僧 帽 弁 閉 鎖 不 全 症 犬 の

僧 帽 弁 閉 鎖 不 全 症 犬 の

血 清 中 脂 肪 酸 組 成 に 関 す る 基 礎 的 研 究

(Basic study on serum fatty acid compositions in dogs with mitral insufficiency)

学 位 論 文 の 要 約

獣 医 生 命 科 学 研 究 科 獣 医 学 専 攻 博 士 課 程 平 成 24 年 入 学

吉 松 宏 基

(指 導 教 授 小 山 秀 一)

粘 液 腫 様 変 性 に よ る 僧 帽 弁 閉 鎖 不 全 症（MI）は 、犬 に お け る 最 も 一 般 的 な 慢 性 心 疾 患 で あ る 。 近 年 、 慢 性 心 疾 患 で あ る MI に 対 し て 、 一 般 的 な 心 疾 患 治 療 薬 以 外 に さ ま ざ ま な サ プ リ メ ン ト が 使 用 さ れ る よ う に な っ て き て い る 。 そ し て 、 そ れ ら の 中 に は 脂 肪 酸 を 主 成 分 と す る 製 品 が あ り MI 症 例 に も 使 用 さ れ て い る が 、 病 態 と 血 中 脂 肪 酸 組 成 に 関 す る 検 討 は わ ず か で あ る 。 脂 肪 酸 は 、 正 常 な 心 筋 の 主 要 な エ ネ ル ギ ー 源 で あ り 、 そ れ は 心 筋 に お け る ATP 産 生 の 60～90％ を 占 め る 。 し か し 、 心 筋 が 負 荷 に さ ら さ れ る と 、 エ ネ ル ギ ー は 脂 肪 酸 利 用 か ら ブ ド ウ 糖 利 用 へ と 傾 く こ と が 知 ら れ て い る 。 心 不 全 に お け る 脂 肪 酸 代 謝 の 変 化 は 、 心 筋 中 へ の 脂 肪 蓄 積 を 引 き 起 こ し 、 心 筋 細 胞 膜 の 構 築 の 変 化 と 心 筋 細 胞 内 の Ca イ オ ン 調 節 の 破 綻 を 引 き 起 こ す た め 、 心 不 全 を さ ら に 悪 化 さ せ る と い わ れ て い る 。

犬 の 血 清 中 脂 肪 酸 の 測 定 に は 、 ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ(GC)法 や 高 速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ 法 が 用 い ら れ て い る 。GC 法 は 、 分 離 能 が 高 く 少 量 の 試 料 で 測 定 で き る が 、 血 清 中 か ら の 脂 肪 酸 の 抽 出 と メ チ ル 化 が 必 要 で あ り 、 そ の 処 理 に は 特 殊 な 器 具 や 高 温 加 熱 な ど の 過 程 で そ の 扱 い に 注 意 が 必 要 で あ る た め 一 般 的 な 検 査 項 目 と な っ て い な い 。 こ の た め 、 犬 の 血 清 中 脂 肪 酸 組 成 に 関 し て は 、 不 明 な 点 が 多 く 、 そ の 病 態 と の 関 連 は 明 ら か で な い 。

そ こ で 本 研 究 で は 、1）脂 肪 酸 メ チ ル 化 キ ッ ト と メ チ ル 化 脂 肪 酸 精 製 キ ッ ト を 利 用 し た 犬 の 血 清 中 脂 肪 酸 の 測 定 方 法 に つ い て 検 討 し た 。2） 脂 肪 酸 測 定 用 の 血 清 を 得 る 目 的 で 適 切 な 採 血 時 点 を 決 定 す る た め に 、 健 常 犬 に お け る 血 清 中 脂 肪 酸 の 日 内 変 動 に つ い て 検 討 し た 。3）健 常 犬 の 血 清 中 脂 肪 酸 組 成 の 基 準 値 に つ い て 検 討 し た 。 そ し て 、4）MI 犬 を 病 期 で 分 類 し 血 清 中 脂 肪 酸 組 成 を 比 較 し 、 さ ら に 脂 肪 酸 と 心 エ コ ー パ

ラ メ ー タ ー と の 関 連 を 確 認 し た 。

1． 犬 の 血 清 中 脂 肪 酸 の 測 定 方 法 の 検 討 （ 第 2 章 ）

脂 肪 酸 の メ チ ル 化 と メ チ ル 化 脂 肪 酸 の 精 製 の た め の キ ッ ト を 用 い た GC 法 の 実 用 性 を 確 認 す る た め に 、 今 回 の 測 定 法 と 従 来 法 に よ る 測 定 値 の 比 較 、 同 時 再 現 性 と 日 差 再 現 性 に よ る 検 者 内 誤 差 、 お よ び 検 者 間 誤 差 を 検 討 し た 。そ の 結 果 、飽 和 脂 肪 酸(SFA)2 種 類 、一 価 不 飽 和 脂 肪 酸(MUFA)2 種 類 そ し て 多 価 不 飽 和 脂 肪 酸(PUFA)9種 類 の 合 計 13 種 類 の 脂 肪 酸 定 量 が 可 能 で あ っ た 。 そ し て 、 従 来 法 と の 比 較 で は 全 て の 脂 肪 酸 の 種 類 で 高 い 相 関(相 関 係 数: 0.875～1.000)を 認 め た 。同 時 再 現 性 に お け る 変 動 係 数 （CV） の 範 囲 は 、2.0～7.4%で あ っ た 。 さ ら に 、 日 差 再 現 性 に お け る CV は 、0.4～2.8%の 範 囲 で あ っ た 。ま た 、全 て の 脂 肪 酸 の 種 類 に お い て 、 検 者 間 の 測 定 値 に 有 意 な 差 は 認 め な か っ た 。 し た が っ て 、 今 回 の 測 定 方 法 は 、 従 来 法 と 比 較 し て 安 全 か つ 簡 便 に 行 う こ と が 可 能 で 、 そ の 精 度 が 高 い こ と が 示 さ れ た 。

2． 犬 の 血 清 中 脂 肪 酸 濃 度 を 測 定 す る た め の 採 血 時 点 の 検 討 （ 第 3 章 ）

血 清 中 脂 肪 酸 を 測 定 す る た め の 最 適 な 採 血 時 点 を 決 定 す る た め に 、 健 常 犬 を 用 い て 血 清 中 脂 肪 酸 の 日 内 変 動 を 調 べ た 。 供 試 犬 は 、 米 国 飼 料 検 査 官 協 会 の 基 準 を 満 た し た 、 同 一 の フ ー ド を 2 ヵ 月 以 上 継 続 し て 給 与 中 の 健 常 雄 ビ ー グ ル 6 頭 を 用 い た 。 給 餌 は 毎 日 7 時 と 19 時 の 2 回 行 い 、 採 血 は 午 前 7 時 の 給 餌 前 を Pre と し 、 そ の 後 3 時 間 毎 に 24 時 間 行 っ た 。 そ の 結 果 、Pre か ら 3 時 間 後 の 総 MUFA、 総 n-9 脂 肪 酸 そ し て オ レ イ ン 酸 の 濃 度 は 、Pre よ り も 有 意(P < 0.05)に 上 昇 し た が 、

そ れ 以 後 は Pre と の 間 に 有 意 差 を 認 め な か っ た 。n-3 脂 肪 酸 に お い て は 、3 時 間 後 の α-リ ノ レ ン 酸 濃 度 が 、Pre よ り も 有 意(P < 0.05)に 増 加 し た が 、6 時 間 後 か ら は 有 意 差 を 認 め な か っ た 。 重 量 比 の う ち 、 エ イ コ サ ペ ン タ エ ン 酸(EPA)は Pre と 比 べ て 3 時 間 後 と 6 時 間 後 、 そ し て ド コ サ ペ ン タ エ ン 酸 は 3 時 間 後 が 有 意(P < 0.05)に 減 少 し た 。 し か し 、 両 者 と も に 9 時 間 後 か ら は 有 意 な 変 化 を 認 め な か っ た 。 こ れ ら の こ と か ら 、1 日 に 2 食 を 給 餌 し て い る 犬 の 採 血 時 点 は 、 午 前 の 給 餌 前 あ る い は そ の 9 時 間 以 後 が 適 当 で あ る と 判 断 し た 。

3． 健 常 犬 に お け る 血 清 中 脂 肪 酸 組 成 の 基 準 値 の 検 討 （ 第 4 章 ） 臨 床 的 に 健 常 な 105 頭 の 犬 を 用 い て 、 血 清 中 脂 肪 酸 の 濃 度 、 重 量 比 そ し て 脂 肪 酸 比 率 の 基 準 値 を 検 討 し た 。 供 試 犬 は 、 幼 年 齢 群 、 中 年 齢 群 そ し て 高 年 齢 群 に 分 類 し 、 さ ら に そ れ ら の 群 内 を 雄 群 、 去 勢 群 、 雌 群 そ し て 避 妊 群 に 細 分 し た 。 そ の 結 果 、 脂 肪 酸 の 変 動 因 子 で あ る 技 術 的 因 子 、 個 体 内 因 子 そ し て 個 体 間 因 子 の う ち 、 測 定 精 度 、 検 者 内 お よ び 検 者 間 の 誤 差 、 採 血 時 点 、 性 周 期 、 食 習 慣 な ど の 因 子 を 除 外 す る こ と に よ り 、 年 齢 と 性 に 関 わ ら ず 脂 肪 酸 の 濃 度 、 重 量 比 そ し て 脂 肪 酸 比 率 に 有 意 差 を 認 め な か っ た 。 こ の こ と か ら 、 脂 肪 酸 濃 度 の 基 準 値 は 、 年 齢 や 性 に 関 わ ら ず 設 定 可 能 で あ る と 考 え ら れ た 。 し か し 、 今 回 の 結 果 は 、 多 く の 変 動 因 子 に 制 限 を 設 け た 結 果 で あ る た め 、 各 個 体 の 血 清 中 脂 肪 酸 を 基 準 値 と 比 較 す る 場 合 に は 、 種 々 の 変 動 因 子 の 影 響 を 確 認 す る 必 要 が あ る と 考 え ら れ た 。 今 回 は 供 試 犬 の 頭 数 が 少 な く 、 食 べ 物 や 品 種 の 違 い に つ い て は さ ら に デ ー タ を 蓄 積 し 検 討 す る 必 要 が あ る と 考 え ら れ た 。そ の た め 、今 回 得 ら れ た 95％ 区 間 は 、本 研 究 で は 参 照 値 と し て 用 い る こ と に し た 。

4．MI 犬 の 血 清 中 脂 肪 酸 組 成 の 検 討 （ 第 5 章 ）

MI 犬 に お け る 血 清 脂 肪 酸 組 成 の 変 化 に つ い て 検 討 す る 目 的 で 、MI 犬 30 頭 を International Small Animal Cardiac Health Council の 心 機 能 分 類 に し た が っ て ス テ ー ジ I、II そ し て III の 3 つ の 群 に 分 類 し 、 そ れ ら の 血 清 中 脂 肪 酸 の 濃 度 、 重 量 比 お よ び 脂 肪 酸 比 率 を 健 常 群 と 比 較 し た 。 そ し て 、 本 研 究 で は 血 清 中 脂 肪 酸 と 心 エ コ ー パ ラ メ ー タ ー と の 相 関 関 係 に つ い て も 調 べ た 。 さ ら に 、MI 犬 と 健 常 犬 の 間 で EPA お よ び EPA と ア ラ キ ド ン 酸 の 比(EPA/AA)の ROC解 析 を 行 い 、そ れ ら の カ ッ ト オ フ 値 を 求 め た 。 そ の 結 果 、 す べ て の MI 犬 の 脂 肪 酸 濃 度 は 参 照 値 の 範 囲 内 で あ っ た が 、I 群 と II 群 の ア ラ キ ド ン 酸(AA)濃 度 は 、 健 常 群 に 比 べ 有 意(そ れ ぞ れ P < 0.01, P < 0.05)に 低 値 で あ っ た 。II 群 と III 群 の EPA 濃 度 と 重 量 比 は 、健 常 群 に 比 べ 有 意 に 低 値 で あ っ た(そ れ ぞ れ P < 0.05, P < 0.01)。 ま た 、II 群 と III 群 の EPA/AA は 、 健 常 群 よ り も 有 意(そ れ ぞ れ P < 0.05, P < 0.01)に 低 値 で あ っ た 。 こ れ ら の こ と か ら 、AA の み が 低 下 し て い た I 群 で は 軽 度 の 容 量 負 荷 に お い て も 心 筋 で は AA 代 謝 の 活 性 化 が 起 こ っ て い る と 考 え ら れ 、II 群 に お け る EPA と AA の 低 下 は 、AA の 代 謝 活 性 化 に 追 随 し て EPA の 代 謝 が 活 性 化 し た と 推 察 し た 。 そ し て 、 こ れ ら の 変 化 は 慢 性 心 不 全 で 上 昇 す る 腫 瘍 壊 死 因 子-αや イ ン タ ー ロ イ キ ン-1な ど の サ イ ト カ イ ン が 関 与 し て い る と 考 え ら れ た 。さ ら に 、III 群 で は こ れ ら サ イ ト カ イ ン の 関 与 が 影 響 し 、EPA の さ ら な る 代 謝 の 活 性 化 に よ り AA の 活 性 が 抑 制 さ れ た こ と が 推 察 さ れ た 。

心 エ コ ー パ ラ メ ー タ ー と の 検 討 で は 、AA と ド コ サ テ ト ラ エ ン 酸 の 濃 度 は 左 室 拡 張 末 期 径 指 数 と の 間 に 有 意 な 正 の 相 関 を 認 め た 。 そ し て 、

DPA 濃 度 は 、 左 室 内 径 短 縮 率(FS)と の 間 に 有 意 な 負 の 相 関 を 認 め た 。 DPA の 重 量 比 は 、 左 房 径/大 動 脈 径 比(LA/Ao)お よ び FS と の 間 に 有 意 な 負 の 相 関 を 認 め た 。 さ ら に 、EPA/AA は 、LA/Ao と の 間 に 有 意 な 負 の 相 関 を 認 め た 。 以 上 の こ と か ら 、 血 清 中 脂 肪 酸 で は 、 左 室 の 拡 張 に 伴 い 炎 症 促 進 性 エ イ コ サ ノ イ ド の 基 質 で あ る n-6 系 脂 肪 酸 が 増 加 し 、 僧 帽 弁 逆 流 の 増 加 を 示 唆 す る FS や LA/Ao の 上 昇 に 伴 い 炎 症 抑 制 性 エ イ コ サ ノ イ ド の 基 質 で あ る n-3 系 脂 肪 酸 お よ び EPA/AA が 低 下 す る こ と が 明 ら か と な っ た 。 こ の こ と か ら 、 血 清 中 脂 肪 酸 は 心 不 全 の 病 態 の 進 行 に 伴 う 心 筋 エ ネ ル ギ ー 代 謝 の 変 化 を 反 映 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。

次 に 、MI 犬 に 対 す る 治 療 補 助 と し て 使 用 さ れ て い る 脂 肪 酸 サ プ リ メ ン ト の 投 与 時 期 を 判 断 す る た め に 求 め た EPA 濃 度 の カ ッ ト オ フ 値 は 47.5 μg/mL で あ り 、 感 度 と 特 異 度 は と も に 83.33%で あ っ た 。 一 方 、 EPA/AA の カ ッ ト オ フ 値 は 0.029 で あ り 、感 度 は 83.33%そ し て 特 異 度 は 66.67%で あ っ た 。 こ れ ら の 値 は MI を 中 心 と し た 慢 性 心 不 全 犬 で EPAを 含 有 す る 脂 肪 酸 サ プ リ メ ン ト の 投 与 時 期 を 決 定 す る 指 標 と し て 有 効 で あ る と 考 え ら れ た 。

MI 犬 の 病 態 メ カ ニ ズ ム 解 析 の た め 、MI の 病 態 に 関 連 が あ る と さ れ る 血 中 の 脂 肪 酸 組 成 を 測 定 す る た め に 、 脂 肪 酸 の メ チ ル 化 と メ チ ル 化 脂 肪 酸 の 精 製 の た め の キ ッ ト を 用 い た GC 法 の 測 定 方 法 を 検 討 し た 結 果 、 従 来 法 に 比 べ 安 全 か つ 短 時 間 で 従 来 法 と 同 等 の 精 度 で 測 定 値 を 得 る こ と が で き た 。 そ し て 、 血 清 中 脂 肪 酸 を 測 定 す る た め の 採 血 の タ イ ミ ン グ は 、 午 前 の 給 餌 前 あ る い は そ の 9 時 間 以 後 が 適 当 で あ っ た 。 ま た 、 健 常 犬 に お け る 血 清 中 脂 肪 酸 の 基 準 値 に つ い て 検 討 し た 結 果 、 年 齢 や 性 に よ る 分 類 で は 、 そ れ ら の 測 定 値 に 有 意 差 を 認 め な い こ と が 示

さ れ た が 、 品 種 や 頭 数 な ど を 増 や し て さ ら に 検 討 す る 必 要 が あ る と 考 え ら れ た 。さ ら に 、MI 犬 の 血 清 中 脂 肪 酸 組 成 は 、健 常 犬 と は 有 意 に 異 な り 、 そ の 種 類 は 心 機 能 の グ レ ー ド に よ り 異 な っ た 。 そ し て 、 心 エ コ ー パ ラ メ ー タ ー と の 間 に 相 関 を 認 め る 脂 肪 酸 や 比 率 が 認 め ら れ た 。 こ れ ら の こ と か ら 、MI 犬 の 血 清 中 脂 肪 酸 の 変 化 は 、心 筋 の 形 態 異 常 を 反 映 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。そ し て 、EPA 濃 度 と EPA/AA の カ ッ ト オ フ 値 は 、EPA を 給 与 す る タ イ ミ ン グ の 指 標 と な る 可 能 性 が 示 さ れ た 。今 後 さ ら に 、こ れ ら の 指 標 を も と に し た EPA の 投 与 に よ る 臨 床 的 効 果 と 血 清 中 脂 肪 酸 組 成 の 関 連 を 明 ら か に す る 必 要 が あ る と 考 え ら れ る 。