博士（薬学）
学 位 論 文 題 名
ガー リ・ イーヴォ
SV400RIGIN OF REPLICATION ACTIVITY IS INFLUENCED BY
CELLULAR CIS AND TRANS FACTORS
(SV40DNA 複製に関与するCLS ，trans 細胞因子の解析）
NTRODUCTION
学位論文内容の要旨
Cell'proliferation and DNA replication lie at the heart of tumorigenesis, DNA repli cation is a tightl: regulated event in the cell cy.cle and involves multiple protein‑ DNA and protein ‑ protein interactions. Progress in understanding the molecular mecha‑
nisms and the regulation of DNA replication has been made in recent years mainly from the genetic studies of replication in budding years(S. pombe)and the development of a reconstituted simian virus 40 (SV40) DNA replication system. Unfortunately, the exact structures of mammalian origins of replication (ori) remain elusive, as do t.he mechanisms that control the extent of cellular replication and its coordination with transcription and other cellular processes. The SV40 replication system has been a useful model to gain informations about mammalian replication features because of the similarities existing between the SV40 DNA and a mammalian replicon. In tmy work, I have concentrated on the functions of adenine and thymine rich sequences which are a characteristics of many replicating systems, such as papovarious oris yeast ARSs and possibly mammalian origins of replication, but whose functions re‑
main very much obscure
RESULTS AND DISCUSSION
The core sequence of the SV40 0rigin of replication comprises a run of thymine and adenine residues whose sequence and position relative to the rest of the orL core cannot be changed without loss of replication. In this work,I show that copies of AT stretches
added in cis to a functional ori core dramatically reduce replication, probably by creat ing some phisical block. Interestingly, the yeast ori consensus is homologous to the SV 40AT stretch,in viuo,its substitution for an SV40AT stretch does not sustain replica tion,but its presence beside a functional SV40 0ri inhibits replication just like addi‑
tional wild type AT stretches. However, totally unrelated sequences do not affect repli cation. Inhibition of replication seems thus to be supecific to AT ‑ rich sequences
Using crude nuclear extract of CosI cells,I have demonstrated the existence of factor(s) (MW about 50 kDa), named SOAP,that in vitro bind specifically to the SV40AT stretch and to some (but not any) homologous sequences,including the yeast ARS consensus. The same factors recognize both single (T‑rich strand) and double stranded forms of the AT stretch. Binding to single stranded AT stretches can be specifically competed for by the corresponding duplex form (less efficiently uice uersa), which suggest that sequence‑specific binding to duplex and single stranded DNA may involve a single protein. In all cases binding is mediated by a species of 50 kDa, termed SV40 0ri core AT stretch binding protein (SOAP). SOAP appears to be a ubiquitous,abundant nuclear factor,with strong binding affinity. Its binding to the SV40AT stretch and to the yearst ARS consensus correlates ‑with the inhibition of replication presented by the two elements ; moreover, SOAP binding activity reaches a maximum during S phase. These observations strongly suggest that SOAP may be a factor involved in the regulation of replication
So far, mutations in the AT stretch have been found to drastically reduce, and in most cases abolish, replication Nonetheless, the AT stretch has been shown to be the target for several host cellular proteins that belong to the replication machinery ‑in‑
cluding SOAP. I reasoned that,in this light, there might exist cellular DNA sequences that can substitute for the SV40AT stretch. To study this possibility,I digested mam‑
malian genomic DNA and inserted the fragments instead of the SV40AT stretch in a plasmid carrying the SV40 0ri core. To analyzed the pool,I developed a 'replication trap' in CosI cells. I present evidence that there are indeed several mammalian se‑
quences that can substitute for the SV40AT stretch. All of them are rich in adnines and thymines but,surprisingly, these sequences differ from the wild type SV40AT
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stretch to such extent that at first sight they would seem unlikely to replicate. This is all the more impressive if one considers that another AT‑rich sequence from the yeast TRPl gene (which includes an ARS), which also carries a similar varia‑
tion, cannot substitute for the SVR40AT stretch
Among several functional variants,one carried an elemet that was previously shown to be an essential part of a mammalian putative origin of replication located upstream from the human c‑myc gene. Interestingly,SOAP presents many features in common with MSSP ‑ 1, a human factor that recognizes sequence‑specifically this myc upstream element, and which apears to interact with the c‑myc protein it‑
self. The most striking features are : The two proteins recognize each other's cognate sequences, and the activities of both proteins during cell cycle coincide (maximum in the S phase). These observations strongly suggest that SOAP and MSSP‑ 1 may be related fctors. If proven correct, the SOAP/MSSP‑1 binay could provide a very inter‑
esting connection between the SV40 replication system and mammalian origins of replication. To investigate this matter,I have established an empirical protocol for the purification of SOAP from animal tissues (pork liver). In future,following this proto‑
col,it shall be possible to isolate SOAP from human tumoral cells (e.g.Raji) and from human normal tissues (placenta). Besides the identity of this factor,it shall be very interesting to determine any differences between SOAP from tumoral and normal
cells
学位論文審査の要旨 主査
副査 副査 副査
教授 教授 教授 助教授
有 賀 寛 芳 大 塚 栄 子 横 沢 英 良 近 藤 博 之
本 学 位 論 文申 請 者 は 博 士 課程 に お い て 動物 ウ イ ル スSV40のDNA複 製 に 関す る 研 究 を 行っ て
お り ， 今 回 ウ イ ル スDNA上 の 機能 部 位 と そ こに 結 合 す る 細胞 因 子 に 関 す る研 究 を ま と め学 位 論 文とし て提出 した。
SV40DNAは 動 物 細胞 遺 伝 子 の ー っの レ プ リ コ ンに 相 当 し ， 多く の 研 究 が 成さ れ て き た 。 複 製 に 必 須 な領 域 と し てori coreと 隣 接 するAT richな 領域 の65塩基 対が 既に明 らかに されて い る 。ori coreに は ウ イ ル スタ ン パク 質であ るT抗原が 結合 し開始 のシグ ナルを 与え る。AT rich 配 列 は 複 製に 必 須 で あ るこ と の 他は 機能は 不明 であり ，また この配 列にも 何等 かのタ ンパク 質 が 結合し 機能す ると考 えら れるが 詳細は 全く不 明の ままで ある。
本 論 文の 第 一 章 で はま ず こ のAT rich配 列 の 性 格 を詳 細に 検討し た。 一般に 転写調 節配列 な ど は そ の 配列 を 複 数 個 連結 し た 場 合 活 性が 増 強 さ れ る。 しかし なが らAT rich配列 はその 数に 反 比例し て活性 の低下 が見 られ， かっ順 方向に 位置 した場 合のみ 機能し た。そ こで 申請者はこれ をnegative synergismと 名 づ け た 。 すな わ ち 数 を 増や す こ と に より ， こ こ では クロマ チン の 1夕 ー ン 毎増 加させ てい るが， 複製開 始領域 の構 造変化 が誘起 される 可能性 を示 してい る。次 に SV40AT rich配 列 と 類 似 の パ ン 酵 母 の 自 律 増 殖 配 列ARSをAT rich配 列 と 交 換 し た と こ ろ 複 製 活 性 を示 さなか った。 これは 次のAT rich配 列結 合夕ン パク質 で重要 な意味 を持 ってく る。
次 に 申 請 者 は このAT rich配 列 に結 合 す る 細 胞タ ン パ ク 質 の解 析 を 行 っ た。2本 鎖 及 び1本 鎖 のAT rich配 列 に は 塩 基 配 列 特 異的 に 分 子 量50Kの タ ン パク 質 が 結 合 する こ と が サ ルCosI 細 胞 核 抽 出 液 を 用 い て 調 べ ら れ た 。1本 鎖 がDNAプ ロ ー ブ が2本 鎖DNAに よ り50K夕 ン パ ク 質 の 結 合 が 阻 害 され る こ と に よ り，2本 鎖 ，1本 鎖AT rich結合 夕 ン パ ク 質は 同 一 の も の と 考 えられ る。
第2章 に お い て は こ の50Kタ ン パ ク質 ，SOAPと 命 名 ， を 更に 解 析 し て いる 。SOAPは サ ル ， ヒ ト，マ ウスナ ょど殆 ど全 ての細 胞に普 遍的に存在するタンパク質であり，また細胞の種類を聞わ ず 存 在 す る 。 前 述 の 酵 母 のARS配 列 はDNA複 製 活 性 は 存 在 し な か っ た がSOAPは 結 合 し ， コ ン ト ラ ス 卜 を 示 し た 。 勿 論 今 ま で に こ の タ ン パ ク 質 の 存 在 は 報 告 さ れ て い な い 。 第3章 に お い て は ，SV40AT rich配 列 と 機 能 交 換 で き る 細 胞DNAの 検 索 を 行っ た 。 今 ま で の こ のAT rich配 列 に 変 異 を 導 入 す る と 全 てDNA複 製 活 性 は 失 わ れ て い る 。 申 請 者 はori core，AT rich配 列 を 含 む テ ス 卜 プ ラ ス ミ ド 内 にAT rich配列 を 細 胞DNAと 交 換 さ せ， サ ル CosI細 胞 でSV40DNA複 製 の 起 こる ク ロ て ン をク 口 ー ニ ン グ した 。 得 ら れ た約10種 類 のク 口 ー ン を 解 析 した と こ ろ ， 全てorl coreに隣接 してAT配列が 存在す る200―300塩基 対の挿 入であ っ た 。 こ う した 配 列 が 単 離さ れ た の は 初 めて で あ る 。 この 配 列 のconsensus sequenceを 調べ る と 次 章 のc―myc遺 伝 子 上 のDNA複 製 開 始 ／ 転 写 工 ン ハ ン サ 一 必 須 配 列TCTCTTAを 含 ん で
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お り ， 現 実 に こ の 配 列 をAT rich配 列 と 交 換 し た も の は 複 製 活 性 を 示 し た 。 第4章 で は 第3章 の 結 果 に 基 づ きc―myc TCTCTTA配列 とSOAPと の 関連 を検 討し た。
当研 究 室で はす でに このTCTCTTA配 列に 結合 する タン パ ク質 とし てMSSP一1を同 定し，
そのcDNAを クロ ーニ ング し てい る。 そこ で申 請 者はSV40AT rich配列 ，c―myc TCTCT‑
TA配 列 を相 互に プ口 ーブ ， コン ペテ ィタ ーと し て競 合実 験を 行 い， またMSSP−1はRNA レベ ル ではGl→S期 に発現 し，タンパク質レベルではS期でピークを迎えるがSOAPも全く 同様であることから，両者は全く同一のものかまたは極めて類似のタンパク質であることを明か にし た 。こ のこ とfま SOAP，MSSP―1の 機能 を考える 上で極めて重要な知見とい える。
更に第5章におい てはSOAPの精製を行った。ま ず材料の入手が容易なブ夕肝臓より3っの カラ工．ク口マトグラフィーを行い2っのタンパク質を精製する方法論を確立した。この両者とも SV40AT rich配列に 結合能を示しSOAPと考えられ る。今後はサルまたはヒト 細胞よりこの 方法でSOAPの精製を行う予定である。
本論文の成果は既に国際的科学雑誌に2報掲載され，その続報も現在準備中である。また関連 論文もすでに8報を数える。
以上のように，本論文はSV40及び細胞DNA複製開始機構に関し多くの新知見を含んでおり，
博士（薬学）の学位を与えるにふさわしいものと判断した。
