さいたま市内で複数発生した腸管出血性大腸菌 O157：H- 感染事例における Stx2 サブタイプが細菌検査に及ぼした影響
1）さいたま市健康科学研究センター，2）さいたま市保健所
泊 賢太郎
１）嘉悦 明彦
２）上野 裕之
１）蕪木 康郎
１）菊地 孝司
１）小堀すみえ
１）宮崎 元伸
１）（平成 28 年 4 月 19 日受付）
（平成 28 年 7 月 8 日受理）
Key words : enterohemorrhagicEscherichia coli（EHEC）,Shiga toxin, subtype, outbreak
要 旨
2013 年，さいたま市内で 2 つの腸管出血性大腸菌（enterohemorrhagic Escherichia coli；EHEC）O157 感 染事例が発生した．それぞれ異なる医療機関から腸管出血性大腸菌感染症発生届が提出され，ベロ毒素（Vero toxin；VT，または志賀毒素 Shiga toxin；Stx）について，一方には Stx1 産生，もう一方には Stx1 および Stx2 産生と記載されていた．通常別事例とされる内容であったが，保健所による聞き取り調査により，2 事 例に共通食があったことが判明した．最終的には，それぞれの事例の 3 名と 1 名から EHEC が分離され，こ れら 4 株を当センターで解析した．その結果，全て O157：H-であり，Stx 遺伝子（stx）解析の結果，stx1 およびstx2を保有していることが明らかになった．性状や PFGE の泳動パターンも一致したため，この 4 株は同一クローン由来であると示唆された．一方，これらの菌株が保有していた Stx2 遺伝子は，サブタイ
プのstx2cだった．Stx2 のサブタイプの中には，Stx 産生性を確認する検査法で検出感度が低いものがある．
一方の医療機関の発生届に Stx2 の記載がなかったのは，Stx 産生性検査のこのような特性が影響した可能 性が示唆された．聞き取り調査により発生届の内容が異なる 2 事例の関連性が疑われ，菌株の検査によりそ れが裏付けられた．本事例から，地方衛生研究所の検査体制の整備や精度の確保，さらに，疫学調査におけ る各機関の相互の連携や迅速な情報のやり取りができる協力体制の確立が重要と考える．
〔感染症誌 90：792〜797，2016〕
序 文
腸管出血性大腸菌（enterohemorrhagic Escherichia coli；EHEC）はベロ毒素（Vero toxin；VT，または 志賀毒素 Shiga toxin；Stx）を産生することにより，
腹痛，下痢，血便，時には溶血性尿毒症症候群や脳炎 などの重篤な症状を引き起こす．EHEC 感染症は，感 染症の予防及び感染症の患者に対する医療に関する法 律（感染症法）の 3 類感染症に分類され，診断した医 師は直ちに腸管出血性大腸菌感染症発生届（発生届）
を最寄りの保健所に提出することが義務付けられてい る．届出の基準は，分離・同定により病原体を検出し，
かつ，Stx 産生性あるいは polymerase chain reaction
（PCR）法等で Stx 遺伝子（stx）を確認した場合等と されている．
Stx は，抗原性の違いから Stx1 と Stx2 に大別され，
さらにそれぞれがアミノ酸配列の異なる複数のサブタ イプを有している１）２）．赤痢菌が産生する Stx に対し，
Stx1 は，そのサブタイプも含め，高い相同性を示す 一方，Stx2 は 60％ 程度の相同性にとどまる３）．さら に，Stx2 はサブタイプの数が多く，サブタイプをコー ドする遺伝子はstx2a，stx2b，stx2c，stx2dなどに分 類されている２）．
今回，我々は，さいたま市内で発生した直接の接触 が無い 2 つの EHEC O157 感染事例を経験した．各事 例が探知される発端となった症例は，それぞれ異なる 医療機関から発生届が提出され，異なる Stx 型が記 原 著
別刷請求先：（〒338―0013）さいたま市中央区鈴谷 7 丁目 5 番 12 号
さいたま市健康科学研究センター保健科学課 泊 賢太郎
載されていた．しかしながら，最終的に分離された EHEC4 株の遺伝子解析の結果，全て同一のクローン に由来することが確認された．同一クローンでありな がら Stx 型に違いが生じた要因として，stx2のサブタ イプの存在が示唆された．この経験に考察を加えて報 告する．
材料と方法 1．事例の概要
2013 年，さいたま市内の医療機関 A より，さいた ま市保健所に，腹痛と水様性下痢を主訴に受診した 10 歳代の女児（No.1）の EHEC O157 感染症の発生届が 提出された（Day 0）．この発生届には，毒素産生性 試験により Stx1 のみを確認したことが記載されてい た．また，Day 3 に，医療機関 B から，腹痛と水様 性下痢，血便を主訴に受診した 30 歳代の女性（No.4）
の EHEC O157 感染症の発生届が提出された．この発 生届には，毒素産生性試験により Stx1 と Stx2 の両 方を確認したことが記載されていた．
これらの発生届に基づき，さいたま市保健所が接触 者健康診断を含む積極的疫学調査を実施した．No.1 の接触者として，同居家族 4 名が接触者検便の対象と された（Case 1）．接触者検便により，Day 6 に No.1 の母親が無症状病原体保有者（No.2）として把握され た．No.2 から分離された菌株は，当センターで PCR 法により確認したところ，stx1とstx2を保有してい た．また，接触者検便実施中の Day 4 に，医療機関 A より，No.1 の弟（No.3）の EHEC O157 感染症の 発生届が提出された．この発生届には，No.1 と同様 に毒素産生性試験により Stx1 のみが確認されたこと が記載されていた．さらに，保健所の聞き取り調査に より，No.3 が No.1 に先行して消化器症状を来してい たこと，および Case 1 の家庭では食材宅配業者を利 用していることが把握された．
No.4 の接触者として，同居家族 2 名と，No.4 が消 化器症状を来していた時点で接触のあった親類 5 名の 計 7 名が接触者検便の対象となった（Case 2）．同居 家族は当センターにより，親類 5 名は各々の居住地を 所管する保健所により検便が実施されたが，新たな感 染者は発見されなかった．また，保健所の聞き取り調 査により，No.4 の家庭でも Case 1 と同じ食材宅配業 者を利用していたことが把握され，両家庭が同一の献 立を利用していることが判明した．加えて，Case 1 と Case 2 との間には直接の接触が無いことが確認さ れた．
2．材料
上記の 2 事例に対する接触者検便のために提出され た便検体を試料とし，EHEC O157 の検索を実施した．
また，医療機関 A によって分離された No.1 及び No.3
由来の菌株と，当センターで分離した No.2 由来の菌 株，医療機関 B によって分離された No.4 由来の菌株 を合わせた 4 株について，遺伝子解析等の検討を加え た．
3．EHEC O157 の分離・確認試験
接触者検便は，分離培地にセフィキシム・テルライ ト添加 sorbitol MacConkey（CT-SMAC）寒天培地
（OXOID）を使用し，37℃ で 18〜24 時間培養した．CT- SMAC 寒 天 培 地 に 発 育 し た sorbitol 非 分 解 性 の EHEC O157 が疑われる白色のコロニーを釣菌し，tri- ple sugar iron（TSI）寒天培地（日水製薬），lysine in- dole motility（LIM）培地（栄研化学），Simmons citrate
（SC）寒天培地（栄研化学），普通寒天培地（栄研化 学）に継代し，37℃ で 18 時間培養後，生化学的性状 を確認した．EHEC O157 が疑われる菌株については，
病原大腸菌免疫血清「生研」（デンカ生研）を用い，添 付文書に従い，O 抗原並びに H 抗原の型別試験を行っ た．
4．Stx 試験
Stx 試験として，stx検出試験と Stx 産生性試験を 行った．stx検出試験は，Pollard らの報告４）にあるプ ライマーを用い，PCR 法によりstx1及びstx2を検索 した．普通寒天培地で，37℃，18 時間培養した菌株 を，滅菌蒸留水 100μL に懸濁し，98℃ で 10 分間加熱 後，4℃，18,000×g で 5 分間遠心分離して得られた上 清を template DNA とした．PCR 反応はTaKaRa Ex Taq（タカラバイオ）を用いて行い，増幅産物につい ては 2% アガロースゲル電気泳動で確認した．Stx 産 生性試験は，逆受身ラテックス凝集反応（Reversed Passive Latex Agglutination；RPLA）法の VTEC- RPLA「生研」（デンカ生研）を用い，添付文書に従 い，振盪培養法及び静置培養法で行った．
5．stx2のサブタイプ検索
stx2cの 検 索 は，Scheutz ら の 報 告２）に 準 じ て PCR 法により行った．使用したTaq DNA polymerase お よび template DNA の調整ならびに電気泳動は，4.の stx検出試験と同条件で行った．
6．薬剤感受性試験
Clinical and Laboratory Standards Institute（CLSI）
に準拠した Kirby-Bauer 法により５），発育阻止円径を 測定した．センシ・ディスク（BD）を用い，供試薬 剤 は，ampicillin（ABPC），cefotaxime，kanamycin
（KM），gentamicin，streptomycin（SM），tetracycline
（TC），chloramphenicol（CP），ciprofloxacin，nalidixic acid ， norfloxacin ， fosfomycin ， sulfamethoxazole- trimethoprim の 12 薬剤とした．
7．パルスフィールド・ゲル電気泳動（Pulsed-Field Gel Electrophoresis；PFGE）
Fig. 1 Electrophoretic patterns of PCR amplifica- tion products that detect stx2c
Lane M: 100bp ladder marker (TaKaRa); Lanes 1 to 4: isolates from No.1 to 4 respectively; Lane 5:
Negative control; Lane 6: Positive control
Table 1 Background information of patients and a carrier infected with EHEC O157
Case No. Sex Age Medical
institution
Date of notification
Date of
onset Notes
1 1 F 10s A Day 0 Day -7
1 2＊ F 30s None Day 6 None Mother of No.1
1 3 M 10s A Day 4 Day -11 Brother of No.1
2 4 F 30s B Day 3 Day -7
＊: Asymptomatic carrier
普通寒天培地に接種し，37℃，一晩培養させた菌株 を使用し，泉谷らの方法に従って実施した６）７）．制限酵 素処理は，XbaI（Roche）を用いて 37℃ で 4 時間行っ た．泳動装置には CHEF-DRII（Bio-Rad）を用い，電 圧 6.0V/cm，パルスタイム 2.2〜54.2 秒，泳動時間 19 時間，buffer 温度 12℃ の泳動条件で行った．泳動後，
ゲルを Ethidium bromide で染色し，ゲル撮影装置で 撮影した．得られた遺伝子切断断片によるバンドパ ターンから解析を行った８）．
成 績
1．O157 の分離・確認試験，薬剤感受性試験 今回検討した患者および感染者の概要を Table 1に 示した．当センターでは，Case 1 の No.1 の接触者 4 名と，Case 2 の No.4 の接触者 7 名のうち同居家族で ある 2 名，合計 6 名の接触者検便を実施した．Case 2 の残り 5 名の検査は他自治体で実施された．Case 1 より 1 名（No.2）の EHEC O157 感染が確認され，他 の 10 名は陰性だった．最終的に，接触者検便によっ
て 1 名（No.2）の，医療機関において 3 名（No.1，No.3 及び No.4）の EHEC O157 感染が確認された．分離 された 4 株は，血清型別試験により，すべて O157：
H-と判定され，生化学的性状も同一だった．また，薬 剤感受性試験では 4 株ともすべて，ABPC，KM，SM，
TC，CP に耐性を示し，その他の 7 薬剤に感性を示し た．
2．Stx 試験
PCR 法によるstx検出試験を実施したところ，4 株 すべてがstx1とstx2を保有していた．一方，RPLA 法による Stx 産生性試験を実施したところ，4 株すべ てにおいて，Stx1 は陽性だった．しかしながら，Stx 2 は，振盪培養法では 1：2 以下の凝集価を示し陰性，
静置培養法では 1：2 の凝集価を示し判定保留だった．
3．stx2のサブタイプ検索
PCR 法によりstx2c の検索を行った結果を Fig. 1に 示した．4 株すべてにおいて，stx2c を保有している ことが確認された．
4．PFGE
PFGE による解析結果を Fig. 2に示した．4 株とも 同一のバンドパターンを示すことが確認された．
考 察
今回経験した 2 つの EHEC 感染事例は，発生届に 記載された Stx がそれぞれ異なるものであった．し かしながら，両事例から分離された EHEC4 株は，当 センターでの検査の結果，すべてstx1とstx2を保有 する O157：H-と判定された．生化学的性状，薬剤感 受性および PFGE の泳動パターンも一致したことか ら，これら 4 株は同一クローンに由来することが示唆 された．
感染症法では，分離・同定により病原体を検出し，
かつ，分離菌の Stx 産生性あるいは Stx 遺伝子の保 有を確認した場合等に発生届を提出するよう定めてい る．本事例では，両医療機関ともに Stx 産生を確認 することで発生届を提出していた．当センターでは，
最初に入手した No.1 の分離株を PCR 法で検査した 際，stx1とstx2を検出した．一方，RPLA 法を 用 い た Stx 産生性試験を実施した結果，Stx2 は振盪培養 法で検出されず，静置培養法でも凝集価は極めて低
Fig. 2 PFGE patterns of XbaI digested DNA from EHEC O157: H- strains
Lane M: Salmonella Braenderup;
Lanes 1 to 4: isolates from No.1 to 4 respectively
かった．同じ Case 1 で，接触者検便により No.2 から 分離された菌株も同様の性状を示した．Stx2 は，産 生量の低いサブタイプが知られていることから，PCR 法で確認したところ，stx2cを保有していることが判 明した．これは No.3 の分離株についても同様だった．
また，Case 2 の No.4 の分離株についても，Stx 産生 性試験で同様の結果となり，stx2cを保有していた．
アミノ酸配列がサブタイプ Stx2a とは一部異なる Stx2c を保有する EHEC が存在する１）２）．Stx2a あるい は Stx2c 産生株を比較すると，stx2c mRNA 発現レベ
ルはstx2a mRNA 発現レベルに比べ低い９）．さらに，
RPLA 法による検査でも，Stx2a と比較して Stx2c の 検出感度は低いことが示されている９）〜１１）．また，Stx 産生性を確認する検査法は，RPLA 法の他に Immuno- chromatography（IC）法や enzyme-linked immuno- sorbent assay（ELISA）法がある．しかしながら，Stx2 のサブタイプによっては IC 法や ELISA 法で検出で きない場合がある１２）１３）．本事例では，医療機関等で実
施された検査法の詳細は把握出来ていない．Stx 産生 性を確認する検査法は，サブタイプにより検出感度が 低下する特性があり，医療機関 A の発生届に Stx2 の 記載がなかったのは，その特性が影響した可能性が示 唆された．
集団感染が明らかな患者らのグループにおいて，同 一クローンが原因と考えられる複数人の発生届の Stx に関する記載内容が異なった事例は，過去にも報告さ れている１４）．一方，本事例は直接の接触が無い 2 事例 間で発生し，発生届による判断では原因菌が異なる散 発事例と判断してしまう可能性があった．しかしなが ら，この 2 事例については，保健所の聞き取り調査に より，同一の食材宅配業者から同一の献立を購入して いたという共通項があった．そのため，発生届に間違 いがある可能性，あるいはこの食材が，異なる Stx を保有する複数の菌に汚染されている状況が疑われ た．後者の場合には，汚染の度合いが高いことが予想 され，diffuse outbreak が拡大する可能性も危惧され たため，早急に当センターで検査を実施した．その結 果，分離株はすべて同じ性状を有する EHEC と確認 され，一方の発生届の内容が検査結果と異なっている ことが認められた．さらに，PFGE により，原因菌が 同一クローンに由来することも確認できた．
喫食調査によると，2 事例ともに，購入した肉類は 加熱調理の後喫食され，レタスやキュウリは加熱調理 されずに喫食されていた．そのため，加熱調理されな かった食材が調理過程で肉からの汚染を受けたか，あ るいは購入時点で EHEC に汚染されていた可能性が 考えられた．厚生労働省が行っている食中毒菌汚染実 態調査では，野菜のE. coli汚染が確認されている１５）． また，過去にも EHEC に汚染された野菜や漬物等に よる食中毒事例が報告されている１６）１７）．本事例では，食 中毒としての対応は取られず，食材や調理品の検査を していないため，感染原因の特定には至らなかった．
EHEC 感染症の原因食品として，生肉の危険性は周 知されつつあるものの，生野菜にもその可能性がある ということは，まだ十分周知されていない．生野菜等 による EHEC 感染のリスクについては，更なる周知，
啓発が必要と思われる．
地方衛生研究所には，地域保健対策における科学的 かつ技術的中核機関として，医療機関等での試験検査 について支援する役割が求められている．本事例でも，
医療機関で分離された菌株について，病原因子の探索 を実施したことにより，発生届の内容の違いに気付く ことが出来た．地方衛生研究所が役割を果たすために は，複数の検査法が検討できるよう機器器材を備え，
精度を確保することや，検査法の特性について知識や 技術を組織内で共有するなど人材育成が必要となる．
本事例から，疫学調査を実施する場合は届出内容に先 入観を持たず，喫食調査や行動調査等を含め総合的に 判断することが重要と考える．原因究明を円滑に進め，
公衆衛生上の危害発生を防止するためには，医療機関 や保健所，地方衛生研究所の相互連携を密接にし，迅 速な情報や意見のやり取りができるさらなる協力体制 の確立が求められる．
謝辞：本事例の調査にご尽力していただきました，
さいたま市保健所職員の方々に深謝いたします．
利益相反自己申告：申告すべきものなし 文 献
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Influence of Stx2 Subtype on Bacteriological Identification of Outbreaks of EHEC O157：H- Infections in Saitama City
Kentaro TOMARI１）, Akihiko KAETSU２）, Hiroyuki UENO１）, Yasuo KABURAGI１）, Koji KIKUCHI１）, Sumie KOBORI１）& Motonobu MIYAZAKI１）
1)Saitama City Institute of Health Science and Research,2)Saitama City Health Center
In 2013, two outbreaks of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) occurred in Saitama city. Accord- ing to reports from each of the medical institutions that detected the EHEC isolates, the isolates seemed to differ in their production of Vero Toxin (VT / Shiga Toxin：Stx) since one isolate produced only Stx1 and the other produced both Stx1 and Stx2. However, a patient survey conducted by a public health center re- vealed that common foodstuffs had been consumed in both outbreaks. Because, the two EHEC isolates were newly detected from two people in one patientʼs family, we analyzed the phenotypic and genetic relation- ships among four isolates in total. All the isolates were serotyped as O157：H-, and bothstx1andstx2were detected. Subsequently, all four isolates were shown to have the same pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) banding pattern. The findings suggested that these isolates belonged to the same strain group.
Among these cases, the isolates hadstx2cwhich is one of thestx2subtypes. Reportedly, some cases with the Stx2 subtype can not be detected using conventional tests for toxin. In addition, Stx2 can be overlooked as a result of this limitation of Stx-production tests. Both epidemiological research by public health centers and genetic analysis by prefectural and municipal public health institutes (PHIs) are very important for clarify- ing possible relationships among outbreaks, as in the present cases. Moreover, collaborations and networks among medical institutions, PHIs and public health centers should be further strengthened to prevent the spread of infections.
