受容体標的化腫瘍溶解性ヘルペスウイルスに応用可能な抗体の探索法の開発

論文題目

受容体標的化腫瘍溶解性ヘルペスウイル

スに応用可能な抗体の探索法の開発

氏

名

池田

瞳

目次

頁 目次 2 第１章 序論 4 １–１ 腫瘍溶解性ウイルス療法 １–２ 腫 瘍 溶 解 性 単 純 ヘ ル ペ ス ウ イ ル ス （oncolytic herpes simplex virus; oHSV）療法

１–３ 単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus; HSV） 5

１–４ HSV の細胞内侵入機序 6

１–５ 受容体標的化oHSV（receptor-retargeted oHSV; RR-oHSV）

頁

２–５ KGNEreg の作製 18

２–５–１ BAC システムを利用して KGNEreg を作製した

２–５–２ KGNEreg は U87 細胞に侵入した 19 ２−５−３ KGNEreg の U87 細胞への侵入は U#1 抗体により阻害さ

れた

２−５−４ KGNEreg は epiregulin を強制発現させた細胞に侵入した 20

第３章 考察 21

３−１ EREG について

３–２ U#1 抗体を用いた免疫沈降の結果、17 kDa および 27 kDa にバンドが検出された ３–３ KGNc2 は RR-oHSV に応用可能な抗体を探索するプロー ブとして有用であることが示唆された 22 第４章 実験材料 23 ４−１ 細胞 ４−２ プラスミド 24 ４−３ 抗体 27 ４−４ ウイルス 第５章 実験方法 28 ５−１ 動物培養細胞へのプラスミドの導入 ５−２ フローサイトメトリー解析 ５−３ KGNc2・KGNc2mut の作製 ５−４ ウイルス定量（qPCR） 29 ５−５ エントリーアッセイ（抗体非存在下） ５−６ エントリー阻害アッセイ ５−７ ハイブリドーマライブラリーの作製 30 ５−８ KGNc2 アッセイ（抗体スクリーニング） ５−９ 免疫沈降

５−１０ 動物培養細胞への small interference RNA（siRNA）の導 入

31

引用文献 32

第

1章

序論

1-1. 腫瘍溶解性ウイルス療法 がんに対するバイオ医薬の新たな候補として、がん細胞を選択的に破壊する腫瘍溶解性 ウイルス療法が注目されている。2005 年に世界初の腫瘍溶解性ウイルス治療薬としてアデ ノウイルスを基盤としたH101（Garber et al., 2006）が中国で認可された。口唇ヘルペスの 原因として知られる単純ヘルペスウイルス（HSV）、麻疹を引き起す麻疹ウイルス、天然痘 のワクチンとして用いられるワクシニアウイルスなど、様々なウイルスが腫瘍溶解性ウイ ルスとして利用されている（Cattaneo et al., 2008）（図 1）。欧米では、HSV を基盤とする腫 瘍溶解性ウイルスであるtalimogene laherparepvec（T-VEC）が 2015 年に医薬品承認された。 本邦においても、HSV を基盤とする制限増殖型 oncolytic HSV である G47Δや HF10 の第 Ⅱ相臨床試験が進められている（Todo et al., 2001; Nakao et al., 2011）。

1-2. 腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（oncolytic herpes simplex virus; oHSV）療法

的に欠失もしくは不活化しているため、正常細胞に対して侵入する一方で、細胞傷害能は 示さない。臨床試験結果からも高い安全性が確認されている。しかしながら、安全性を担 保するための遺伝子改変によりがん細胞に対する殺傷能も減弱してしまうため、有効性を 高めることが大きな課題の一つとして考えられている。

1-3. 単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus; HSV）

1-4. HSV の細胞内侵入機序

HSV の細胞内侵入はエンベロープに表出する糖タンパク質 B（gB）もしくは糖タンパク 質C（gC）が宿主細胞表面上のヘパラン硫酸と結合することにより開始する（Herold et al., 1991; Herold et al., 1994; Lycke et al., 1991）。細胞表面に吸着した後、糖タンパク質 D（gD） がgD 受容体である nectin-1 あるいは herpesvirus entry mediator（HVEM）に結合することに より gD に構造変化が生じる（Carfi et al., 2001; Geraghty et al., 1998; Ligas et al., 1988; Montgomery et al., 1996; Krummenacher et al., 2005）。gD と受容体の結合がトリガーとなり、 糖タンパク質H（gH）と糖タンパク質 L（gL）のヘテロ二量体が活性化し、gB がエンベロ ープと細胞膜の膜融合を生じさせることにより HSV が細胞内に侵入すると考えられてい る（Cai et al., 1988; Forrester et al., 1992; Hutchinson et al., 1992; Roop et al., 1993）（図 3）。gD とgD 受容体の結合は HSV の細胞内侵入の成立に必須な要因の一つである。

1-5. 受容体標的化 oHSV（receptor-retargeted oHSV; RR-oHSV）

合には 8 個のアミノ酸残基（E27、K28、K31、Q32、N35、D40、E42、W45）が関与する （Sauer-Eriksson et al., 1995）。そこで、抗体との結合能が著しく低下することを期待して、 その8 つのアミノ酸をアラニンに置換した C2mut を挿入した抗体非結合型 gD（gDc2mut） を作製した（図8）。

gDc2mut を強制発現させた CHO-K1 細胞を用いて、細胞表面における gDc2mut の発現お よび抗体との結合能をフローサイトメーターを用いて解析した。抗gD 抗体および Alexa488 標識抗マウス IgG 抗体を用いて染色した結果、gDc2mut を強制発現させた細胞は gDc2 を 強制発現させた細胞と同程度のシフトであることから、gDc2mut は細胞表面に発現するこ とが確認できた。その一方で、Alexa488 標識抗マウス IgG 抗体のみを用いて染色した結果、 gD wt を強制発現させた細胞および gD delta を強制発現させた細胞と同程度のシフトであ った（図7、B）。この結果から gDc2mut に抗体は結合しないことが示唆された。以上のこ とから、gDc2 は C2 ドメインを介して抗体が結合していることが示唆された。 2-2. KGNc2 および KGNc2mut の特性評価 これまでの解析により、gDc2 は細胞表面に発現し、かつ C2 ドメインを介して抗体に結 合することが示唆された。そこで、gDc2 を有する組換え HSV（KGNc2）を bacterial artificial chromosome（BAC）システムを用いて作製することとした。またコントロールウイルスと して、細胞表面に発現するが抗体に結合しないことが確認されたgDc2mut を有する組換え HSV（KGNc2mut）を作製した。 2-2-1. BAC システムを利用して KGNc2 および KGNc2mut を作製した

2-2-3. KGNc2 は抗原抗体依存的に細胞内侵入した

レングリコール（PEG）法により細胞融合し、抗体産生ハイブリドーマライブラリーを作 製した。KGNc2 の細胞内侵入を仲介する抗体を選別するために、ハイブリドーマ上清と KGNc2 を混合し、U87 細胞に感染させた（図 12）。その結果、U87 細胞への KGNc2 の細胞 内侵入を仲介する２つの抗体クローン（U#1 および U#2）が得られた。それぞれの抗体ク ローンについて2 回の限界希釈することにより、モノクローナル化した。本研究では U#1 抗体についての解析結果を報告する。 2-3-2. U#1 抗体存在下において KGNc2 は U87 細胞に細胞内侵入した gDc2 に結合した U#1 抗体が U87 細胞に発現する抗原を認識し、かつ KGNc2 の細胞内侵 入を仲介することを確認するために、まずU#1 抗体と U87 細胞の結合能をフローサイトメ トリー解析により評価した。その結果、U#1 抗体は U87 細胞に結合した。このことから U#1 抗体はU87 細胞に発現する分子を認識することが確認された（図 13）。

U87 細胞の膜表面に発現する EREG と U#1 抗体が結合しているか否かを解析するため に、EREG に対する配列が異なる 3 種類の siRNA（siEREG）もしくは陰性対照 siRNA をト ランスフェクションした U87 細胞と U#1 抗体および陰性対照抗体の結合能をフローサイ トメトリー解析により評価した。その結果、陰性対照siRNA をトランスフェクションした U87 細胞においては、陰性対照抗体と比較して、U#1 抗体は右にシフトした。一方で、siEREG をトランスフェクションしたU87 細胞においては、陰性対照抗体および U#1 抗体のシフト が同程度であった。このことから、U#1 抗体は U87 細胞の膜表面に発現する EREG に結合 していることが示唆された（図17）。

2-4-3. U#1 抗体存在下において KGNc2 は epiregulin を強制発現させた細胞に侵入した

胞が検出された。KGNc2mut を抗体存在下で感染させた結果、EGFP 陽性細胞は検出されな かった。このことから、U#1 抗体は EREG を介した KGNc2 の細胞内侵入を仲介すること が示唆された。

2-5. KGNEreg の作製

KGNc2 の B16-EpCAM 細胞への細胞内侵入を仲介した MY24 抗体は RR-oHSV への応用 が可能であったことから、KGNc2 の細胞内侵入を仲介した U#1 抗体は RR-oHSV へ応用可 能であることが期待される。U#1 抗体の RR-oHSV への応用の可否を検討するために、単鎖 抗体化したU#1 を挿入した gD を有する RR-oHSV（KGNEreg）を作製した。

2-5-1. BAC システムを利用して KGNEreg を作製した

KGNEreg を作製するために、まずは U#1 抗体を単鎖抗体化した。U#1 抗体産生ハイブリ ドーマから RNA を抽出し、cDNA を合成した。cDNA を鋳型に縮重プライマーを用いた PCR を施行することにより軽鎖と重鎖の可変領域（VL、VH）を増幅し、VLとVHをグリシ

2-5-2. KGNEreg は U87 細胞に侵入した

gDscU#1 が HSV の細胞内侵入を成立させるか否かを検討するために、KGNEreg および EpCAM 標的化 HSV（KGNEp）（Shibata et al., 2016）を U87 細胞に感染させた。U87 細胞は EpCAM を細胞表面に発現しない細胞株である（Shibata et al., 2016）。その結果、KGNEp と 比較して KGNEreg を感染させた U87 細胞において、多数の EGFP 陽性細胞が検出された （図20）。

2-5-3. KGNEreg の U87 細胞への侵入は U#1 抗体により阻害された

胞内侵入の阻害は生じなかったことが示唆された。一方、U#1 抗体存在下では抗体濃度に 依存してEGFP 陽性細胞数が減少した。この結果から、U87 細胞に発現する EREG を介し てKGNEreg は細胞内侵入していることが示唆された。

2-5-4. KGNEreg は epiregulin を強制発現させた細胞に侵入した

第

3章

考察

3-1. EREG について

EREG は、全 7 種類ある EGF ファミリー分子の一つである。169 個のアミノ酸からなる Ⅰ型膜貫通タンパク質であり、EREG 前駆体として細胞表面に発現し、a disintegrin and metalloproteinase（ADAM）17 によって切断され、46 個のアミノ酸の分泌型 EREG となる （Sahin et al., 2004）。分泌型 EREG は EGFR あるいは ErbB2 と結合し、ErbB 受容体を活性 化する。

正常組織においては唾液腺（Yang et al., 2017）、大腸（Neufert et al., 2013）、卵巣（Amsterdam et al., 2011）、胎盤（Armant et al., 2015）ならびにケラチノサイト（Shirakata et al., 2000）に 発現している。一方で、食道（Sun et al., 2016）、精巣（Adam et al., 1999）、口腔（Shigeishi et al., 2008）には発現しない。がんにおいては、口腔扁平上皮がん（Shigeishi et al., 2008）、 乳がん（Révillion et al., 2008）、非小細胞性肺がん（Zhang et al., 2008）、卵巣がん（Amsterdam et al., 2011）、食道がん（Sun et al., 2016）、胃がん（Byeon et al., 2017）、大腸がん（Vychytilova-Faltejskova et al., 2017; Yoshida et al., 2013）ならびにグリオーマ（Kohsaka et al., 2014）に発 現している。唾液腺がん（Yang et al., 2017）、膵がん（Zhu et al., 2000）、膀胱がん（Thøgersen et al., 2001）ならびに軟部肉腫（Yamamoto et al., 2004）においては正常組織と比較して、 EREG の発現量が増加する。

唾液腺がんにおいてはEREG の発現量とがんの悪性度が相関しており、EREG が E-カド ヘリンの発現を低下させることにより、上皮間葉移行が引き起こされる。また、EREG は 血管内皮細胞の運動能を亢進させ、血管新生を促進する。（Yang et al., 2017）。

がん治療の標的分子としての臨床開発は報告されていない。糖尿病性腎症を対象とした EREG および transforming growth factor αに対する抗体を用いた第 1 相臨床試験が行われ たが、治療効果および毒性は見られなかった（Sloan-Lancaster et al., 2018）。

3-2. U#1 抗体を用いた免疫沈降の結果、17 kDa および 27 kDa にバンドが検出された

がん細胞において EREG は ErbB 受容体と結合し、ERK1/2 カスケードや PI3K/Akt 経路 を活性化することにより、細胞の運動能を増加させる（Hu et al., 2009）。そのため、EREG とErbB 受容体の結合を中和する抗体であった場合には、がんの悪性化を阻害し得る。また ADAM17 による切断後に生じる C 末端フラグメントは、エンドサイトーシスにより取り込 まれ、転写因子として機能する（Higashiyama et al., 2011）。EREG がどの分子の発現を誘導 するのか、抑制するのかについてはまだ未解明であるが、これらの発現変動ががん悪性化 に関与していた場合には、U#1 抗体が EREG 前駆体に結合し、リソソームへの輸送を仲介 することにより、がんの悪性化を抑制し得る。U#1 抗体のエピトープを決定し、どの構造 のEREG を認識するかを解析することにより、U#1 抗体の治療への応用についての洞察が 得られる。 3-3. KGNc2 は RR-oHSV に応用可能な抗体を探索するプローブとして有用であることが示 唆された RR-oHSV に応用する抗体には、単鎖抗体化して gD に挿入した際に抗原との結合能を維 持し、かつRR-oHSV の細胞内侵入を仲介する特性が求められる。単鎖抗体が RR-oHSV の 細胞内侵入を仲介するか否かを規定する因子は不明である。そこで、我々はHSV を基盤と した抗体探索プローブ（KGNc2）を作製した。KGNc2 を用いて抗体スクリーニングを施行 し、KGNc2 の細胞内侵入を仲介する抗体（U#1）を樹立した。KGNc2 の細胞内侵入を仲介 しても必ずしもRR-oHSV に応用できるとは限らない。U#1 抗体の RR-oHSV への応用の可 否を検討した結果、U#1 単鎖抗体を挿入した HSV（KGNEreg）は EREG を介して細胞内侵 入した。このことから、U#1 抗体は RR-oHSV に応用可能であることが明らかとなった。ま た、すでにRR-oHSV への応用可能な抗 EpCAM 抗体 MY24 も KGNc2 の細胞内侵入を仲介 した。これらの結果より、KGNc2 の細胞内侵入を仲介する抗体は RR-oHSV に応用可能で あることが強く示唆された。以上のことから、KGNc2 を抗体探索プローブに用いることに より RR-oHSV に好適な抗原・抗体セットを効率良く探索することが可能であることが期 待される。

第

4章

実験材料

4-1. 細胞

 _{Vero 細胞（アフリカミドリザル腎細胞株, ATCC_CCL-81）、Vero 細胞亜株}

Vero 細胞および VD60 細胞（gD 強制発現 Vero 細胞亜株, Ligas et al., 1988）はダルベッコ 変法イーグル培地（DMEM）に 5 %量の fetal bovine serum（FBS）（Tissue Culture Biologicals） および1 %量のペニシリン（100 units/mL）-ストレプトマイシン（100 μg/mL）混合液（Thermo Fisher Scientific）を加えた培地を用いて培養した。Vero-EREG 細胞は DMEM 培地に 5 %量 のFBS および 1 %量のペニシリン（100 units/mL）-ストレプトマイシン（100 μg/mL）混合 液（Thermo Fisher Scientific）を加えた培地にピューロマイシン（Thermo Fisher Scientific） を終濃度が4 μg/mL となるように加えて培養した。

Vero-EREG 細胞は以下のように作製した。レトロウイルスパッケージング細胞株 PLAT-A にシャトルベクターpMXc-puro-hEREG を Lipofectamine 3000 Transfection Reagent（Thermo Fisher Scientific）を用いて遺伝子導入した。ピューロマイシン耐性遺伝子およびヒト EREG 遺伝子を搭載したレトロウイルスを回収し、Vero 細胞に感染させた。4 μg/mL になるよう にピューロマイシンを加えて薬剤選抜した。  _{U87 細胞（ヒト神経膠芽腫細胞株, ATCC_HTB-14）} DMEM に 10 %量の FBS および 1 %量のペニシリン（100 units/mL）-ストレプトマイシン （100 μg/mL）混合液を加えた培地を用いて培養した。  _{P3X63Ag8U.1（P3U1）細胞 （マウス骨髄腫細胞株, ATCC_CRL-1597）}

ロズウェルパーク記念研究所1640 培地（RPMI1640）（Thermo Fisher Scientific）に 10 % 量のFBS、1 %量のペニシリン（100 units/mL）-ストレプトマイシン（100 µg/mL）混合液を 加えた培地を用いて培養した。

 _{CHO-K1 細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞株, ATCC_CL-61）}

Ham's F-12K（Kaighn's）培地（Thermo Fisher Scientific）に 10 %量の FBS、1 %量のペニ シリン（100 units/mL）-ストレプトマイシン（100 μg/mL）混合液、1 mM ピルビン酸ナトリ ウム（Thermo Fisher Scientific）を加えた培地を用いて培養した。

 _{B16 細胞（マウスメラノーマ細胞株, RIKEN CELL BANK_RCB1283）、B16 細胞亜株} B16 細胞は DMEM に 10 %量の FBS および 1 %量のペニシリン（100 units/mL）-ストレ プトマイシン（100 μg/mL）混合液を加えた培地を用いて培養した。B16（mock-transduced） 細胞、B16-HVEM 細胞、B16-nectin-1 細胞、B16-EpCAM 細胞、B16-EREG 細胞は DMEM に 10 %量の FBS および 1 %量のペニシリン（100 units/mL）-ストレプトマイシン（100 μg/mL） 混合液を加えた培地にピューロマイシンを終濃度が1 μg/mL となるように加えて培養した。

いて遺伝子導入した。ピューロマイシン耐性遺伝子を搭載したレトロウイルスを回収し、 B16 細胞に感染させた。1 μg/mL になるようにピューロマイシンを加えて薬剤選抜した。

B16-HVEM 細胞は以下のように作製した。PLAT-A にシャトルベクターpMXc-puro-HVEM をLipofectamine 3000 Transfection Reagent を用いて遺伝子導入した。ピューロマイシン耐性 遺伝子およびヒトHVEM 遺伝子を搭載したレトロウイルスを回収し、B16 細胞に感染させ た。1 μg/mL になるようにピューロマイシンを加えて薬剤選抜した。

B16-nectin-1 細胞は以下のように作製した。PLAT-A にシャトルベクターpMXc-puro-nectin1 を Lipofectamine 3000 Transfection Reagent を用いて遺伝子導入した。ピューロマイシ ン耐性遺伝子およびヒト nectin-1 遺伝子を搭載したレトロウイルスを回収し、B16 細胞に 感染させた。1 μg/mL になるようにピューロマイシンを加えて薬剤選抜した。

B16-EpCAM 細胞は以下のように作製した。PLAT-A にシャトルベクターpMXc-puro-EpCAM を Lipofectamine 3000 Transfection Reagent を用いて遺伝子導入した。ピューロマイ シン耐性遺伝子およびヒト EpCAM 遺伝子を搭載したレトロウイルスを回収し、B16 細胞 に感染させた。1 μg/mL になるようにピューロマイシンを加えて薬剤選抜した。

B16-EREG 細胞は以下のように作製した。PLAT-A にシャトルベクターpMXc-puro-hEREG をLipofectamine 3000 Transfection Reagent を用いて遺伝子導入した。ピューロマイシン耐性 遺伝子およびヒトEREG 遺伝子を搭載したレトロウイルスを回収し、B16 細胞に感染させ た。1 μg/mL になるようにピューロマイシンを加えて薬剤選抜した。

4-2. プラスミド

■ pCAcc

chicken β-actin （CA）プロモーターの下流にマルチクローニングサイトが存在する発現 プラスミド。 ■ pSP72 クローニングベクター。プロメガ社より購入した。 ■ pQE30-DT3C 連鎖球菌プロテインG 由来の 3C ドメインがクローニングされている（Yamaguchi et al., 2014）。 ■ pEP-Kan-S2 カナマイシン耐性遺伝子がクローニングされている（Tischer et al., 2006）。 ■ pRed/ET

BAD プロモーター制御下に Red/ET 遺伝子を発現する。Gene Bridges 社より購入した。 ■ pBAD-I-Sce I

CA プロモーター制御下に Cre リコンビナーゼを発現する。東京大学 斎藤泉先生より供 与。

■ pSP72-c2

pQE30-DT3C を鋳型に polymerase chain reaction (PCR) で C2 ドメインをコードする配列 を増幅し、pSP72（制限酵素サイト：EcoR I、Xho I）に挿入した。

■ pgDsac-FX HSV-1 の gD プロモーター制御下に gDwt を発現する（Tsvitov et al., 2007）。 ■ pgD:d2-24/Y38C HSV-1 の gD プロモーター制御下に 2 番目から 24 番目までのアミノ酸の欠失と 38 番目 のチロシンをシステインに変異させたgD（gD delta）を発現する（Uchida et al., 2013）。 ■ pgD:d2-24/Y38C-c1 HSV-1 の gD プロモーター制御下に 2 番目から 24 番目までのアミノ酸をプロテインＧの C1 ドメインに置換し 38 番目のチロシンをシステインに変異させた gD（gDc1）を発現す る。pQE30-DT3C を鋳型に PCR で C1 ドメインをコードする配列を増幅し、pgD:d2-24/Y38C （制限酵素サイト：BamH I）に挿入した。 ■ pgD:d2-24/Y38C-c2 HSV-1 の gD プロモーター制御下に 2 番目から 24 番目までのアミノ酸をプロテインＧの C2 ドメインに置換し 38 番目のチロシンをシステインに変異させた gD（gDc2）を発現す る。pSP72-c2 から BamH I で切り出した C2 ドメインをコードする配列を pgD:d2-24/Y38C （制限酵素サイト：BamH I）に挿入した。 ■ pgD:d2-24/Y38C-c3 HSV-1 の gD プロモーター制御下に 2 番目から 24 番目までのアミノ酸をプロテインＧの C3 ドメインに置換し 38 番目のチロシンをシステインに変異させた gD（gDc3）を発現す る。pQE30-DT3C を鋳型に PCR で C3 ドメインをコードする配列を増幅し、pgD:d2-24/Y38C （制限酵素サイト：BamH I）に挿入した。 ■ pgD:d2-24/Y38C-3c HSV-1 の gD プロモーター制御下に 2 番目から 24 番目までのアミノ酸をプロテインＧの C ドメイン（C1、C2、C3 のすべてを含む）に置換し 38 番目のチロシンをシステインに変 異させたgD（gD3C）を発現する。pQE30-DT3C を鋳型に PCR で 3C ドメインをコードす る配列を増幅し、pgD:d2-24/Y38C（制限酵素サイト：BamH I）に挿入した。 ■ pTAC2-c2mut pgD:d2-24/Y38C-c2 を鋳型に C2 中の 8 つのアミノ酸に変異（E27A、K28A、K31A、Q32 A、N35A、D40A、E42A、W45A）を挿入した c2mut フラグメントを増幅し、pTAC-2 に TA クローニングした。

CA プロモーター制御下に gDwt を発現する（Pertel et al., 2001）。 ■ pCAgD:d2-24/Y38C

CA プロモーター制御下に gDdelta を発現する。pgD:d2-24/Y38C から Nco I、BstX I で切 り出したフラグメントとpPEP99 から Eag I、Nco I で切り出したフラグメントを pPEP99（制 限酵素サイト：Eag I、BstX I）に挿入した。

■ pCAgD:d2-24/Y38C-c1

CA プロモーター制御下に gDc1 を発現する。pgD:d2-24/Y38C-c1 から Nco I、BstX I で切 り出したフラグメントとpPEP99 から Eag I、Nco I で切り出したフラグメントを pPEP99（制 限酵素サイト：Eag I、BstX I）に挿入した。

■ pCAgD:d2-24/Y38C-c2

CA プロモーター制御下に gDc2 を発現する。pgD:d2-24/Y38C-c2 から Nco I、BstX I で切 り出したフラグメントとpPEP99 から Eag I、Nco I で切り出したフラグメントを pPEP99（制 限酵素サイト：Eag I、BstX I）に挿入した。

■ pCAgD:d2-24/Y38C-c3

CA プロモーター制御下に gDc3 を発現する。pgD:d2-24/Y38C-c3 から Nco I、BstX I で切 り出したフラグメントとpPEP99 から Eag I、Nco I で切り出したフラグメントを pPEP99（制 限酵素サイト：Eag I、BstX I）に挿入した。

■ pCAgD:d2-24/Y38C-3c

CA プロモーター制御下に gD3C を発現する。pgD:d2-24/Y38C-3c から Nco I、BstX I で切 り出したフラグメントとpPEP99 から Eag I、Nco I で切り出したフラグメントを pPEP99（制 限酵素サイト：Eag I、BstX I）に挿入した。

■ pCAgD:d2-24/Y38C-c2mut

CA プロモーター制御下に 2 番目から 24 番目までのアミノ酸を c2mut に置換し 38 番目 のチロシンをシステインに変異させた gD（gDc2mut）を発現する。pCAgD:d2-24/Y38C-c2 からEag I、Pst I で切り出したフラグメントと pTAC2-c2mut から Pst I、BspE I で切り出し たフラグメントをpCAgD:d2-24/Y38C-c2（制限酵素サイト：Eag I、BspE I）に挿入した。 ■ pgD:d2-24/Y38C-c2mutAflKan

2 番目から 24 番目までのアミノ酸を c2mut に置換し 38 番目のチロシンをシステインに 変異させたgD（gDc2mut）をコードする。カナマイシン耐性遺伝子が gDc2mut の 5’側非翻 訳領域に挿入されている。gDc2mut を発現する KGNc2mut を BAC システムにより作製す る た め の フ ラ グ メ ン ト を 調 製 す る 際 の テ ン プ レ ー ト プ ラ ス ミ ド と し て 使 用 し た 。 pCAgD:d2-24/Y38C-c2mut から BamH I で切り出したフラグメントを pgD:d2-24/Y38CAflKan （pHU194）から BamH I で切り出したフラグメントに挿入した（制限酵素サイト：BamH I） に挿入した。

BAC プラスミド。HSV-1（KOS）のウイルスゲノムの全長を有し、その UL3 と UL4 の間 にサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターで制御された EGFP 発現カセットが挿入さ れている。また、UL27（gB）にエントリー促進変異である D285N/A549T（N/T）が挿入さ れている（Shibata et al., 2016）。

4-3. 抗体

 _{抗 EpCAM 抗体：MY24（Yamaguchi et al., 2014）}  _{mouse anti-gD monoclonal antibody (DL6 : sc21719)} Santa Cruz Biotechnology 社より購入した。

 _{LEAF purified mouse IgG1, κ isotype control（MG1-45 : 401405）} BioLegend 社より購入した。

 _{PLEAF purified mouse IgG3, κ isotype control（MG3-35 :} 401310） BioLegend 社より購入した。

 _{Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG（H+L）antibody（A-11001）} Life Technologies 社より購入した。 4-4. ウイルス  _KGN 非標的化oHSV。サイトメガロウイルス前初期プロモーター制御下で EGFP を発現する。 細胞内侵入増強変異（gB:D285N/A549T）を有する（Uchida et al., 2010）。  _KGNc2 抗体結合ドメイン挿入型 HSV。サイトメガロウイルス前初期プロモーター制御下で EGFP を発現する。細胞内侵入増強変異（gB:D285N/A549T）を有する（Uchida et al., 2010）。 gD の 2 番目から 24 番目のアミノ酸が連鎖球菌のプロテイン G 由来の C2 ドメインと置換 されており、38 番目のアミノ酸がチロシンからシステインに変異している。  _KGNc2mut 抗体非結合ドメイン挿入型 HSV。C2 ドメインの抗体結合に関与する 8 つのアミノ酸が アラニンに置換されている点のみKGNc2 と異なる。  _KGNEp

EpCAM 標的化 oHSV。サイトメガロウイルス前初期プロモーター制御下で EGFP を発現 する。細胞内侵入増強変異（gB:D285N/A549T）を有する（Uchida et al., 2010）。gD の 2 番 目から 24 番目のアミノ酸が抗 EpCAM 単鎖抗体と置換されており、38 番目のアミノ酸が チロシンからシステインに変異している（Shibata et al., 2016）。

 _KGNEreg

第

5章

実験方法

5-1. 動物培養細胞へのプラスミドの導入

単層培養した細胞にLipofectamine LTX（Thermo Fisher Scientific）もしくは Lipofectamine 3000 Transfection Reagent を用いてプラスミドをトランスフェクションした。

5-2. フローサイトメトリー解析

細胞をトリプシン処理により回収しPBS（Sigma）あるいは 5 %量の BSA（Wako）入り PBS（洗浄液）を用いて 2 回洗浄し、1 サンプルあたり 5×105_{個となるように細胞を調製し}

た。1 次抗体を 2 μg 加え 4 ℃で 30 分間インキュベートした後、洗浄液で 2 回洗浄した。2 次抗体としてAlexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG（H+L）antibody（Thermo Fisher Scientific）を 2 μg 加え、4 ℃で 30 分間インキュベートした。洗浄液で 2 回洗浄した後、サ ンプルをFACS Calibur（日本 BD）で解析した。

5-3. KGNc2・KGNc2mut の作製

後、DMEM 培地に 10% 量の FBS および 1 %量のペニシリン（100 units/mL）-ストレプト マイシン（100 μg/mL）混合液を加えた培地を加えて、37 ℃で 6 時間培養した。感染から 8 時間後のEGFP の発現を蛍光顕微鏡 BZ-X700（KEYENCE）を用いて観察した。 5-7. ハイブリドーマライブラリーの作製 5×106_{個のU87 細胞を約 1 週間ごとに 5 回雌の BALB/c（東京実験動物）の腹腔に投与し} た。同様の方法でさらに1 回、追加免疫を行った後にマウスの脾臓を摘出し、10 cm デッ シュ上で細かく分散させた。滅菌した目開き67 μm のナイロン網（東京スクリーン）によ り不純物を除き 1,500 rpm で 5 分間、室温で遠心した。上清を除き溶血処理した後に RPMI1640（無血清）で 2 回洗浄した。得られた脾細胞を P3U1 細胞と細胞比が 5:1 になる ように調製し、PEG1500（Roche）を 1 mL 加え室温で 2 分間インキュベートした。RPMI1640 に10 %量の Super Low IgG FBS（Thermo Fischer Scientific）と 1 %量の 100 units/mL ペニシ リン-100 μg/mL ストレプトマイシン、1 %量の 1 mM ピルビン酸ナトリウムを加えた培地で 1 回洗浄後、RPMI1640 培地に 10 %量の Super Low IgG FBS、1 %量の 100 units/mL ペニシ リン-100 μg/mL ストレプトマイシン、1 %量の 1 mM ピルビン酸ナトリウム、128 μM 2-メ ルカプトエタノール（Nacalai Tesque）、5 %量の Briclone（Ncbi）、HAT（100 μM ヒポキサ ンチン、0.4 μM アミノプテリン、16 μM チミジン）（Sigma）を加えた培地（HAT 培地）に 懸濁して96 ウェルプレートに播種し 37 ℃、5 % CO₂存在下にて培養した。6 日後に培地交 換した。動物実験は東京薬科大学の動物実験委員会に承認された方法で行った。

5-8. KGNc2 アッセイ（抗体スクリーニング）

DMEM に 10 %量の Super Low IgG FBS と 1 %量の 100 units/mL ペニシリン-100 μg/mL ス トレプトマイシンを加えた培地（DMEM-low 培地）を用いて KGNc2 が 500 gc/cell になる ように調製した。ハイブリドーマ上清と調製した KGNc2 懸濁液を等量混合し、4 ℃で 30 分間静置した。トリプシン処理によりU87 細胞を回収し、PBS で 2 回洗浄後 DMEM-low 培 地に懸濁した。KGNEreg と抗体の混合液を添加した 96 ウェルプレートに 4×104個/50 μL ず つ播種し、37 ℃、5 % CO₂存在下にて培養した。24 時間後の EGFP の発現を蛍光顕微鏡を 用いて観察した。 5-9. 免疫沈降

1×107_{個の細胞の細胞膜表面タンパク質を EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin（Thermo Fischer}

に非特異的に結合したタンパク質を除去するために遠心してビーズを取り除きタンパク質 抽出液を作製した。U#1 抗体とタンパク質抽出液をそれぞれ混合し、4 ℃で 30 分間インキ ュベートした後に、それぞれのサンプルに50 %ビーズを 60 μL 加え 4 ℃で 60 分間インキ ュベートした。上清を除きlysis buffer を用いて 6 回洗浄し、2×sodium dodecyl sulfate（SDS） sample buffer（BIO RAD）を 60 μL 加えた。100 ℃で 5 分間ボイルした後にサンプル 15 μL に200 mM dithiothreitol（DTT）（Nacalai Tesque）4 μL を加えたサンプルを 5-20 %のグラジ エントポリアクリルアミドゲル（Wako）を用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、 polyvinylidene difluoride（PVDF）膜（MILLIPORE）にセミドライ法を用いて転写した。PBS に5 %スキムミルク（Nacalai Tesque）と 0.02 % Tween-20（Nacalai Tesque）を加えたブロッ キング液を用いてPVDF 膜を室温で 1 時間ブロッキングした。PBS に 0.02 % Tween-20 を 加えた洗浄液（0.02 % PBS-T）で PVDF 膜を洗浄した後に、0.02 % PBS-T を用いて 1:2,000 に希釈したstreptavidin-horseradish peroxidase conjugate（GE Healthcare）に PVDF 膜を浸し室 温で30 分間静置した。0.02% PBS-T で洗浄し、検出には enhanced chemiluminescence（ECL） 法を用いた。ECL1 液（100 mM Tris-HCl pH 8.5, 2.5 mM Luminol, 0.4 mM p-Coumaric acid） とECL2 液（0.1 M Tris-HCl pH 8.5, 0.015 % H₂O₂）を等量混ぜ合わせてメンブレンを浸し、 LAS-4000（FUJIFILM）で検出した。

5-10. 動物培養細胞へのsmall interference RNA（siRNA）の導入

第

6章

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