僧帽弁閉鎖不全症犬の
血清中脂肪酸組成に関する基礎的研究
(Basic study on serum fatty acid compositions in dogs with mitral insufficiency)
吉松 宏基
僧帽弁閉鎖不全症犬の
血清中脂肪酸組成に関する基礎的研究
(Basic study on serum fatty acid compositions in dogs with mitral insufficiency)
吉松 宏基
日本獣医生命科学大学大学院獣医生命科学研究科
(指導教授 小山 秀一)
平成 28年 3 月
目次
略語一覧 1
第1 章 序論 3
第2 章 犬の血清中脂肪酸の測定法の検討 7
1 材料と方法 7
1) 血清サンプル 7
2) ガスクロマトグラフィー用の標準物質 7
3) 血清中脂肪酸のメチル化と精製 8
4) GC法による脂肪酸濃度の測定 10
5) 内部標準物質の回収率 10
6) 分析法のバリデーション 10
7) 統計学的処理 11
2 結果 12
1) 血清中脂肪酸のメチル化とメチル化脂肪酸の精製 12
2) 脂肪酸の検出と定量 12
3) 用いた血清量の違いによる脂肪酸濃度の直線性 13
4) 内部標準物質の回収率 14
5) 今回の測定法と従来法の測定値の相関 14
6) 血清中脂肪酸濃度の検者内誤差 14
(1) 血清中脂肪酸濃度の同時再現性 14
(2) 血清中脂肪酸濃度の日差再現性 14
7) 血清中脂肪酸濃度の検者間誤差 15
3 考察 16
4 小括 19
5 図表 21
第3章 犬の血清中脂肪酸を測定するための採血時間についての検討 45
1 材料と方法 45
1) 供試動物 45
2) 血清検体 45
3) 血清中脂肪酸濃度の測定と重量比の算出 46 4) 血清中トリグリセリド(TG)と総コレステロール(T-Cho)の測定 46 5) フード中の脂肪酸濃度の測定 46 6) 統計学的処理 46
2 結果 47
1) 血清中脂肪酸濃度 47
2) 血清中脂肪酸重量比 48
3) 血清中の TGおよび T-Choの濃度 49
4) フード中の脂肪酸濃度 49
3 考察 51
4 小括 53
5 図表 55
第4 章 健常犬における血清中脂肪酸組成の基準値の検討 61
1 材料と方法 61
1) 供試動物 61
2) 血清検体 62
3) 血清中脂肪酸濃度の測定 62
4) 測定値分布における中央の95％区間の算出 62
5) 統計学的処理 63
2 結果 64
1) 血清中脂肪酸濃度の群間比較 64 2) 血清中脂肪酸濃度の 95%区間 65 3) 血清中脂肪酸重量比の95%区間 66 4) 血清中脂肪酸比率の 95%区間 67
3 考察 68
4 小括 72
5 図表 73
第5 章 僧帽弁閉鎖不全症犬の血清中脂肪酸組成の検討 79
1 材料と方法 79
1) 供試動物 79
2) 血清検体 80
3) 血清中脂肪酸の測定方法と測定項目 80 4) 心エコー検査 80 5) 参照値との比較 81
6) EPA濃度と EPA/AA のカットオフ値の設定 81
7) 統計学的処理 81
2 結果 82
1) MIの I 群とII 群における群内比較 82
(1) 血清中脂肪酸濃度の比較 82 (2) 血清中脂肪酸重量比の比較 82 (3) 脂肪酸比率の比較 82 (4) 心エコーパラメーターの比較 82
2) MI群の群間比較 83 (1) 血清中脂肪酸濃度の比較 83 (2) 血清中脂肪酸重量比の比較 83 (3) 脂肪酸比率の比較 84 (4) 心エコーパラメーターの比較 84 3) 血清中脂肪酸組成と心エコーパラメーターの関係 84 (1) 血清中脂肪酸濃度と心エコーパラメーターの関係 84 (2) 血清中脂肪酸重量比と心エコーパラメーターの関係 85 (3) 脂肪酸比率と心エコーパラメーターの関係 85
4) 血清中脂肪酸の参照値との比較 85
5) EPA濃度と EPA/AA のカットオフ値 85
3 考察 86
4 小括 90
5 図表 91
第6 章 総括 111
謝辞 115
参考文献 117
Summary of Doctor Thesis 127
略 語 一 覧
AA: ア ラ キ ド ン 酸 ALA: α-リ ノ レ ン 酸
DGLA: ジ ホ モ-γ-リ ノ レ ン 酸 DHA: ド コ サ ヘ キ サ エ ン 酸 DPA: ド コ サ ペ ン タ エ ン 酸 DTA: ド コ サ テ ト ラ エ ン 酸 EPA: エ イ コ サ ペ ン タ エ ン 酸 FA: 脂 肪 酸
FS: 左 室 内 径 短 縮 率 GC: ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ
IL: イ ン タ ー ロ イ キ ン
LA: リ ノ ー ル 酸
LA/Ao: 左 房 径/大 動 脈 径 比 LT: ロ イ コ ト リ エ ン
LVIDd/Ao: 拡 張 末 期 左 室 内 径 指 数 LVIDs/Ao: 収 縮 末 期 左 室 内 径 指 数 MA: 5, 8, 11-エ イ コ サ ト リ エ ン 酸 MI: 僧 帽 弁 閉 鎖 不 全 症
MUFA: 一 価 不 飽 和 脂 肪 酸 PG: プ ロ ス タ グ ラ ン ジ ン PUFA: 多 価 不 飽 和 脂 肪 酸 SFA: 飽 和 脂 肪 酸
TNF-α: 腫 瘍 壊 死 因 子-α
第 1 章 序 論
僧 帽 弁 閉 鎖 不 全 症(MI)は 、 僧 帽 弁 自 体 や そ れ を 支 え る 腱 索 の 病 変 に よ り 左 室 か ら 左 房 へ 血 液 の 逆 流 が 生 じ る 場 合 や 、 左 室 が 拡 張 あ る い は 肥 大 す る こ と で 二 次 的 に 僧 帽 弁 逆 流 が お こ る 病 態 で あ る 。 前 者 で は 主 に 僧 帽 弁 の 粘 液 腫 様 変 性 に よ る 弁 の 逸 脱 や 腱 索 の 断 裂 な ど が 主 な 原 因 と な り 1–3、後 者 で は 拡 張 型 あ る い は 肥 大 型 心 筋 症 が 原 因 と し て あ げ ら れ る 。 そ の う ち 、 粘 液 種 様 変 性 に よ る MI は 、 犬 に お け る 最 も 一 般 的 な 慢 性 心 疾 患 で あ る 4。近 年 、犬 の MI の 治 療 に は 、一 般 的 な 心 疾 患 治 療 薬 以 外 に 種 々 の サ プ リ メ ン ト が 使 用 さ れ る よ う に な っ て い る 。 そ し て 、 そ れ ら の 中 に は 脂 肪 酸 を 主 成 分 と す る 製 品 が あ り MI 症 例 に も 使 用 さ れ て い る が 、 病 態 と 血 清 中 脂 肪 酸 組 成 に 関 す る 検 討 は わ ず か で あ る 。
脂 肪 酸 は 、 正 常 な 心 筋 の 主 要 な エ ネ ル ギ ー 源 で あ り 、 そ れ は 心 筋 に お け る ATP 産 生 の 60～90％ を 占 め る 5,6。し か し 、心 筋 に 負 荷 が 加 わ る と 、そ の エ ネ ル ギ ー は 脂 肪 酸 利 用 か ら ブ ド ウ 糖 利 用 へ と 傾 く switch from fatty acid to glucose oxidation 現 象 が 起 こ る 。 脂 肪 酸 が 代 謝 さ れ て CO2 と な る 方 が 、CO2 当 た り の ATP 産 生 量 は ブ ド ウ 糖 よ り も 多 い 。 し か し 、 脂 肪 酸 は グ ル コ ー ス に 比 べ よ り 多 く の 酵 素 を 必 要 と す る た め 、消 費 す る 酸 素 当 た り の ATP 産 生 量 は 、脂 肪 酸 に 比 べ ブ ド ウ 糖 が 上 回 る た め 、 心 不 全 に お い て は 脂 肪 酸 よ り も ブ ド ウ 糖 を エ ネ ル ギ ー と す る 方 が 有 利 と な る 。 さ ら に 、 心 不 全 で は 交 感 神 経 の 活 性 化 に よ り 血 清 中 の 遊 離 脂 肪 酸 は 増 加 す る 7,8。こ う し た 心 不 全 に お け る 脂 肪 酸 代 謝 の 変 化 は 、 心 筋 中 へ の 脂 肪 蓄 積 を 引 き 起 こ し 、 心 筋 細 胞 膜 の 構 築 の 変 化 と 心 筋 細 胞 内 の カ ル シ ウ ム イ オ ン 調 節 の 破 綻 を 引 き 起 こ す た め 、 心
不 全 を さ ら に 悪 化 さ せ る と い わ れ て い る 6,9,10。
脂 肪 酸 の 中 で も エ イ コ サ ペ ン タ エ ン 酸(EPA)、 ジ ホ モ-γ-リ ノ レ ン 酸 (DGLA)そ し て ア ラ キ ド ン 酸(AA)は 、 プ ロ ス タ グ ラ ン ジ ン(PG)、 プ ロ ス タ サ イ ク リ ン 、 ト ロ ン ボ キ サ ン そ し て ロ イ コ ト リ エ ン(LT)な ど の エ イ コ サ ノ イ ド の 基 質 11で あ り 、EPA か ら は 3 シ リ ー ズ の PG や 5 シ リ ー ズ の LT な ど の 炎 症 抑 制 性 エ イ コ サ ノ イ ド が 産 生 さ れ る 。 一 方 、AA か ら は 2 シ リ ー ズ の PG や 4 シ リ ー ズ の LT な ど の 炎 症 増 強 性 エ イ コ サ ノ イ ド が 産 生 さ れ る 12。EPA の 組 織 親 和 性 は AA よ り も 優 位 な た め 、 EPA は AA の 代 謝 を 競 合 的 に 阻 害 す る 12。 そ の た め 、 ヒ ト で は EPA が 不 整 脈 、 高 血 圧 そ し て 動 脈 硬 化 症 な ど の 心 血 管 系 疾 患 に 対 し て 抵 抗 性 を 増 強 す る と 考 え ら れ て お り 11–13、 特 に 冠 動 脈 疾 患 で は 、 血 清 中 EPA濃 度 の 上 昇 は 、そ の 発 症 率 と 反 比 例 す る こ と が 報 告 さ れ て い る 14。
無 症 候 性 の 慢 性 弁 膜 疾 患 犬 に 対 し て EPA を 投 与 し た 報 告 で は 、病 態 の 進 行 に よ る 左 房 径 と 左 室 径 の 拡 張 を 抑 制 し て い る 15。 さ ら に 、MI モ デ ル 犬 に 対 す る EPA の 投 与 は 、 心 筋 中 の EPA 濃 度 の 増 加 と 心 拍 数 を 低 下 さ せ る こ と が 報 告 さ れ て い る 16。 ま た 、 う っ 血 性 心 不 全 の 犬 に お け る 血 清 中 の EPA、ド コ サ ヘ キ サ エ ン 酸(DHA)お よ び AA の 濃 度 は 、 健 常 犬 よ り も 低 値 で あ り 、EPA と DHA を 経 口 投 与 す る こ と で 心 臓 悪 液 質 は 改 善 し 17、 心 筋 の リ モ デ リ ン グ を 抑 制 す る こ と で 不 整 脈 の 発 現 率 を 低 下 さ せ る こ と が 報 告 さ れ て い る 18,19。 こ の よ う に 、MI を 含 む 心 不 全 犬 に 対 す る EPA 投 与 の 有 用 性 は 報 告 さ れ て い る が 、血 清 中 脂 肪 酸 組 成 と 心 不 全 の 病 態 と の 関 係 は 明 ら か と な っ て い な い 。 そ の た め 、 MI 犬 に 対 す る EPA 投 与 の 根 拠 は 経 験 的 な も の で あ り 、 そ の 投 与 の タ イ ミ ン グ に つ い て は 検 討 さ れ て い な い 。 さ ら に 、 犬 の 血 清 中 脂 肪 酸 の 測 定 方 法 に つ い て も 詳 細 な 検 討 は さ れ て い な い 。
犬 の 血 清 中 脂 肪 酸 の 測 定 に は 、 通 常 ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ(GC)法 や 高 速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ 法 が 用 い ら れ る 20。GC 法 は 、 分 離 能 が 高 く 、 少 量 の 試 料 で 測 定 が 可 能 で あ る こ と か ら 多 用 さ れ て い る 。 脂 肪 酸 の 測 定 用 試 料 を GC 法 に 供 す る た め に は 、 試 料 を 気 化 し や す い 状 態 に す る 必 要 が あ る た め 、 血 清 か ら 抽 出 さ れ た 脂 質 は メ チ ル 化 し な け れ ば な ら な い 。 そ の 脂 質 抽 出 方 法 と し て 、Folch 法 21や Bligh and Dyer 法 22 な ど が 一 般 的 で あ る が 、 そ れ ら の 方 法 に は 数 mL 単 位 の 試 料 や 還 流 装 置 な ど の 特 殊 な 器 具 を 必 要 と す る 。 ま た 、 脂 肪 酸 の メ チ ル 化 に は ジ ア ゾ メ タ ン 法 や 三 フ ッ 化 ホ ウ 素 法 が 用 い ら れ て い る 。 三 フ ッ 化 ホ ウ 素 法 に よ る 処 理 過 程 に は 100℃ 程 度 の 加 熱 を 必 要 と す る こ と か ら 、 不 安 定 な 状 態 に あ る PUFA は 熱 分 解 す る 恐 れ が あ る 。 他 方 、 ジ ア ゾ メ タ ン 法 は ジ ア ゾ メ タ ン 自 体 に よ る 皮 膚 や 呼 吸 器 に 対 す る 毒 性 お よ び 衝 撃 や 熱 な ど に よ る 爆 発 の 危 険 性 を と も な う た め 、そ の 扱 い に 注 意 を 要 す る 23。
近 年 、 主 に 植 物 や 酵 母 に 含 ま れ る 脂 肪 酸 を 測 定 す る こ と を 目 的 に 、 脂 肪 酸 の メ チ ル 化 や メ チ ル 化 脂 肪 酸 を 精 製 す る た め の キ ッ ト が 開 発 さ れ た 。 こ の メ チ ル 化 キ ッ ト を 用 い る こ と に よ り 、 従 来 別 々 に 行 っ て い た 脂 肪 酸 の 抽 出 と メ チ ル 化 が 短 時 間 の う ち に 同 時 に 行 う こ と が 可 能 と な る 。 さ ら に 、 メ チ ル 化 脂 肪 酸 の 精 製 キ ッ ト は 、 メ チ ル 化 処 理 後 の 試 料 中 に 含 ま れ る 不 純 物 に よ る 測 定 器 へ の ダ メ ー ジ を 払 拭 し 、 安 定 し た 測 定 値 を 得 る こ と が 可 能 だ と い わ れ て い る 。 犬 に お い て 、 こ れ ら の キ ッ ト を 用 い た 血 清 中 脂 肪 酸 の 測 定 に 関 し て は 、GC-MS 法 で の 重 量 比 を 求 め た 報 告 が 一 報 の み 存 在 す る が 24、 水 素 炎 イ オ ン 化 検 出 器 の GC に よ る 犬 の 血 清 中 脂 肪 酸 測 定 に 関 し て は 未 だ 報 告 が な い 。
そ こ で 、 犬 の 心 不 全 の 原 因 と し て 最 も 多 い MI に 注 目 し 、 心 不 全 の 病 態 と 血 清 中 脂 肪 酸 組 成 の 関 係 を 検 討 す る 目 的 の た め に 、本 研 究 で は 、
第 2 章 に お い て 脂 肪 酸 メ チ ル 化 キ ッ ト と メ チ ル 化 脂 肪 酸 精 製 キ ッ ト を 利 用 し た 犬 の 血 清 中 脂 肪 酸 の 測 定 方 法 に つ い て 検 討 し た 。第 3 章 で は 、 脂 肪 酸 測 定 用 の 血 清 を 得 る 目 的 で 適 切 な 採 血 時 点 を 決 定 す る た め に 、 健 常 犬 に お け る 血 清 中 脂 肪 酸 の 日 内 変 動 に つ い て 検 討 し た 。 第 4 章 で は 、 健 常 犬 の 血 清 中 脂 肪 酸 組 成 の 基 準 値 に つ い て 検 討 し た 。 そ し て 、 第 5 章 で は MI 犬 を 病 期 で 分 類 し 、 血 清 中 脂 肪 酸 組 成 を 比 較 し た 。 さ ら に 、 脂 肪 酸 と 心 エ コ ー パ ラ メ ー タ ー の 関 連 を 確 認 し た 。 ま た 、MI 犬 に 対 す る EPA 投 与 の タ イ ミ ン グ に つ い て 検 討 し た 。
第 2 章 犬 の 血 清 中 脂 肪 酸 の 測 定 法 の 検 討
脂 肪 酸 の メ チ ル 化 と メ チ ル 化 脂 肪 酸 の 精 製 の た め の キ ッ ト を 用 い た ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ(GC)法 の 獣 医 領 域 で の 実 用 性 を 確 認 す る た め に 、 今 回 の 測 定 法 を 従 来 法 に よ る 測 定 値 と 比 較 し 、 同 時 再 現 性 と 日 差 再 現 性 に よ る 検 者 内 誤 差 、 お よ び 検 者 間 誤 差 を 検 討 し た 。
1 材 料 と 方 法 1) 血 清 サ ン プ ル
血 液 は 、 日 本 獣 医 生 命 科 学 大 学 で 飼 育 管 理 さ れ 身 体 検 査 、 完 全 血 球 算 定(CBC)お よ び 血 液 化 学 検 査 に お い て 明 ら か な 異 常 を 認 め な い 7 歳 齢 の 雌 ビ ー グ ル(8.0kg)と 3 歳 齢 の 雄 ビ ー グ ル(11.2kg)の 頚 静 脈 か ら 無 麻 酔 下 で 採 血 し た 。採 血 後 、血 液 は 30 分 間 室 温 で 静 置 し た 後 、3000rpm で 15 分 間 遠 心 し て 血 清 を 分 離 し た 。得 ら れ た 血 清 は 、脂 肪 酸 の 測 定 ま で-20℃ で 冷 凍 保 存 し た 。
2) ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー 用 の 標 準 物 質
ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー 用 の 標 準 物 質 は 、 脂 肪 酸 の 同 定 用 と 検 量 線 作 成 用 、 定 量 用 そ し て メ チ ル 化 処 理 用 の 3 種 類 を 用 い た 。 同 定 用 と 検 量 線 作 成 用 の 標 準 液 と し て 用 い る 脂 肪 酸 の 種 類 は 、 ヒ ト に お い て 一 般 的 に 測 定 さ れ て い る 24 種 類 の 脂 肪 酸 25を 参 考 に し て 選 択 し た(Table 1)。
脂 肪 酸 の 同 定 と 定 量 用 の 検 量 線 を 作 成 す る た め に 、 ヒ ト の 血 清 中 脂 肪 酸 の 測 定 項 目 で あ る 24 種 類 の 脂 肪 酸 の う ち 21 種 類 を 含 む ス ペ ル コ 37脂 肪 酸 メ チ ル エ ス テ ル(FAME)ミ ッ ク ス(シ グ マ ア ル ド リ ッ チ ジ ャ パ ン, 東 京)に 加 え て 、ド コ サ テ ト ラ エ ン 酸(DTA)メ チ ル エ ス テ ル(シ グ マ
ア ル ド リ ッ チ ジ ャ パ ン)、ド コ サ ペ ン タ エ ン 酸(DPA)メ チ ル エ ス テ ル(シ グ マ ア ル ド リ ッ チ ジ ャ パ ン)お よ び エ イ コ サ ト リ エ ン 酸(MA)メ チ ル エ ス テ ル(シ グ マ ア ル ド リ ッ チ ジ ャ パ ン)を 用 い た 。
定 量 用 の 内 部 標 準 物 質 は 、 同 定 用 と 検 量 線 作 成 用 の 標 準 液 中 に 含 ま れ な い ヘ プ タ ン 酸 メ チ ル(シ グ マ ア ル ド リ ッ チ ジ ャ パ ン)を ヘ キ サ ン で 150 μg/mLに 調 整 し て 用 い た 。メ チ ル 化 処 理 の た め の 内 部 標 準 物 質 は 、 37FAME ミ ッ ク ス に 含 ま れ て お り 、血 清 中 に 含 ま れ な い 炭 素 数 が 奇 数 で あ る ペ ン タ デ カ ン 酸(シ グ マ ア ル ド リ ッ チ ジ ャ パ ン)を 選 択 し 、 ヘ キ サ ン で 150 μg/mL に 調 整 し た 。
検 量 線 の 作 成 用 の ス ペ ル コ 37FAME ミ ッ ク ス は 、 ヘ キ サ ン(和 光 純 薬 工 業, 大 阪)で 50mg/mL に 調 整 し た 後 、 さ ら に ヘ キ サ ン で 2.5 倍 か ら 5000 倍 ま で 6 段 階 に 希 釈 し て 用 い た(Table 2)。 ま た 、DTA、DPA そ し て MA の 3 種 類 の FAME は 、そ れ ぞ れ 10000 μg/mL、5000 μg/mL そ し て 500 μg/mL に 調 整 し た 後 に 混 合 し 、 そ の 混 合 液 を ヘ キ サ ン で 10 倍 か ら 10000 倍 ま で の 5 段 階 に 希 釈 し て 用 い た(Table 3)。 こ れ ら 11 種 類 の 溶 液 に 定 量 用 の 内 部 標 準 物 質 で あ る ヘ プ タ ン 酸 メ チ ル を そ れ ぞ れ 30 μg/mL に な る よ う に 添 加 し た 。
3) 血 清 中 脂 肪 酸 の メ チ ル 化 と メ チ ル 化 脂 肪 酸 の 精 製
脂 肪 酸 の メ チ ル 化 の た め に 脂 肪 酸 メ チ ル 化 キ ッ ト(ナ カ ラ イ テ ス ク 株 式 会 社, 京 都)を 用 い た 。 処 理 過 程 で の 血 清 中 脂 肪 酸 の 酸 化 を 防 ぐ た め に 酸 化 防 止 剤 と し て の 2,6-di-tert-butyl-p-cresol(BHT)(ナ カ ラ イ テ ス ク 株 式 会 社)は 、ア セ ト ン で 0.05%の 濃 度 に 調 整 し て 用 い た 。血 清 を 吸 着 さ せ る た め の 濾 紙(定 性 濾 紙 No.2, 東 洋 濾 紙 株 式 会 社, 東 京)は 、 0.05%BHT 溶 液 に 5 分 間 浸 し 、 さ ら に 抗 酸 化 作 用 を 強 固 に す る た め に 別 の 0.05%BHT溶 液 に 再 度 5 分 間 浸 し た 後 に 風 乾 し た 。風 乾 し た BHT
濾 紙 の サ イ ズ は 1.5×1.5cm を 基 本 と し た が 、 試 料 と し て 用 い る 血 清 の 量 に 応 じ て 1.5×3.0cm と 1.5×5.0cm の サ イ ズ も 用 い た 。血 清 量 は 、脂 肪 酸 メ チ ル 化 キ ッ ト に 付 属 し て い た 血 液 を 用 い た 際 の 扱 い 方 法 の 説 明 を 参 考 に 、1 回 量 と し て そ れ ぞ れ 25 μL、50 μL、100 μL そ し て 200 μL を 用 い た 。そ れ ぞ れ の 血 清 と 150 μg/mL の ペ ン タ デ カ ン 酸 溶 液 200 μL は 、同 一 の BHT 処 理 濾 紙 に 吸 着 さ せ 減 圧 デ シ ケ ー タ ー で 少 な く と も 1 時 間 乾 固 し 、 得 ら れ た 乾 燥 濾 紙 を 脂 肪 酸 の メ チ ル 化 の た め の サ ン プ ル と し た 。 サ ン プ ル を メ チ ル 化 す る 手 順 は 、 三 フ ッ 化 ホ ウ 素 法 と ア ル キ ル エ ス テ ル 化 法 を 基 本 と し た 脂 肪 酸 メ チ ル 化 キ ッ ト の 使 用 方 法 に 従 っ た(Fig. 1)。す な わ ち 、第 1 工 程 は 、有 機 酸 を 含 む 試 料 を 炭 素 数 1～4 の 低 級 ア ル コ ー ル お よ び 炭 素 数 1～4 の ア ル コ キ シ ド と 反 応 さ せ 、エ ス テ ル 結 合 し た 有 機 酸 を ア ル キ ル エ ス テ ル 化 さ せ る 。 第 2 工 程 は 三 フ ッ 化 ホ ウ 素 の 存 在 下 で 前 の 工 程 で 得 ら れ た 反 応 混 合 物 と 炭 素 数 1～4 の 低 級 ア ル コ ー ル を 37℃ で 反 応 さ せ る こ と に よ る 遊 離 有 機 酸 の ア ル キ ル エ ス テ ル 化 で あ る 26。さ ら に 、メ チ ル 化 脂 肪 酸 は 、精 製 し な い ま ま GC 法 に 用 い る と 、 疎 水 性 溶 媒 や 不 純 物 の た め に カ ラ ム の 劣 化 や ク ロ マ ト グ ラ フ 分 析 に お け る テ ー リ ン グ が 生 じ る た め 、メ チ ル 化 し た 脂 肪 酸 は 、 直 ち に メ チ ル 化 脂 肪 酸 精 製 キ ッ ト(ナ カ ラ イ テ ス ク 株 式 会 社)に 供 し た (Fig. 2)。メ チ ル 化 脂 肪 酸 の 精 製 は 、試 験 管 に 設 置 し た シ リ カ ゲ ル カ ー ト リ ッ ジ に 前 洗 浄 液 と し て ヘ キ サ ン 3mL を 注 入 し 、自 然 滴 下 に よ り カ ー ト リ ッ ジ を 洗 浄 し た 。 前 洗 浄 液 が 滴 下 し た 後 に 、 メ チ ル 化 し た 試 料 を カ ー ト リ ッ ジ に 注 入 し 、自 然 滴 下 に よ り カ ー ト リ ッ ジ に 吸 着 さ せ た 。 そ の 後 、洗 浄 液 と し て ヘ キ サ ン 3mL を カ ー ト リ ッ ジ に 注 入 し 、自 然 滴 下 に よ る 洗 浄 を 行 っ た 。そ の 後 、カ ー ト リ ッ ジ を 別 の 試 験 管 に 移 設 し 、 1.5%の 酢 酸 メ チ ル を 含 む ヘ キ サ ン 溶 液 3mL を カ ー ト リ ッ ジ に 注 入 し 、
メ チ ル 化 脂 肪 酸 を 溶 出 さ せ た 。 得 ら れ た 溶 液 は 、 窒 素 ガ ス で 乾 固 し た 後 に 、200 μL の ヘ プ タ ン 酸 メ チ ル 溶 液 と 800 μL の ヘ キ サ ン 溶 液 で 溶 解 し 、GC 法 に よ る 測 定 に 用 い た 。
4) GC 法 に よ る 脂 肪 酸 濃 度 の 測 定
GC 法 に は 水 素 炎 イ オ ン 化 検 出 器 を 備 え た GC 装 置(GC-2010,島 津 製 作 所, 京 都)を 用 い た 。カ ラ ム は 、Rtx-2560(100m×0.25mm× 0.25 μm, RESTEK Corporation, PA, U.S.A.)を 用 い 、 キ ャ リ ア ガ ス で あ る ヘ リ ウ ム ガ ス の 流 速 は 20cm/秒 と し た 。検 出 器 に は 水 素 炎 イ オ ン 化 検 出 器 を 用 い て 、注 入 口 と 検 出 器 の 温 度 は と も に 250℃ と し た 。カ ラ ム オ ー ブ ン の 温 度 は 、140℃ で 2 分 間 保 持 し た 後 、240℃ ま で 毎 分 4℃ ず つ 昇 温 さ せ 、240℃ で 23 分 間 保 持 し 、 ス プ リ ッ ト 比 は 1:25 と し た 。 脂 肪 酸 濃 度 は 、専 用 解 析 ソ フ ト で あ る GCsolution(島 津 製 作 所)を 用 い て 内 部 標 準 法 に よ り 求 め た 。 検 出 限 界 値 は 、 検 量 線 を 基 に GCsolution を 用 い て 残 渣 標 準 偏 差 か ら 求 め た 。GCsolution を 用 い て 得 ら れ た 脂 肪 酸 の 濃 度 は 、 ペ ン タ デ カ ン 酸 の 検 出 濃 度 を 基 準 に 補 正 し 、1mL 当 た り の 濃 度 と し て 求 め た 。
5) 内 部 標 準 物 質 の 回 収 率
内 部 標 準 物 質 で あ る ヘ プ タ ン 酸 と ペ ン タ デ カ ン 酸 の 回 収 率 は 、 添 加 し た 標 準 物 質 の 濃 度 を 、 そ れ ぞ れ の 測 定 後 に 求 め ら れ た 濃 度 で 除 す る こ と で 求 め た 。
6) 分 析 法 の バ リ デ ー シ ョ ン
分 析 法 の バ リ デ ー シ ョ ン は 、 今 回 の 測 定 方 法 と 従 来 法 の 測 定 値 の 比 較 、 検 者 内 誤 差 そ し て 検 者 間 誤 差 に よ り 行 っ た 。 ま ず 、3 つ の 血 清 を 今 回 の 測 定 方 法 お よ び 、Folch 法 と 三 フ ッ 化 ホ ウ 素 法 を 原 法 と す る 従 来 法 で そ れ ぞ れ 測 定 し 、 そ れ ら の 測 定 値 の 相 関 係 数 を 求 め た 。 次 に 、
検 者 内 誤 差 は 、 同 時 再 現 性 と 日 差 再 現 性 に よ り 確 認 し た 。 同 時 再 現 性 は 、 同 一 検 者 が 同 一 検 体 を 同 一 時 間 帯 に 5 回 測 定 し 変 動 係 数(CV)と し て 求 め た 。 そ し て 、 日 差 再 現 性 は 、 同 一 検 者 が 同 一 検 体 を 5 回 測 定 す る こ と を 3 日 間 行 い 、 そ の 平 均 値 の CV を 求 め た 。 さ ら に 、 検 者 間 誤 差 の 確 認 の た め に 、3 人 の 検 者 が 同 一 検 体 を 3 回 ず つ 測 定 し 、 検 者 間 の 測 定 値 を 比 較 し た 。
7) 統 計 学 的 処 理
血 清 中 脂 肪 酸 の 濃 度 は 平 均±標 準 偏 差(SD)で 示 し た 。CV は 、SD を 平 均 値 で 除 し て 得 ら れ た 値 を 100 倍 す る こ と に よ り 百 分 比 と し て 求 め た 。統 計 学 的 処 理 は 、統 計 処 理 ソ フ ト SPSSⓇ(Ver.15.0J for Windows, International Business Machines Corporation, NY, U.S.A)と R コ マ ン ダ ー(ver.1.4-8, http://dl. dropbox.com/u/8 196796/MyProgram.zip) を 用 い て 行 っ た 。 検 者 間 の 比 較 は 、 一 元 配 置 分 散 分 析 を 行 い 統 計 学 的 に 有 意 で あ っ た も の に 対 し て は Tukey 検 定 を 行 っ た 。 危 険 率 は 5％ 未 満 を も っ て 有 意 と し た 。
2 結 果
1) 血 清 中 脂 肪 酸 の メ チ ル 化 と メ チ ル 化 脂 肪 酸 の 精 製
脂 肪 酸 の メ チ ル 化 処 理 の 第 1 段 階 で あ る 血 清 を BHT 濾 紙 に 吸 着 さ せ る 操 作 で は 、 定 法 通 り の 1.5×1.5cm の BHT 濾 紙 に は 50 μL ま で の 血 清 は 完 全 に 吸 着 可 能 で あ っ た 。 し か し 、 血 清 量 が 100 μL と 200 μL の 場 合 は BHT 濾 紙 の サ イ ズ が 1.5×5.0cm で な け れ ば 血 清 の 吸 着 は 不 十 分 で あ っ た 。 そ の た め 、 こ れ 以 後 の 脂 肪 酸 の メ チ ル 化 処 理 に 用 い る BHT 濾 紙 の サ イ ズ は 、1.5×5.0cm と し た 。ま た 、メ チ ル 化 さ れ た 脂 肪 酸 の 精 製 は 、 い ず れ の 血 清 量 を 用 い て 得 ら れ た メ チ ル 化 脂 肪 酸 の 場 合 に お い て も メ チ ル 化 脂 肪 酸 精 製 キ ッ ト の 定 法 通 り に 処 理 す る こ と が 可 能 で あ っ た 。 脂 肪 酸 の メ チ ル 化 と メ チ ル 化 脂 肪 酸 の 精 製 は 、 そ れ ぞ れ 4 時 間 以 内 と 1 時 間 以 内 に 完 了 し た 。
2) 脂 肪 酸 の 検 出 と 定 量
GC 法 に よ り 得 ら れ た 標 準 液 の ク ロ マ ト グ ラ ム は Fig. 3 に 示 し た 。 同 定 用 標 準 物 質 40 種 類 と 内 部 標 準 物 質 2 種 類 の 合 計 42 種 類 の 脂 肪 酸 は す べ て 検 出 可 能 で あ っ た 。 こ れ ら の 脂 肪 酸 を 用 い て 作 成 し た 各 脂 肪 酸 の う ち 、 血 清 に お い て 定 量 可 能 で あ っ た 脂 肪 酸 の 検 量 線 は 、 い ず れ の 脂 肪 酸 に お い て も 相 関 係 数 0.999 以 上 の 高 い 相 関 を 示 し た (Fig. 4
～17)。 血 清 中 脂 肪 酸 の ク ロ マ ト グ ラ ム は Fig. 18 に 示 し た 。 血 清 量 を 25 μL と 50 μL と し た 場 合 に 定 量 可 能 で あ っ た 脂 肪 酸 は 、 飽 和 脂 肪 酸 (SFA)で は パ ル ミ チ ン 酸 と ス テ ア リ ン 酸 の 2 種 類 、 一 価 不 飽 和 脂 肪 酸 (MUFA)で は オ レ イ ン 酸 の 1種 類 、多 価 不 飽 和 脂 肪 酸(PUFA)で は DPA、 ド コ サ ヘ キ サ エ ン 酸(DHA)、リ ノ ー ル 酸(LA)、ア ラ キ ド ン 酸(AA)、DTA そ し て MA の 6 種 類 で あ り 、 合 計 で 9 種 類 で あ っ た 。 そ れ ぞ れ の 脂 肪 酸 の 濃 度 は Table 4 に 示 し た 。 一 方 、100 μL と 200 μL の 血 清 量 を 用
い た 場 合 に 定 量 可 能 で あ っ た 脂 肪 酸 の 種 類 は 、 前 述 の 9 種 類 に 加 え MUFA の パ ル ミ ト レ イ ン 酸 、PUFA の α-リ ノ レ ン 酸(ALA)、 エ イ コ サ ペ ン タ エ ン 酸(EPA)そ し て ジ ホ モ-γ-リ ノ レ ン 酸(DGLA)の 4 種 類 の 合 計 13 種 類 で あ っ た(Table 4)。 パ ル ミ チ ン 酸 や オ レ イ ン 酸 の よ う な 濃 度 の 高 い 脂 肪 酸 の ク ロ マ ト グ ラ ム 上 の ピ ー ク 面 積 は 、 血 清 量 が 25 μL か ら 200 μL ま で の す べ て で 明 確 に 求 め る こ と が で き た 。し か し 、ALA の よ う な 濃 度 の 低 い 脂 肪 酸 の ピ ー ク 面 積 は 、 血 清 量 が 100 μL 未 満 で は 求 め る こ と が で き な か っ た 。そ し て 、血 清 量 が 200 μL の 方 が 100 μL よ り も ピ ー ク 面 積 が 大 き く 明 瞭 で あ っ た(Fig. 19, 20)。
3) 用 い た 血 清 量 の 違 い に よ る 脂 肪 酸 濃 度 の 直 線 性
総 SFA、 総 MUFA そ し て 総 PUFA の 測 定 値 か ら 得 ら れ た 近 似 直 線 は 、い ず れ も 高 い 相 関 を 示 し た (Fig. 21)。SFA の パ ル ミ チ ン 酸 と ス テ ア リ ン 酸 の 測 定 値 か ら 得 ら れ た 近 似 直 線 の 相 関 係 数 は 、 そ れ ぞ れ 0.9998 と 0.9994 で あ っ た(Fig. 22)。MUFA の パ ル ミ ト レ イ ン 酸 は 、 25 μL と 50 μL の 血 清 量 で 検 出 で き な か っ た た め 、 そ の 近 似 直 線 は 得 ら れ な か っ た 。オ レ イ ン 酸 の 測 定 値 の 近 似 直 線 は 、相 関 係 数 0.9996 で あ っ た(Fig. 23)。 総 n-3 脂 肪 酸 、 総 n-6 脂 肪 酸 そ し て 総 n-9 脂 肪 酸 の 測 定 値 か ら 得 ら れ た 近 似 直 線 は 、 い ず れ も 相 関 係 数 が 0.999 以 上 で あ っ た(Fig. 24)。n-3 脂 肪 酸 の ALA と EPA は 、25 μL と 50 μL の 血 清 量 で 検 出 で き な か っ た こ と か ら 、こ れ ら の 近 似 直 線 は 得 ら れ な か っ た 。 DPA そ し て DHA の 測 定 値 か ら 得 ら れ た 近 似 直 線 の 相 関 係 数 は 、 そ れ ぞ れ 0.9988 と 0.9998 で あ っ た(Fig. 25)。n-6 脂 肪 酸 の DGLA は 、25 μL と 50 μL の 血 清 量 で 検 出 で き な か っ た た め に 、近 似 直 線 は 得 る こ と が で き な か っ た 。LA、AA そ し て DTA の 測 定 値 か ら 得 ら れ た 近 似 直 線 の 相 関 係 数 は 、そ れ ぞ れ 0.9999、0.9999 そ し て 0.9992 で あ っ た(Fig.
26)。n-9 脂 肪 酸 の オ レ イ ン 酸 と MA の 測 定 値 か ら 得 ら れ た 近 似 直 線 の 相 関 係 数 は そ れ ぞ れ 0.9996 と 0.9901 で あ り 、MA の 相 関 係 数 は す べ て の 脂 肪 酸 の 中 で 最 低 値 で あ っ た(Fig. 27)。
4) 内 部 標 準 物 質 の 回 収 率
内 部 標 準 物 質 で あ る ヘ プ タ ン 酸 と ペ ン タ デ カ ン 酸 は 、そ れ ぞ れ 11.69 分 と 20.56 分 に 検 出 し た 。 そ れ ぞ れ 測 定 前 の 濃 度 を 測 定 後 の 濃 度 で 除 す る こ と で 求 め た 回 収 率 は 、ヘ プ タ ン 酸 が 109±3.1%(n=30)で あ り 、ペ ン タ デ カ ン 酸 は 69.7±3.6%(n=30)で あ っ た 。
5) 今 回 の 測 定 法 と 従 来 法 の 測 定 値 の 相 関
今 回 の 測 定 法 と 従 来 法 に よ る 測 定 値 の 相 関 関 係 を 確 認 し た 結 果 、 定 量 可 能 で あ っ た13 種 類 の 脂 肪 酸 の 相 関 係 数 は 0.875か ら1.000の 範 囲 で あ り 、 高 い 相 関 を 示 し た(Table 5)。
6) 血 清 中 脂 肪 酸 濃 度 の 検 者 内 誤 差 (1) 血 清 中 脂 肪 酸 濃 度 の 同 時 再 現 性
同 一 検 者 が 同 一 検 体 を 同 一 時 間 帯 に 5 回 測 定 し て 求 め た 血 清 中 脂 肪 酸 濃 度 の 結 果 は 、Table 6 に 示 し た 。 総 脂 肪 酸 、 総 SFA、 総 MUFA そ し て 総 PUFA 濃 度 の CV は 、そ れ ぞ れ 2.0%、2.3%、2.1%そ し て 1.9%
で あ っ た 。総 n-3、総 n-6 そ し て 総 n-9 脂 肪 酸 の 濃 度 の CV は 、そ れ ぞ れ 1.9%、1.9%そ し て 2.2%で あ っ た 。SFA と MUFA の 各 脂 肪 酸 濃 度 の CV は 、2.0～3.7%の 範 囲 で あ っ た 。PUFA の 中 で は 、MA と EPA の 濃 度 の CV は そ れ ぞ れ 5.4%と 7.4%で あ っ た が 、 そ の 他 の PUFA の 濃 度 の CV は す べ て 4.8%未 満 で あ っ た 。
(2) 血 清 中 脂 肪 酸 濃 度 の 日 差 再 現 性
同 一 検 者 が 3 日 連 続 で 同 一 検 体 を 5 回 測 定 し 求 め た 血 清 中 脂 肪 酸 濃 度 の 結 果 は 、Table 7 に 示 し た 。 総 脂 肪 酸 、 総 SFA、 総 MUFA そ し て
総 PUFA の 濃 度 の CV は 、そ れ ぞ れ 1.8%、2.6%、2.1%そ し て 1.2%で あ っ た 。総 n-3、総 n-6 そ し て 総 n-9 脂 肪 酸 の 濃 度 の CV は 、そ れ ぞ れ 0.3%、1.4%そ し て 2.1%で あ っ た 。各 種 脂 肪 酸 の 濃 度 の CV は 、MA が 2.8%と 最 も 高 値 で あ っ た が 、 い ず れ の 脂 肪 酸 で も CV は 0.4～2.8%の 範 囲 で あ っ た 。
7) 血 清 中 脂 肪 酸 濃 度 の 検 者 間 誤 差
検 者 間 比 較 の 結 果 は 、Table 8 に 示 し た 。総 脂 肪 酸 、総 SFA、総 MUFA そ し て 総 PUFA の 濃 度 は 、検 者 間 で 有 意 な 差 を 認 め な か っ た 。そ し て 、 総 n-3、 総 n-6 そ し て 総 n-9 脂 肪 酸 の 濃 度 も 検 者 間 に も 有 意 な 差 は 生 じ な か っ た 。 種 類 別 に 比 較 し た 各 脂 肪 酸 の 濃 度 は 、 い ず れ の 種 類 に お い て も 検 者 間 で 有 意 な 差 を 認 め な か っ た 。
3 考 察
今 回 用 い た 脂 肪 酸 メ チ ル 化 キ ッ ト に よ る 脂 肪 酸 の メ チ ル 化 法 の 原 理 は 三 フ ッ 化 ホ ウ 素 法 で あ る 。原 法 で は 、100℃ の 高 温 処 理 に よ り 、PUFA な ど の 不 安 定 な 脂 肪 酸 で は 加 熱 分 解 を 生 じ る 可 能 性 が あ る が 、 本 測 定 系 の 最 高 温 度 は 37℃ で あ り 、原 法 よ り も 低 温 の 環 境 で 処 理 を 行 え た こ と か ら 、 試 料 中 に 含 ま れ る 脂 肪 酸 の 加 熱 分 解 は 生 じ に く か っ た と 考 え ら れ る 。 ま た 、 脂 肪 酸 を メ チ ル 化 す る た め の ジ ア ゾ メ タ ン 法 に 比 べ 、 用 い る 試 薬 の 爆 発 性 や 毒 性 は 低 い こ と に 加 え て 、4 時 間 以 内 に 脂 肪 酸 の メ チ ル 化 が 可 能 で あ っ た 。 さ ら に 、 こ の 脂 肪 酸 メ チ ル 化 キ ッ ト は 、 血 清 中 の ア シ ル グ リ セ ロ ー ル 、 リ ン 脂 質 そ し て コ レ ス テ ロ ー ル エ ス テ ル に 含 ま れ る 脂 肪 酸 の メ チ ル 化 が 可 能 な た め 、Folch 法 の よ う な 試 料 か ら の 脂 肪 酸 の 抽 出 処 理 が 不 要 で あ る 。 ま た 、 今 回 は メ チ ル 化 し た 脂 肪 酸 の 精 製 を 脂 肪 酸 メ チ ル 化 キ ッ ト で の 作 業 に 引 き 続 き メ チ ル 化 脂 肪 酸 精 製 キ ッ ト に よ り 行 っ た 。 メ チ ル 化 し た 脂 肪 酸 を 精 製 せ ず に GC 装 置 の カ ラ ム に 通 す と 、 疎 水 性 溶 媒 や 不 純 物 の 影 響 で カ ラ ム の 劣 化 や ク ロ マ ト グ ラ フ 分 析 に お け る テ ー リ ン グ が 生 じ る た め 、 メ チ ル 化 し た 脂 肪 酸 の 精 製 は 必 須 で あ る 。 今 回 の 精 製 工 程 に は 付 属 の カ ー ト リ ッ ジ を 用 い て 精 製 し た が 、 キ ッ ト に 付 属 す る も の 以 外 で 準 備 を 必 要 と し た 用 具 は 、 試 験 管 の み で あ り 、 さ ら に そ の 操 作 は 1 時 間 以 内 で 完 了 し た た め 容 易 に 精 製 が 可 能 で あ っ た 。 そ し て 、 こ の 処 理 に よ り ク ロ マ ト グ ラ フ 分 析 に お け る テ ー リ ン グ は 認 め ら れ な か っ た 。 し た が っ て 、 こ れ ら の キ ッ ト を セ ッ ト で 用 い た GC 法 に よ る 犬 の 血 清 中 脂 肪 酸 の 測 定 は 、 従 来 法 に 比 べ 安 全 か つ 短 時 間 で 完 了 で き る 方 法 で あ る こ と が 確 認 で き た 。
本 来 、 脂 肪 酸 メ チ ル 化 キ ッ ト は 植 物 に 利 用 す る た め に 開 発 さ れ た た
め 、 犬 の 血 清 中 脂 肪 酸 の 測 定 に 関 す る 情 報 は 少 な い 。 そ の た め 、 試 料 と し て 用 い る 血 清 量 を 決 定 す る た め の 検 討 を 行 っ た 結 果 、 本 測 定 方 法 で は 、25μL と50 μLの 血 清 量 で は 9種 類 の 脂 肪 酸 が 測 定 可 能 で あ り 、 100 μL 以 上 の 血 清 量 で は 13 種 類 の 脂 肪 酸 が 測 定 可 能 で あ る こ と が 明 ら か と な っ た 。 ま た 、 異 な る 血 清 量 か ら 得 ら れ た 脂 肪 酸 濃 度 の 近 似 直 線 の 相 関 係 数 は 、MA の 0.9901 が 最 低 値 で あ っ た が 、そ の 他 の 脂 肪 酸 の 測 定 値 か ら 得 ら れ た 近 似 直 線 の 相 関 係 数 は 、 い ず れ も 0.999 以 上 の 値 で あ っ た こ と か ら 、 本 測 定 法 は 血 清 量 の 違 い に よ る 血 清 中 脂 肪 酸 濃 度 の 差 を 高 い 精 度 で 反 映 す る と 考 え ら れ た 。 さ ら に 、 今 回 の 測 定 方 法 で 測 定 可 能 で あ っ た 13 種 類 の 脂 肪 酸 の 測 定 値 を 従 来 法 と 比 較 し た 結 果 、 す べ て の 種 類 が 高 い 相 関 を 認 め た 。 ま た 、GC 法 に よ る ヒ ト 血 清 中 の 脂 肪 酸 濃 度 の 測 定 値 の 精 度 は 、 一 般 に 同 時 再 現 性 お よ び 日 差 再 現 性 で 評 価 さ れ 、 そ れ ら の CV が そ れ ぞ れ 11.3%未 満 と 23.1%未 満 で あ る 場 合 に は 再 現 精 度 は 良 好 と 判 断 さ れ て い る 27。 本 研 究 で は 、 同 時 再 現 性 お よ び 日 差 再 現 性 に 加 え て 検 者 間 誤 差 も 確 認 し た が 、CV の 値 は 過 去 の 報 告 に 比 べ 明 ら か に 低 値 で あ り 、 検 者 間 に は 有 意 な 差 を 認 め な か っ た 。し か し 、検 者 間 の 比 較 に お い て 、ALAの ピ ー ク 面 積 が 小 さ い た め に 、測 定 値 の 誤 差 は 大 き か っ た 。そ の た め 、200 μL よ り 少 な い 血 清 量 を 用 い る こ と は 、 そ れ に と も な い ピ ー ク 面 積 が さ ら に 小 さ く な る こ と か ら 、 測 定 に 適 さ な い と 考 え ら れ る 。 ま た 、 測 定 可 能 な 脂 肪 酸 の 種 類 そ し て 定 量 の 感 度 は 血 清 量 を 200 μL 用 い た 結 果 が 最 良 で あ っ た こ と か ら 、血 清 中 脂 肪 酸 の 測 定 に 供 す る 血 清 の 量 と し て は 、200 μL が 最 も 適 し て い る と 判 断 し た 。 さ ら に 、 そ の 血 清 量 を 用 い る た め の BHT 濾 紙 の サ イ ズ は 従 来 の 1.5×1.5cmで は な く 1.5×5.0cmが 最 適 で あ る こ と を 確 認 し た 。
こ れ ら の こ と か ら 、 今 回 の 測 定 方 法 は 、 従 来 法 と 比 較 し て 安 全 か つ 簡 便 に 犬 の 血 清 中 脂 肪 酸 の メ チ ル 化 と メ チ ル 化 脂 肪 酸 の 精 製 が 可 能 で あ り 、 脂 肪 酸 の 検 出 と 測 定 の 精 度 は 高 い 方 法 で あ る こ と が 示 さ れ た 。
4 小 括
脂 肪 酸 の メ チ ル 化 と メ チ ル 化 脂 肪 酸 の 精 製 の た め の キ ッ ト を 用 い た GC 法 の 実 用 性 を 確 認 す る た め に 、 今 回 の 測 定 法 と 従 来 法 に よ る 測 定 値 の 比 較 、 同 時 再 現 性 と 日 差 再 現 性 に よ る 検 者 内 誤 差 、 お よ び 検 者 間 誤 差 を 検 討 し た 。そ の 結 果 、飽 和 脂 肪 酸(SFA)2 種 類 、一 価 不 飽 和 脂 肪 酸(MUFA)2 種 類 そ し て 多 価 不 飽 和 脂 肪 酸(PUFA)9種 類 の 合 計 13 種 類 の 脂 肪 酸 が 定 量 可 能 で あ っ た 。 そ し て 、 従 来 法 と の 比 較 で は 、 全 て の 脂 肪 酸 の 種 類 で 高 い 相 関(相 関 係 数: 0.875～1.000)を 認 め た 。同 時 再 現 性 に お け る CV の 範 囲 は 、2.0%～7.4%で あ っ た 。さ ら に 、日 差 再 現 性 に お け る CV は 、0.4%～2.8%の 範 囲 で あ っ た 。ま た 、全 て の 脂 肪 酸 の 種 類 の 測 定 値 は 、 検 者 の 違 い に よ る 有 意 差 を 認 め な か っ た 。 し た が っ て 、 今 回 の 測 定 方 法 は 、 従 来 法 と 比 較 し て 安 全 か つ 簡 便 に 行 う こ と が 可 能 で あ り 、 そ の 精 度 は 高 い こ と が 示 さ れ た 。
Soak the filter paper in acetone containing 0.05 % 2,6-di-t-butyl-p-cresol (BHT) for several minutes and then repeat this process
⇓
The paper with side 1.5×5.0 cm is suitable for methylation application Apply 200 μL of serum and pentadecanoic acid solution to ⇓
BHT-treated filter paper and dry it in a vacuume desiccator for 1 hour
⇓
The filter paper is cut finely
⇓
Put dried sample into a stoppered test tube
⇓
Add 0.5 mL of methylation reagent of A and B to a test tube
⇓
Close the cap tightly and incubate the test tube for 20 min at 37゜C
⇓
Add 0.5 mL of methylation reagent C
⇓
Close the cap tightly and incubate the test tube for 20 min at 37゜C
⇓
Add 1.0 mL of isolation reagent and vortex
After seeing the presence of two layers, transfer supernatant to ⇓ a new lest lube with a pipette, avoid picking up the milky layer
Add 1.0 mL of deionized water to the test tube containing ⇓ the supernatant and mix it up for cleaning
⇓
Transfer the supernatant to a new test tube
⇓
Further purification with fatty acid methyl ester purification kit is required Fig. 1 Procedure of fatty acid methylation by using the kit*.
Methylation of fatty acids, was applied the described method of fatty acid methylation kit. These procedures were performed for the extraction and methylation in serum fatty acids.
* Fatty acid methylation kit: Nacalai Tesque.
Add 3.0mL of conditioning solution to a SPE cartridge column
⇓
Dropping Nature
Add sample methylated with fatty acid methylation kit ⇓ to the SPE cartridge
⇓
Dropping Nature
⇓
Add 3.0mL of washing solution to the SPE cartridge column
⇓
Transfer the cartridge to another test tube when fully dropped Add 3.0ml of eluting solution to the SPE cartridge column and collect ⇓
eluted liquid containing fatty acid methyl esters
⇓
The resulting material is dried using N2 gas Add 800μL hexane and ⇓
200 μL heptanoic acid methyl ester solution (150 μg/mL)
⇓
Mix by vortex mixer
⇓
The obtained sample it was for analysis
Fig. 2 Procedure of methylated fatty acid purification by using the kit*.
Purification of methylated fatty acids is according to the described method of methylation fatty acid purification kit. These procedures were performed for the purification of methylated fatty acids.
* Purification of methylated fatty acid kit: Nacalai Tesque.
Fig. 3 The chromatogram was obtained from internal standard fatty acid concentration of 500 μg/mL.
The peak of the fatty acids was observed between 11.7 to 40.67 min.
R = 0.9999722 0
100,000 200,000 300,000
0 200 400 600
peak area
Pentadecanoic acid ( μg/mL ) Fig. 4 The calibration curve of pentadecanoic acid.
R = 0.9999722 0
200,000 400,000 600,000 800,000 1,000,000
0 400 800 1,200 1,600
peak area
Palmitic acid ( μg/mL ) Fig. 5 The calibration curve of palmitic acid.
R = 0.9999653 0
200,000 400,000 600,000 800,000
0 500 1,000 1,500
peak area
Stearic acid ( μg/mL ) Fig. 6 The calibration curve of stearic acid.
R = 0.9999622 0
100,000 200,000 300,000
0 200 400 600
peak area
Palmitoleic acid ( μg/mL ) Fig. 7 The calibration curve of palmitoleic acid.
R = 0.9999705 0
200,000 400,000 600,000 800,000
0 500 1,000 1,500
peak area
Oleic acid ( μg/mL ) Fig. 8 The calibration curve of oleic acid.
R = 0.9998194 0
100,000 200,000 300,000 400,000
0 200 400 600
peak area
Alpha-linolenic acid ( μg/mL ) Fig. 9 The calibration curve of alpha-linolenic acid.
R = 0.9999088 0
50,000 100,000 150,000 200,000 250,000
0 100 200 300 400 500 600
peak area
Eicosapentaenoic acid ( μg/mL ) Fig. 10 The calibration curve of eicosapentaenoic acid.
R = 0.9999664 0
200,000 400,000 600,000 800,000
0 500 1,000 1,500
peak area
Docosapentaenoic acid ( μg/mL ) Fig. 11 The calibration curve of docosapentaenoic acid.
R = 0.9999036 0
50,000 100,000 150,000 200,000 250,000
0 200 400 600
peak area
Docosahexaenoic acid ( μg/mL ) Fig. 12 The calibration curve of docosahexaenoic acid.
R = 0.9999388 0
100,000 200,000 300,000
0 200 400 600
peak area
Linoleic acid ( μg/mL ) Fig. 13 The calibration curve of linoleic acid.
R = 0.9998194 0
100,000 200,000 300,000
0 200 400 600
peak area
Dihomo-gamma-linolenic acid ( μg/mL )
Fig. 14 The calibration curve of dihomo-gamma-linolenic acid.
R = 0.9998194 0
100,000 200,000 300,000
0 200 400 600
peak area
Arachidonic acid ( μg/mL ) Fig. 15 The calibration curve of arachidonic acid.
R = 0.9999831 0
50,000 100,000 150,000 200,000 250,000
0 500 1,000 1,500
peak area
Docosatetraenoic acid ( μg/mL ) Fig. 16 The calibration curve of docosatetraenoic acid.
R = 0.9999988 0
20,000 40,000 60,000 80,000
0 50 100 150
peak area
5,8,11-Eicosatrienoic acid ( μg/mL )
Fig. 17 The calibration curve of 5, 8, 11-eicosatrienoic acid.
Fig. 18 The chromatogram was obtained from serum fatty acids.
The peak of the fatty acids was observed between 11.7 to 40.67 min.
Fig. 19 Chromatograph of the α-linolenic acid using serum quantity of 200 μL.
The arrow shows the peak. There is shown a peak in five measurements.
Fig. 20 Chromatograph of the α-linolenic acid using serum quantity of 100 μL.
The arrow shows the peak. There is shown a peak in five measurements.
：1 ：2 ：3 ：4 ：5
：1 ：2 ：3 ：4 ：5
-1000 0 1000 2000 3000 4000
50 100 150 200
Total FA Total SFA Total MUFA Total PUFA
Fatty acid concentration (μg/mL)
Serum (mL)
Fig. 21 Sum of serum fatty acid concentrations according to the classification in saturation.
Linearity of total FA (y = 18.305x - 51.138, R² = 0.9998), total SFA (y = 10.079x - 15.33, R² = 0.9999),
total MUFA (y = 5.9573x - 17.358,R² = 0.9996) and total PUFA (y = 2.2693x - 18.45, R² = 0.9998).
FA: fatty acid, SFA: saturated fatty acid, MUFA: monounsaturated fatty acid, PUFA: polyunsaturated fatty acid.
-200 0 200 400 600 800
50 100 150 200
Palmitic acid Stearic acid
Fatty acid concentration (μg/mL)
Serum (mL)
Fig. 22 Fatty acid concentrations in saturated fatty acid by the difference of quantity of serum.
Linearity of palmitic acid (y = 2.1459x - 12.417, R² = 0.9998) and stearic acid (y = 3.8114x - 4.9408, R² = 0.9994).
-100 0 100 200 300 400 500
50 100 150 200
Palmitoleic acid Oleic acid
Fatty acid concentration (μg/mL)
Serum (mL)
Fig. 23 Fatty acid concentrations in monounsaturated fatty acid by the difference of quantity of serum.
Linearity of and oleic acid (y = 2.1398x - 13.238, R² = 0.9996).
Palmitoleic acid could not be quantified in the serum amount of 25 μL and 50 μL.
-500 0 500 1000 1500 2000
50 100 150 200
Total n-3 fatty acid Total n-6 fatty acid Total n-9 fatty acid
Fatty acid concentration (μg/mL)
Serum (mL)
Fig. 24 Fatty acid concentrations in fatty acid of n-3, n-6 and n-9 by the difference of quantity of serum.
Linearity of total n-3 fatty acid (y = 8.3384x - 25.99, R² = 0.9999), total n-6 fatty acid (y = 1.7125x + 10.114, R² = 0.9999) and
total n-9 fatty acid (y = 2.1675x - 12.692, R² = 0.9996).
-100 0 100 200 300
50 100 150 200
α-linolenate acid Eicosapentaenoic acid Docosapentaenoic acid Docosahexaenoic acid
Fatty acid concentration (μg/mL)
Serum (mL)
Fig. 25 Fatty acid concentrations in n-3 fatty acid by the difference of quantity of serum.
Linearity of docosapentaenoic acid (y = 0.3016x + 17.033, R² = 0.9988) and docosahexaenoic acid (y = 1.1213x - 14.705, R² = 0.9998).
Alpha-linolenate acid and eicosapentaenoic acid could not be quantified in the serum amount of 25 μL and 50 μL.
-250 0 250 500 750 1000
0 50 100 150 200
Linoleic acid DGLA
Arachidonic acid Docosatetraenoic acid
Fatty acid concentration (μg/mL)
Serum (mL)
Fig. 26 Fatty acid concentrations in n-6 fatty acid by the difference of quantity of serum.
Linearity of linoleic acid (y = 3.9164x - 12.792, R² = 0.9999), arachidonic acid (y = 4.1189x - 19.23, R² = 0.9999) and docosatetraenoic acid (y = 0.1481x + 12.279, R² = 0.9992). DGLA could not be quantified in the serum amount of 25 μL and 50 μL.
DGLA: Dihomo-gamma-linolenic acid.
-100 0 100 200 300 400 500
50 100 150 200
Oleic acid MA
Fatty acid concentration (μg/mL)
Serum (mL)
Fig. 27 Fatty acid concentrations in n-9 fatty acid concentration by the difference of quantity of serum..
Linearity of oleic acid (y = 2.1398x - 13.238, R² = 0.9996) and MA (y = 0.0277x + 0.5458, R² = 0.9901).
MA: 5, 8, 11-eicosatorienoic acid.
Kind of fatty acid C:D
1 Lauric acid 12:0
2 Myristic acid 14:0
3 Myristoleic acid 14:1
4 Palmitic acid 16:0
5 Palmitoleic acid 16:1
6 Stearic acid 18:0
7 Oleic acid 18:1
8 Linoleic acid 18:2
9 γ-linolenic acid 18:3 10 α-linolenic acid 18:3
11 Arachidic acid 20:0
12 Eicosenoic acid 20:1
13 Eicosadienoic acid 20:2
14 cis-5,8,11-Eicosatrienoic acid 20:3 15 Dihomo-gamma-linolenic acid 20:3
16 Arachidonic acid 20:4
17 Eicosapentaenoic acid 20:5
18 Behenic acid 22:0
19 Erucic acid 22:1
20 Docosatetraenoic acid 22:4
21 Docosapentaenoic acid 22:5
22 Lignoceric acid 24:0
23 Docosahexaenoic acid 22:6
24 Nervonic acid 24:1
Table 1 Kind of fatty acids measured in human
C: the number of carbon atoms in the fatty acid, D: the number of double bonds in the fatty acid
Kind of fatty acid methyl ester C:D Diluted concentrations of fatty acid standard
1 2.5 5 50 500 5000 Butyric acid 4:0 1000 400 200 20 2 0.2 Caproic acid 6:0 1000 400 200 20 2 0.2 Caprylic acid 8:0 1000 400 200 20 2 0.2 Capric acid 10:0 1000 400 200 20 2 0.2 Undecanoic acid 11:0 500 200 100 10 1 0.1
Lauric acid 12:0 1000 400 200 20 2 0.2
Tridecanoic acid 13:0 500 200 100 10 1 0.1 Myristic acid 14:0 1000 400 200 20 2 0.2 Myristoleic acid 14:1 500 200 100 10 1 0.1 Pentadecanoic acid 15:0 500 200 100 10 1 0.1 cis-10 Pentadecenoic acid 15:1 500 200 100 10 1 0.1 Palmitic acid 16:0 1500 600 300 30 3 0.3 Palmitoleic acid 16:1 500 200 100 10 1 0.1 Heptadecanoic acid 17:0 500 200 100 10 1 0.1 cis-10 Heptadecenoic acid 17:1 500 200 100 10 1 0.1 Stearic acid 18:0 1000 400 200 20 2 0.2 Elaidic acid 18:1 500 200 100 10 1 0.1 Oleic acid 18:1 1000 400 200 20 2 0.2 Linolelaidic acid 18:2 500 200 100 10 1 0.1 Linoleic acid 18:2 500 200 100 10 1 0.1 Arachidic acid 20:0 1000 400 200 20 2 0.2 γ-linolenic acid 18:3 500 200 100 10 1 0.1 Eicosenoic acid 20:1 500 200 100 10 1 0.1 α-linolenic acid 18:3 500 200 100 10 1 0.1 Heneicosanoic acid 21:0 500 200 100 10 1 0.1 cis-11,14-Eicosadienoic acid 20:2 500 200 100 10 1 0.1 Behenic acid 22:0 1000 400 200 20 2 0.2 Dihomo-gamma-linolenic acid 20:3 500 200 100 10 1 0.1 Erucic acid 22:1 500 200 100 10 1 0.1 cis-11,14,17-Eicosatrienoic acid 20:3 500 200 100 10 1 0.1 Tricosanoic acid 23:0 500 200 100 10 1 0.1 Arachidonic acid 20:4 500 200 100 10 1 0.1 cis-13,16-Docosadienoic acid 22:2 500 200 100 10 1 0.1 Lignoceric acid 24:0 1000 400 200 20 2 0.2 Eicosapentaenoic acid 20:5 500 200 100 10 1 0.1 Nervonic acid 24:1 500 200 100 10 1 0.1 Docosahexaenoic acid 22:6 500 200 100 10 1 0.1
C: the number of carbon atoms in the fatty acid, D: the number of double bonds in the fatty acid, FAME: fatty acid methyl ester,
Fatty acid concentrations are expressed as μg/mL
Table 2 Dilute concentration of each fatty acid for making calibration curve by 37 fatty acid methyl mixture
