HHV7 HHV7 ガンマヘルペスウイルス HHV4 エプスタイン・バーウイルス(EBV) HHV8 カポジ肉腫ウイルス 外被糖蛋白 HSV-1 ヌクレオカプシド 　　　カプシド 　コア　　ゲノム 　　　 EEBBVV

ヘルペスウイルスは二つの感染様式をとる

溶解感染

(

水痘

)

潜伏感染

　

_→

　

_→

潜伏持続感染

溶解感染




(

帯状疱疹

)

免疫の勝利利 免疫の敗北北

EBV

EBウイルスも二つの感染様式をとる

BZLF1 BRLF1

溶解感染

再活性化

潜伏持続感染

EBNA1 EBERs BARTs LMP2A など 潜伏感染遺伝子

細胞はアポトーシスにより死滅

細菌•ウイルス 患者数 ピロリ菌 770,000 パピローマウイルス 640,000 B及び_{C型肝炎ウイルス} 590,000 EBウイルス 120,000 カポジ肉腫ウイルス 44,000 成人T細胞白血病 ウイルス 3,000 ビルハルツ住血吸虫、肝吸虫など 2,000 総ての感染症 2,200,000

Lancet Glob Health 9: e609-16 (2016)

世界の感染症に起因するがん患者数

(2012年)

非感染者　5% 感染者　95％

全人口の95%がEBウイルスに感染

EBウイルスは腫瘍ウイルスである

一億人以上の日本人

免疫機能がEBV感染細胞の増殖を抑制している

0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 1 2 0 0 date EBV copies/100000cells

⽣生体肝移植

リンパ節腫脹 免疫抑制剤減量量 EBV ゲノムコピー /10,000 細胞 105 106 107 108 0 5 10 15 (日) (総細胞数 ) ⽣生体外でのEBV感染Bリンパ球の増殖 EBウイルス 抗原陽性細胞

EBウイルス関連癌

上咽頭がん ホジキンリンパ腫 移植後リンパ腫 EBV関連胃がん バーキットリンパ腫

潜伏持続感染細胞から癌が生じる

EBV

関連がん

EBV

潜伏持続感染細胞

胃癌

食道 十二指腸 幽門部 _胃底部 噴門部

上咽頭癌

下咽頭 口腔咽頭 鼻咽頭 鼻腔 舌

EBV感染症は予防・治療法がない

• 抗ウイルス剤：核酸誘導体

アシクロビル　　

バラシクロビル

ガンシクロビル

　　 バルガンシクロビル

フォスカルネット

• 抗水痘ガンマグロブリン剤

• 水痘ワクチン

単純ヘルペスウイルス

水痘帯状疱疹ウイルス

サイトメガロウイルス

水痘帯状疱疹ウイルス

EBウイルス感染細胞が産生するmiRNAs

BHRF1 miRNAs

1, 3, 4, 15,5,16,17,6 21,18, 7, 8, 9, 22,10,11,12,19,20,13,14 2 EBNA1 クラスター1 クラスター2 1-1 1-2, 1-3 EBNA2

EBVゲノム

oriP LMP2 Pre-miRNA miRNA 5' RISC 3' mRNA 5' 3' 3’UTR RISC LMP1

BART miRNAs (

BARTs

)

抑制

Dicer

miRNAの作用機序

mRNA

3 UTR

AAAAAAAA

Cap

5 UTR

AA

Cap

PolyAの分解

抑制

_{silencing complex} RNA-induced

miRNAは、mRNAの3’UTRに結合し、

タンパク質翻訳過程を阻害

タンパク質コード領域

タンパク質コード領域

BART miRNAs(BARTs)が抑制する遺伝子

miRNA Target

アポトーシス

miR-BART3 DICE1 FEM1B CASZ1a miR-BART4-5p BID OCT1 miR-BART16 CREBBP SH2B3 miR-BART22 PPP3R1 PAK2 TP53INP1 miR-BART20-5p BAD miRNA Target

溶解感染

miR-BART20-5p BZLF1/BRLF1 miR-BART6-5p DICER1

EBV  miRNA(BARTs)の

プロモーター活性の測定法

ルシフェラーゼ

プロモーター

リポーターベクター

転写因子の結合

ルシフェラーゼ

酵素

細胞抽出液

_発光

基質添加

P2 P1 P2 P1

BART miRNAs (BARTs)

調節領領域

Regulation of BART promoter region

P1 pGL4 pGL4 pGL4 pGL4 pGL4 pGL4

EBV (-) AGS cells EBV (+) AGS cells

* † † * AGS (-)細胞 AGS EBV(+)細胞

BARTsの新しい転写調節領域を同定

BARTsの新しい転写因子も同定

ETS A, B, and C siRNAs suppress

BART promoter activity and transcription

Relative Luciferase Activity

pGL4 P1 pGL4 pGL4 † † †

Relative BART transcript level

siCont. siETS A siETS B siETS C siETS D

ETS A, B, and C siRNAs suppress

BART promoter activity and transcription

Relative Luciferase Activity

pGL4 P1 pGL4 pGL4 † † †

Relative BART transcript level

siCont. siETS A siETS B siETS C siETS D

Regulation of BART promoter region

P1 Enhancer pGL4 pGL4 pGL4 pGL4 pGL4 pGL4

Relative Luciferase Activity Repressor

EBV (-) AGS cells EBV (+) AGS cells

* † † * siCont. siETS A siETS B siETS C siETS D

Epithelial cell lines B cell lines

EBV - + - + 上皮細胞　　　　　　　　Bリンパ球 _高発現 低発現 中度発現 ETS A ETS B ETS C ETS D 　　　ルシフェラーゼ活性　

新規転写因子が新規転写調節領域に結合する

_BARTs P1 転写調節領域 Ets A

ETS A欠損細胞ではBARTsの発現が低下

miR-BART-1-5p miR-BART-7-3p

相対的な

発現

*

*

BARTs    クラスター1 　      クラスター2

A

BARTs

P1

EBVゲノム BARTs

P1

クラスター1 _{クラスター2} 宿主ゲノム

ETS  A⽋欠損

野⽣生型

AGS(-)細胞

AGS EBV (+)細胞

ETS A

相対的な 発現 LMP2A (ng) 相対的な 発現

ETS A BARTs

0 1 10 100 1000 0 1 10 100 1000

BARTs

EBV

野生型

EBER欠損

LMP2A欠損

LMP2A (ng) x ETS A BARTs P1 EBV genome LMP2A miRNA

ノックアウト

ノックイン

EBVの潜伏感染遺伝子が転写因子を正に制御

溶解感染が進行すると

感染細胞はアポトーシスに陥る

潜伏持続感染

アポトーシスで細胞死 BZLF1 BRLF1 腫瘍細胞増殖 EBNA1

溶解感染

LMP2A BARTs EBERs

LMP2A 欠損またはETS A破壊は

溶解感染を進行させる

相対的な

発現

Control TPA+SB

BZLF1

12

8

4

0

Control TPA+SB

1

0

相対的な

発現

2

3

4

5

AGS細胞 野生型 野生型 ETS A破壊 EBV 野生型 LMP2A破壊 野生型

溶解感染遺伝子発現

BARTs

x ETS A BARTs P1 EBV genome LMP2A miRNA

7AAD

Annexin V

2.02 16.26 8.52 24.22 10.46 23.22 AGS細胞 野生型 野生型 ETS A破壊 EBV 野生型 LMP2A欠損 野生型

LMP2A欠損またはETS A破壊

でアポトーシスが進行する

x

A

BARTs

P1

EBV genome LMP2A

アポトーシス

溶解感染

腫瘍形成促進

EBV感染上皮細胞ではLMP2AがETS Aの発現を促進する

ETS AがBARTsの発現を促進する

BARTsの発現は溶解感染とアポトーシスの進行を抑制する

発見：miRNAの発現を介したEBVの腫瘍化機構

EBV  miRNA(BARTs)の

相対的な

発現

_*

P <0.01

*

*

*

0 3 5 10 15 µM

YK-4-279

Ewing 肉腫、前立腺癌や一部の白血病に有効な抗腫瘍剤。

マウス投与実験(1.5 mg)でEWS-FLI1 の機能が亢進する癌の増殖を抑制。

Nature Medicine 15, 750-756, 2009

YK-4-279はBARTsの発現を抑制

Annexin V YK-4-279

DMSO

AGS(-) AGS(+) AGS(+) BZLF1 KO 9.6 5.0 9.38 5.88 3.82 7.16 10.0 6.64 10.78 18.92 6.40 7.68

対照

YK-4-279

9.6

5.0

10.0

6.6

9.4

5.9

10.8

18.9

3.9

7.2

6.4

7.7

Annexin V

7AAD

非感染

野生型EBV BZLF1欠損EBV

YK-4-279はEBVの溶解感染を誘導し

、

感染細胞をアポトーシスに導く

YK-4-279の作用機序

EBV感染

ETS

A

BART miRNAs

BZLF1

アポトーシス

YK-4-279

EBV感染

ETS

A

BART miRNAs

BZLF1

アポトーシス

腫瘍細胞増殖

腫瘍細胞死

EBV感染による宿主細胞の転写調節変化

を正常化することによる

、

Epstein-Barr

ウイルス関連癌に特異的な抗腫瘍剤の開発

発明

Ewing 肉腫に有効な抗腫瘍剤として開発された

YK-4-279が有効であることの一例

類似特許との相違

類似特許(United  States  Patent  20150329865)は、

多数あるEBウイルスmiRNAのうち

miR-‐‑‒BART20-‐‑‒5p

の活性を核酸薬により阻害し、ウイルス溶解感染を誘

導することでウイルス感染細胞を破壊させる。

それに対して、我々の提案は、

1)  １つのmiRNAだけに着⽬目せず、

30個以上のEBV  

miRNA

の発現を同時に抑制する。

2)  特定のETSファミリー遺伝⼦子を対象とし、化合物

を⽤用いてウイルス感染細胞にアポトーシスを誘導

することで、抗腫瘍作⽤用を発揮する。

新技術の特徴

l

 

ETSファミリー遺伝子の阻害はEBV潜伏感染細

胞に

特異的にアポトーシスを引き起こした

。

l

 

US 20050221490 A：「核酸誘導体を用いたDNA

ウイルス由来miRNA阻害剤」は、転写を抑制でき

ない。（

転写抑制の方が効果的

）

l

 

ユーイング肉腫の治療薬として前臨床試験が終

了した

YK-4-279

が、EBV感染細胞にアポトーシ

スを誘導できた。

想定される用途

l

 

Epstein-Barrウイルス関連胃癌

や

上咽頭癌

、

口

腔がん

などのEBV関連上皮性腫瘍の治療薬。

l

 

腫瘍以外に、

慢性活動性EBウイルス

増殖症な

どの重篤感染症の治療への応用も期待される。

l

 

YK-4-279がユーイング肉腫以外に前立腺癌に

も有効である（リポジショニング）ことから、新規

化合物は、

EBV関連腫瘍以外にも適応拡大でき

る

可能性がある。

実用化に向けた課題

l

 

YK-4-279は、転写活性化因子EWS-FLI1とRNAヘ

リカーゼの結合の阻害薬である。EtsAの活性も抑

制するが、さらなる

至適化

が可能だと考えられる。

l

 

現在、効果確認が試験管レベルに留まっている。

l

 

今後、SCID

マウス移植モデル

を用いて有効性を確

認し、臨床試験に適用するための条件設定を行う

必要がある。

企業への期待

l

 

創薬候補となるライブラリーの提供。

l

 

実験モデルマウスを用いた薬効の評価と毒性

試験の共同研究を希望。

l

 

miRNAの標的薬剤開発にご興味がある場合

は、核酸薬と、本発明との組み合わせを希望。

本技術に関する知的財産権

•  発明の名称 ：Epstein-Barr ウイルス関連癌に

　特異的な抗腫瘍剤

•  出願番号

：特願2017-160164(2017年8月23日)

•  出願人

：島根大学

•  発明者

：吉山　裕規、飯笹　久、キム　ヒョジ

産学連携の経歴

•  1998年

「ピロリ菌に特異的な抗菌治療薬の開発」

代表 ：吉山　裕規(山口大学微生物)

：加守田　修(帝国化学産業→ナガセケムテックス)

•  2002年6月

日経バイオビジネス「EBウイルスベクター 」

•  2003年1月10日　大学発ベンチャー「イーベック」設立に参加

•  2003年-2004年　平成15-16年度経済産業省：

地域新生コンソーシアム研究開発事業

「医薬素材としての完全ヒト抗体の作製と大量産生システムの確立 」

研究開発委員会委員

分担研究開発項目： 「完全ヒト抗体作製法の開発 」

平成15年度(総額5,500万円中配分額157万6,550円)

平成16年度(総額966,3千円中配分額210万円)

お問い合わせ先

島根⼤大学産学連携コーディネーター

中村  守彦

ＴＥＬ 0853－20－2912

ＦＡＸ 0853－20－2913

e-‐‑‒mail nkmr0515＠med.shimane-‐‑‒u.ac.jp

松下  幸之助

ＴＥＬ 0852－60－2292

ＦＡＸ 0852－60－2395