節機構 伝 発現調 遺 子 ノ

金沢大 学十 全 医 学 会 雑誌 第¹0 0巷 第4 号 5 8 5M^{6 0 0} く¹9 9 い

サ イ ク リ ッ ク A M P およ びホ ル ポ ^ー ル エ ス テル によ る V a s o a ctive hte st in al Pep tid eノ^{P H M −2 7}

遺 伝 ^{子 の} 発 現 調 節 機 構

一 培養 神経芽腰細胞く^{N B−1} 細胞J ^{を 用い} て の検討 ^一

金 沢 大 学 医学 部 内科 学 第 ^一講 座 は 任^こ小林 健 ^一 鮎 削

大 沢 謙

く平 成3年6月_{1 2 日}受 付1

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Va s o a ctiv e inte stin al _pep tideくV I PJ は， 2 8 ア^{ミ ノ}酸 残 基か ら な る C 末 端が ア ミ ド化さ れ た生_理 性^ペ プ チ ド で あ り， 神経 伝 達 物 質と し て腸 管や， 中枢， およ び末 棺 神 経 系^{な ど}各 種 臓 器の機 能 調 節に関 与し て^いる^． V I P は他の類 似し た^ペプ チ ド P 托M ⁻27 と共^に共 通の前 駆 体^プロ V I PノP 和 仏 2 7 を経て生 合 成さ れ， サ イ ク リッ クア デノ シ ン ^ー リン酸 く^cyclic ade n o sine 3^，，5^，−m O n Opho sphate，CA M Pl は培 養^ヒト 神 経 芽腰細 胞 くN B⁻1 細 掛 ^{に お い}て _， V I PノP 和 仏 2 7 遺 伝子 の転 写 活 性 上 昇を介し て プロ V IPI P 托M ⁻2 7 の生 合 成を増 加さ せ ること が知ら れ て^いる^． 本研 究で は V I PJP H M^．2 7 遺 伝子^の発 現 調 節機 構 を さ ら^に明ら^{か に}す る目 的^でI d ibut m ^TIcA M PくBt 尤A M Pl あ るい は， 1 2⁻0^−tetr ade c a n oyl⁻pho rbol⁻1 3⁻

a c etateくT P AI や pho rboト1 2，1 3⁻dide c a n o ateくP D Dl な どのホルポ ^ー ル エステル によ る V I PJP 王1 M ⁻2 7 遺 伝子発 現 誘 導と そ^の機 序^につき検 討し た^． 1m M Bt2CA M P あ るい は 1 6nM T P A 存 在 下で 9 時 間^の培 養 後， N B⁻1 細 胞^の V rPノP H M−^{2 7 メ ッセ ンジャ ー} R N A くm R N A 巨畳 は そ れ ぞ れ 1 0倍 ある^いは 5 倍^に増 加し た^． 4 0nM P D D で も V I PIP 托M ^．2 7 m R N A 量は 3 倍^の増 加を認め た． Bt 定A M P と T P A の存 在 下^では V 工PIP 壬I M⁻2 7 m R N A 量は約3 8倍と相 乗 的な増 加反応を 示 し た^．細 胞 内cA M P 量^には ホルポ ^ー ルエ ス テ ル によ り有 意の変 化を認め な か^っ た^． 次に種^{々 の}5 ^，側 欠 失 変 異を作 成^{し たヒト V I P}IP E M⁻27 遺 伝子^プ

ロモ ^ー タ ^ー領 域を ch lo r a m phe nic ola c et yltr a n sfe r a s eくC A T l遺 伝子に結 合させた C A T 発現^ベク タ ^ー を 作成し， これ ら を N B⁻1 細 胞^に導入発 現さ せ て Bt4IA M P あ るいは T P A によ る C A T 活 性の発 現 誘 導

の有無を検 討し た^． そ^の結 軋 ^cA M P あ る^い はホ ルポ ^{ー ル エ}ス テ ル によ る遺 伝子発_現に必 要な D N A 領 域 けな わ ち， CA M Pノpho rbole ste r⁻r e SpO n S e ele me nりの5^，I_{末端 部}は． 転 写 開始 点の7 5塩 基 対^上流か ら 93 塩 基対上流^の間^にあ る^こと が明らかと な^った^J N B⁻1 細 胞の核 抽 出 液を 用^いた D Na s eI ^フッ ト プ リン

ティ ング実験， およ び d im ethyls ulfateくD M S ，^フット^{プ リ ン}ティ ング実 験^によ り，V 工PIP H M ⁻2 7遺 伝子 プロモ ^ー タ ^ー 領域^{に は}少な くとも 3 ^つの校 内 国子結 合領域があり． その 1 つ 席 写 開 始 点^の6 9塩 基 対上 流か ら 8 8塩 基 対ヒ 流 ま^{で J}瀾 矧 は， C A T 発 現 ^{ベ ク タ ー} を 剛 ^一た実 験^で認め ら れ た ^cA M Plpho rbol

e ste r⁻r e SPO n S e ele me nt に符 号し た^一 D Na s e I ^フ ットプ リニ テ_T ニノ^{ゲ実 験， あ るいは D M S フットプリ}

ンティ ング実 験で は， 核 抽 出 液^によ り D Na s e I によ る消化^{． LF，J}l^，い烏 D M S によ るメ チ ル化^から保 護 さ れ た領 域と その程 度^に誘導^の有 無で差異が認めら れ なか1 た^一 以 上^直結果 よ り， CA M P およ びホ ル ポ ^{ー ル エ} ス テ ル は V 工P I P In^{r M −27} 遺 伝子^{プ ロ モ}N ^クー^{J，5 ，}側上 狛^こ存 在す る cA M Pノpho rbol

e St_{e r}−^{r e SpO n S e ele m e nt に結 合す る}核 内 因子^に， そ れ ぞ れ 輿 な る修 飾を加え る ことによ っ て V I P I

P 江M ⁻2 7 遺 伝子^の転 写を促 進す ること が ^一 つの可 能性 と して考え 在れ た^．

K ey ^{w o r}ds V I Pノ^{P H M −27} g^{e n e}， Cy^Clic A M P， phoI七01 e ste r_， CA M PIpho沌01

e ste r r e sp^{o n s e e}le m e nt， n u Cle a rfa cto r

V a s o a ctiv e inte stinal_pep tideくV I Pl は，1 9 74年^にブ タ腸 管^から初め^て分離さ れ た2 8 アミ ノ酸 残基から な る C 末端が ア^ミド化さ れ た^ペプ チ ドであ る^{1 1．} V 工P は腸 管ばかりでな く^， 中枢， お よ び末 梢 神 経 系や． 種々の

内 分 泌 腺組 織を含む全 身^の諸 臓 器で の存 在が認め ら れ ており， 神 経伝 達 物質 くn e u r otr an Smi t te rl ^{の 一 つ}と し て各 種 臓 器の機 能 調節^に関 与し て^いる も^のと考え ら れ ている． そ の生理作用 と し て， 血管 拡 張 ^．血 圧 降 下 作 用^のほ かに， 気 管 支 平 滑 筋 弛 緩 作用 ^， 腸 管^から の水 分^．電 解 質 分泌 刺 激 作 用^， イ^{ン ス}リン， グ^ルカ^{ゴ ン，} プ^ロ テ ク テ^ンな どの ホ ル モ ン分 泌 促 進 作用， 生 殖 器^や 脳 血 管の血 流 調 節 作用 な ど が知ら れ て^いる^2，． 1 9 8 3 年，Itbh，O k ^am OtO ら^3一は， ヒト V I P 前 駆 体^およ び そ のメッセ ンジャ ^ー R N A の構 造を決 定し， V I P 前 駆 体

には V 工P 以 外に， N末 端が^{ヒ ス}チ ジ^{ン で}始ま り C 末 端が メ チ オ^ニンで終わ る 2 7 ア ミノ酸 残 基か ら な る新し い ペプ チ ド， P H M⁻2 7 が存在す る^こと を発 見し た^． 加 え て， 1 9 8 5^へ 1 9 8 6年^には B^cdn e r ら^4，， Ts ukada ら^5，，

Ya m aga mi ら^{6 ，}によ^っ て^ヒト V I PIP 托M⁻2 7 遺 伝子の

全構造が決 定さ れ．V 工P の生 合 成 過 程お よ び そ の調 節 機 構を遺 伝^{子 の レベ ルで}検 討す ること が可 能と な ^っ

た^{． 一} 方， 培養^ヒト神 経 芽腰 細 胞の ^{一 つ}である N B⁻1 細 胞で は， サ イ ク リック ア デノ シ ン ^ー リ ^ン酸 くCyClic ade n o sine 3^，，5^，−m O n Opho sphate，CA M Pl ^によ り V IP の生 合 成が誘 導さ れ る^こと が知ら れ て^tlた が^{7 籾}， 1 9 8 4 年 Hayaka w a ら^{9 ，}は cA M P は主^に V I PIP t n 4⁻2 7 遺 伝 子 の転 写を促 進す る^こと^によ^っ て V 工P の生 合 成^を誘

導す ること を明ら か にし た ^． ま た ， 著 者ら^{1 0−川} は

N B^．1 細 胞^では， 腫 瘍プロ モ ^ー タ ^ー で あ る ホ^ルポ ^{ー ル}

エステ^ルも V 貯ノP H M⁻2 7 メッ セ ンジャ ^ー R N A を増 加さ せ る^こと を報 告し た， 本 研 究で は， V I PIP H M ⁻ 2 7 遺 伝子 の発 現 調 節 機 構を明らか にす る目 的^で ，

V I PIP 注 M ⁻2 7 遺 伝子 の プ^{ロ モ ー} タ ^ー 領 域を ク^ロ ラム フェ ニ コ ^ー ルアセ チ^ルト ラ^{ン ス フ エ}ラ ^ー ゼくchlo r a m⁻

p h^{e n}ic ol a c et yltr an Sfe r a s e，C A Tl 遺 伝子^に結 合し た キ メ ラ遺 伝子 を N B⁻1 細 胞に導入 ^．発 現さ せ る遺 伝子導 入実 験， およ び N B⁻1 細 胞の核 蛋 白^の V I PIP H M ⁻2 7 遺 伝子 プ^{ロ モ ー} タ ^ー 領 域^{へ の}結 合を み る D Na s e I フ _ット プ リ^ンティ ング 実 験． あ るい は de m eth_yls ulf⁻

atet^{D M S}l ^{フ ッ}ト プ リ ティ ング 実 験を行^い ， CA M P，

およ び ホ^ルポ ^ー ル エステル によ る誘 導^に関 与す る遺 伝 A b br e viatio n s ニ A P ⁻1 ， a Ctiv ato r p^{r o}tein

子 上^の発 現 調 節 領 域^について検 討し た^． 材 料^およ び方法 I ^． 試 薬 類

特^に会 社 名^の記載ゐな^い各種 制 限 酵 素は宝 酒 造 便 京1 ^の製 品を^， ジ ブ チ リ^{ル C}A M PくN⁶， 0^2，．dibut y^ryl

ade n o sin e 3^，こ5^，−m O n Opho sphate，Bt dIA M Pl は ヤマサ 醤 油 く千 葉1^{， 1 2−0−tetr ade c a n oylpho rbol−1 3−a C etate} くT P Al ^およ び photbol^．1 2，1 3⁻d ide c a n o ate くP D Dl は

C C R 社 くE de n Prai rie，U S Al の製 品を そ れ ぞ れ 用い た^．E ^{a ．3 2P}j ^{d C T P} く比 活 性3 0 0 0 C ilm m oll，仁y⁻

3 2Pコ

A T P く比活 性3 0 0 0 C ilm m oll お よびE^14Cコ^{クロ ラ ム}

フェ ニ コ ^ー ルは^い ずれ も ア^マ シ ャ ム ^． ジャ パ ンく東 京1 か ら購入 し た^{． こ}れ 以外^の試 薬で特^に会 社 名^の記 載^のな^いも の は^いずれ も和 光 純 築 く大 阪1 の製 品を 用 いた．

工工． 細 胞 培 養

培 養^ヒト神経 芽腰 細 胞 株 N B⁻1 細 胞は， 197 3 年^に三

宅ら^{1 2 ，}に よ り樹 立さ れ た細 胞 株で あ る^{． こ の}細胞を非

動化 く5 6^OC ， 3 0ご別 ¹0％ 牛 胎 児 血 清 くG I B C O 社， Ne w

Yo rk， U S Al お よ び 0．00 5％硫 酸カ ナ^マイ^{シ ン}く明治製 菓， 東 刹 を含 有す る R P M 工1 6 4 0 培 地 く日水 製 乳 東 京1 で培 養し た^．

H ^{． ノ ー} ザ^ンくNo rthe r巾 法による R N A 解 析 対 数 増 殖 期^にある N B⁻1 細 胞^に種々 の試 薬く表¹I を 添 加し， 1 ^へ2 4時 間 培 養し た後^に培 地を除 去し， グ ア

ニ ジ^ニ ウムノ塩 化^{セ シ}ウ^ム法^{1 3一に}よ り R N A を抽 出し た^． す な わ ちグア^ニ ジ^ンチ オ^シア^ン酸 溶 液 く⁴M グ ア

ニ ジンチ オシア^ン酸， 0 ^．5％N −^{ラ ウロ イルサル コシ}

ン酸ナ ト リ ウ^ム， 2 5m M ク^エ ン酸ナ ト リ ウ^ムくpH 7 ^．0う， 0 ^．1M 2−^{メルカ プ トエ タ ノ ー ル， 0■1％}

Antifo am AI ^によ り細 胞 を溶 解し， ポ リ ア^{ロ マ ー} チ^{ュ ー} ブ内^で， 5．7 M 塩 化^{セ シウム}液^の上に重層し た の ち，Be ckm a nS W 6 0 T i ^{ロ ー} タ ^ー で 3 5，0 0 0 回転，2 0^OC

で1 6時 間 遠 心し た， 沈 殿し た R N A を^エタノ ^ー ル洗 浄 し た後， 水^に溶 解し た^． 5F^Eg の R N A 試 料を^1■1 M ホ ル ムアルデヒド を含む 1^．5％ア ガ^{ロ ー ス}ゲ^{ル で}泳動 し⁹¹，

ニ ト^{ロ セ ルロ ー ス}膜 B A 8 5 くSch leiche r 8^tSch⁻

u eu 社， Ne w Yo rk，U S AI ^にプ^ロ ッ ト し た後， 8 0^OC で 2 時 間 処理 し固 定し た^． プレ^ハ イ プ リ ダ イ ゼ^{ー ション} は プ^レハ イ プ リ ダ イ ゼ^{ー シ ョン}溶 液 く5 0％^{ホ ル ム}ア^ミ

1 _i A P⁻2， a Ctiv ato r p^{r o}tein 2 _i b_p， b a s e p^{a 甘S}i Btd IA M P ， N ⁶，0 ^お−dibut y^r勇 ^{ad e n o sin e 3，， 5， −m O n O}ph o sph atei ^CA M P_， Cy^Clic ad^{e n o s}in^e 3^，，

5^，−m 皿 Oph o sph atei C A T ， Chlo r a m ph e nic ol a c et yltr an Sfe r a s e三C R E， CA M P r e sp^{o n s e e}le m e nt i c R E B， C R E b in d in _{g p}r otein _ニ D M S_， de m eth_yls ulfate ニ D M S O ， de m eth_yls ulfo xide s D T T，