論文審査結果の要旨

氏 名 山田 知枝 授 与 し た 学 位 博 士 専攻分野の名称 歯 学

学 位 授 与 番 号 博甲第５９４４号 学位授与の日付 平成３１年３月２５日

学位授与の要件 医歯薬学総合研究科機能再生・再建科学専攻

（学位規則第４条第１項該当）

学位論文の題目 BMP-2含有光重合型PDVAで補強したコラーゲンスポンジによる吸収性骨補填材 論 文 審 査 委 員 窪木 拓男 教授 上岡 寛 教授 岡田 正弘 准教授

学位論文内容の要旨

論 文 内 容 の 要 旨 （ 2000字 程 度 ）

【緒言】

骨欠損が生じた場合の骨補填材として自家骨が用いられてきたが，自家骨の採取には外科的侵襲や採取 量の限界があることから，人工骨補填材の開発と骨形成因子との併用が研究されている。アジピン酸ジビ ニル(DVA)の重合体(PDVA)はエステル結合に基づいた架橋構造であり，生体内のエステラーゼにより加 水分解される。加熱重合型PDVAは生分解性を有し，骨補填材として有用であることが確認されている。

BMP—2は骨誘導能を有する蛋白であり，臨床応用に向けて有用な担体の開発が進められているが，高温処 理によって生物学的活性が低下する。本研究の目的は，熱処理を必要としないBMP—2含有光重合型PDVAで 表層を補強したコラーゲンスポンジの吸収性骨補填材としての有用性および骨形成因子BMP—2の担体とし ての可能性を評価することである。

【材料ならびに方法】

DVAには光増感剤としてカンファーキノン(CQ)1.2w/v%，重合促進剤として第3級アミンである4—(ジメチ ルアミノ)安息香酸エチル(EDMAB)4.8w/v%を添加した。直径8mmのコラーゲンスポンジを厚さ2mmにトリ ミングして，D群にはDVA，DB群にはrhBMP—2(10µg/30µLDVA)含有DVAを表面にコーティングし，DVA/コ ラーゲンスポンジ質量比13/2とすることで気孔率70%として，嫌気条件下で180秒間光重合させた。対照群 はコラーゲンスポンジとした。

D群試料の細胞毒性試験にはMC3T3—E1細胞を用い，陽性対照をコラーゲンスポンジ，陰性対象をアクリ ル板として細胞に24時間曝露させた。MTS assayを用いて試料曝露のない細胞の生存率を100%として各試 料の細胞生存率を測定した。骨石灰化試験はPDVAブロック体上でMC3T3—E1細胞を用いて骨分化誘導させ，

アリザリンレッド染色を行った。3点曲げ試験ではコラーゲンスポンジを2×2×25mmにトリミングして，

DVA/コラーゲンスポンジ質量比13/2となるようDVAでコーティングした後，嫌気条件下で180秒間光重合 させた。対照群はトリミングしたコラーゲンスポンジとした。支点間距離20mm，クロスヘッドスピード 0.5mm/minの条件下において最大曲げ応力を計測した。動物埋入試験にはD群，DB群および対照群試料を 用いた。動物は8週齢Wistar系雄性ラット45匹を15匹ずつの3群に分け，麻酔下で各群の試料を頭蓋骨上正中

に位置付けて骨膜と皮膚を縫合した。術後，1，2および4ヶ月後に各群5匹ずつに対して灌流固定を施し，

頭蓋骨ごと試料を採取し，病理組織学的観察ならびにと骨形態計測を行って骨量(BV/TV)%を算出した。統 計学的解析は分散分析の後Tukey法による多重比較，あるいはt検定を行い，有意水準は5%とした。本実験 は岡山大学動物実験委員会の承認を得て行った(OKU—2017021)。

【結果と考察】

細胞生存率はアクリル板では有意に低値を示したが，D 群では有意差を認めず，低毒性であることが示 された。アリザリンレッド染色ではPDVAブロック体試料表面は赤く染色され，石灰化物の沈着が認めら れた。これらの結果から，PDVA 細胞毒性は低く生体内で骨芽細胞が接着し骨再生の足場となる可能性が あることが示唆された。3点曲げ試験ではD群は対照群と比較して有意に高値を示し，コラーゲンスポン ジの物性改善が認められた。また，動物埋入試験においてD群およびDB群試料は4ヶ月後においても骨 膜下で試料の形態を保っていたことから，本研究試料は骨再生の足場としての強度を有することが示され た。動物埋入試験において対照群では新生骨の形成は認められなかったが，D群，DB群では全観察期間に おいて部分的に既存骨表面から試料内部への新生骨の形成が認められ，細胞増殖が可能なサイズの連通孔 構造を有することが示された。骨量(BV/TV)%はD群，DB群ともに1ヶ月後と比較して2ヶ月後および4 ヶ月後において有意に高値を示した。D群では2ヶ月後までは新生骨量は増加したが，その後はほぼ同程 度であった。一方，DB 群の新生骨量は観察期間を通して増加した。D 群と DB 群の新生骨量を比較する と，1ヶ月後および2ヶ月後には有意差を認めなかったが，4ヶ月後にはDB群ではD群より有意に高値 を示した。このことから，DB群試料は動物埋入後に PDVA が徐々に生体内で分解され，それに伴い徐放

されたBMP—2が生物学的活性を示して骨形成を持続したと考えられた。

【結論】

本研究試料のBMP—2含有光重合型PDVAで表層を補強したコラーゲンスポンジは，生体適合性と骨伝導

性およびBMP—2徐放による骨誘導性を示したことから，骨補填材ならびにBMP—2担体として有用であ

る可能性が示唆された。

論文審査結果の要旨

骨 欠 損 が 生 じ た 場 合 の 骨 補 填 材 と し て 自 家 骨 が 用 い ら れ て き た が ， 自 家 骨 の 採 取 に は 外 科 的 侵 襲 や 採 取 量 の 限 界 が あ る こ と か ら ， 人 工 骨 補 填 材 の 開 発 と 骨 形 成 因 子 と の 併 用 が 研 究 さ れ て い る 。 ア ジ ピ ン 酸 ジ ビ ニ ル ( DVA )の 重 合 体 ( PDVA )は エ ス テ ル 結 合 に 基 づ い た 架 橋 構 造 を 呈 し ，生 体 内 の エ ス テ ラ ー ゼ に よ り 加 水 分 解 さ れ る 。加 熱 重 合 型 PDVA は 生 分 解 性 を 有 し ， 骨 補 填 材 と し て 有 用 で あ る こ と が す で に 確 認 さ れ て い る 。 BMP-2 は 骨 誘 導 能 を 有 す る 蛋 白 で あ り ， 臨 床 応 用 に 向 け て 有 用 な 担 体 の 開 発 が 進 め ら れ て い る が ， 高 温 処 理 に よ っ て 生 物 学 的 活 性 が 低 下 す る 。 本 研 究 は ， コ ラ ー ゲ ン ス ポ ン ジ の コ ラ ー ゲ ン 繊 維 を ， 熱 処 理 を 必 要 と し な い BMP-2 含 有 光 重 合 型 PDVA で 補 強 し た 試 料 の 吸 収 性 骨 補 填 材 と し て の 有 効 性 お よ び 骨 形 成 因 子 BMP-2 の 担 体 と し て の 可 能 性 を 検 討 し た も の で あ る 。

本 研 究 に よ っ て 以 下 の 研 究 成 果 が 得 ら れ た 。

1)細 胞 毒 性 試 験 の 結 果 ， 180秒 間 の 光 照 射 で 重 合 し た PDVAで コ ラ ー ゲ ン 繊 維 を コ ー テ ィ ン グ し た 試 料 の 毒 性 は ア ク リ ル 板 よ り も 低 い こ と が 示 さ れ た 。

2)骨 石 灰 化 試 験 の 結 果 ，光 重 合 型 PDVA上 で の 骨 芽 細 胞 の 増 殖 お よ び 石 灰 化 物 の 沈 着 が 観 察 さ れ た 。

3)3点 曲 げ 試 験 の 結 果 ，光 重 合 型 PDVAに よ る コ ラ ー ゲ ン 繊 維 の コ ー テ ィ ン グ に よ っ て 物 性 の 改 善 が 認 め ら れ た 。

4)動 物 埋 入 実 験 の 結 果 ， 試 料 は 骨 再 生 の 足 場 と し て の 強 度 を 有 し ， そ の 連 通 孔 構 造 に よ っ て 試 料 内 へ の 線 維 性 組 織 の 侵 入 と 新 生 骨 の 形 成 が 認 め ら れ た 。 ま た ， 光 重 合 型 PDVA が 生 体 内 で 分 解 さ れ る に 伴 い BMP-2が 徐 放 さ れ ，新 生 骨 の 形 成 を 促 進 し た 可 能 性 が 示 さ れ た 。

上記の結果から，コラーゲン繊維を光重合型 PDVA で補強した試料は，生体適合性と骨伝導性およ

び BMP-2 徐放による骨誘導性を示したことから，骨補填材ならびに BMP-2 の担体として有効である可

能性が示唆された。本論文は，今後の新規骨補填材の開発において新たな知見となりうるものである

と考えられる。よって，審査委員会は本論文に博士（歯学）の学位論文としての価値を認める。