炎症におけるシクロオキシゲナーゼ-2の役割とその選択的阻害薬の有用性-ラットのカラゲニン胸膜炎モデルを用いた解析

炎症におけるシクロオキシゲナーゼ-2の役割とその

選択的阻害薬の有用性-ラットのカラゲニン胸膜炎

モデルを用いた解析

著者

山村 桂子

号

480

発行年

2004

URL

http://hdl.handle.net/10097/15478

氏

名(本

籍)

学 位

の 種 類

学 位 記 番 号

学 位 授 与 年 月 日

学 位 授 与 の 要 件

山

村

桂

子

博

士(薬

学)

薬

第480号

平

成16年9月3日

学 位 規 則 第4条

第2項

該 当

学 位 論 文 題 目

炎 症 にお け る シ ク ロ オ キ シゲ ナ ーゼー2の 役 割 と

そ の選 択 的 阻 害 薬 の有 用 性

一 ラ ッ トの カ ラゲ ニ ン胸 膜 炎 モ デ ル を用 い た解 析一

論 文 審 査 委 員

(主

査)教

授

大

内

和

雄

教

授

永

沼

章

教

授

大

島

吉

輝

論 文 内 容 要 旨

シ ク ロ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ(COX)は 、 プ ロ ス タ グ ラ ン ジ ン(PG)生 合 成 過 程 に お い て 鍵 と な る 酵 素 で あ る 。 細 胞 に何 ら か の 刺 激 が 加 わ る と ホ ス ホ リパ ー ゼA2(PLA2)が 活 性 化 さ れ 、 細 胞 膜 の リ ン 脂 質 か ら ア ラ キ ド

ン酸 が 切 り 出 さ れ る。COXは 切 り出 さ れ た ア ラ キ ドン 酸 を基 質 と し、 各 種PGの 中 間 体 で あ るPGG、 お よ びPGH2を 生 成 す る 。PGG2を 経 て 生 成 さ れ たPGH,は 、 各 細 胞 の 持 つ そ れ ぞ れ のPG合 成 酵 素 に よ り各 PGに 変 換 さ れ る 。 現 在 、COX遺 伝 子 に は 、COX-1遺 伝 子 お よ びCOX-2遺 伝 子 の2種 類 が あ る こ と が 明 ら か に さ れ て い る 。COX-1は ほ と ん ど全 て の 細 胞 に 構 成 的 に 発 現 し、 細 胞 の 生 理 機 能 の 調 節 に か か わ る PGを 生 成 す るhousekeeping遺 伝 子 産 物 で あ る。 一 方 のCOX-2は 、 成 長 因 子 、 サ イ トカ イ ンお よ び そ の 他 の 炎 症 性 メ デ ィ エ ー タ ー に よ っ て 炎 症 時 に発 現 誘 導 さ れ 、 炎 症 の 場 に お い て 重 要 な 役 割 を 果 た して い る と

さ れ て い る 。 しか し、COX-2発 現 細 胞 に は 常 にCOX-1も 発 現 して お り 、 産 生 さ れ たPGはCOX-1あ る い はCOX-2の い ず れ を 介 して 産 生 さ れ た も の か 明 ら か で な い た め 、 炎 症 反 応 に 関 与 す るPGとCOX-2と の 関 係 は 必 ず し も 明 確 で は な い 。 更 に 、COX-2は 炎 症 の 進 展 過 程 だ け で は な く、 炎 症 の 修 復 過 程 に お い て も重 要 な 役 割 を 果 た し て い る こ と も 示 唆 さ れ て い る 。 そ こ で 、 本 研 究 で は 、 急 性 炎 症 モ デ ル で あ る ラ ッ ト の カ ラ ゲ ニ ン胸 膜 炎 モ デ ル を 用 い て 、 炎 症 の 進 展 お よ び 修 復 過 程 の 双 方 に 焦 点 を あ て 、COX-2の 役 割 に つ い て 解 析 した 。 第1章 ラ ッ トの カ ラ ゲ ニ ン胸 膜 炎 モ デ ル に お け る 炎 症 反 応 の 解 析 カ ラ ゲ ニ ン胸 膜 炎 に お け る 炎 症 反 応 と プ ロ ス タ ノ イ ドお よ びCOX-!、COX-2の 関 与 に つ い て 解 析 し た 。 胸 腔 内 に 貯 留 した 滲 出 液 量 お よ び 静 脈 内 に 注 射 し た 色 素 の 胸 腔 内 へ の 漏 出 量 か ら 血 管 透 過 性 反 応 を 調 べ た 。 ま た 、 滲 出 液 中 のPGE2、 トロ ン ボ キ サ ン(TX)B2お よ び6-keto-PGF1、 の レ ベ ル の 経 時 変 化 を 調 べ る と 共 に 、 滲 出 液 中 に浸 潤 した 白 血 球 に お け るCOX-1お よ びCOX-2の 発 現 を 調 べ た 。 そ の 結 果 、 滲 出 液 中 の 各 プ ロ ス タ ノ イ ドの レベ ル は 、 血 管 透 過 性 反 応 が 充 進 して い る 炎 症 初 期 に ほ ぼ 一 致 して 高 値 を示 し た 。 ま た 、 浸 潤 白 血 球 中 のCOX-1は 炎 症 の 経 過 を 通 して 検 出 さ れ 、 そ の 発 現 レ ベ ル に 明 ら か な 変 化 は 認 め られ な か っ た 。 一 方 、COX-2は 炎 症 の 初 期(炎 症 惹 起3∼7時 間)に お い て の み 検 出 さ れ た 。 こ の よ う に 、 血 管 透 過 駐 反 応 が 充 進 して い る 時 期 に 一 致 し て 滲 出 液 中 の プ ロ ス タ ノ イ ドの レベ ル が 高 く、 同 時 に 浸 潤 白 血 球 中 にCOX-2が 検 出 さ れ た 。 こ れ ら の 結 果 か ら、 カ ラ ゲ ニ ン胸 膜 炎 に お い て は 、..COX-2を 介 して 産 生 さ れ た プ ロ ス タ ノ イ ドが 血 漿 滲 出 に 関 わ っ て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 第2章 ラ ッ トの カ ラ ゲ ニ ン 胸 膜 炎 急 性 期 に お け るCOX-2阻 害 薬 の 効 果

まず 、5種 類 のCOX阻 害 薬 のCOX-1お よ びCOX-2に 対 す る 阻 害 活 性 に つ い てfηvf孟roの 実 験 系 で 検 討 し た 。 そ の 結 果 、IC5。値 で 比 較 す る と イ ン ドメ タ シ ン はCOX-2よ り もCOX-1を 約2倍 強 く阻 害 し、 ピ ロ キ シ カ ム は い ず れ に 対 し て も 同 程 度 の 阻 害 作 用 を 示 した 。 一 方 、 メ ロ キ シ カ ム は 、COX-1よ り もCOX-2を 約12倍 強 く阻 害 し 、 ニ メ ス リ ドお よ びNS-398はCOX-2に 対 して さ ら に 強 い 選 択 性 を 示 し、COX-1に 対 し

て は ほ と ん ど 阻 害 作 用 を示 さ な か っ た 。 そ こ で 、 こ れ ら5種 類 のCOX阻 害 薬 の う ちNS-398、 メ ロ キ シ カ ム 、 ピ ロ キ シ カ ム とCOX-1に 対 して 選 択 的 阻 害 作 用 を 持 つ ア ス ピ リ ン を 用 い 、 カ ラ ゲ ニ ン胸 膜 炎 に お け る 抗 炎 症 作 用 と 滲 出 液 中 の プ ロ ス タ ノ イ ド レ ベ ル と の 関 係 に つ い て 検 討 し た 。 そ の 結 果 、COX-1お よ び COX-2に 対 す る 選 択 性 の 違 い に も拘 わ ら ず 、 い ず れ の 薬 物 も投 与 量 の 違 い は あ る も の の カ ラ ゲ ニ ン 胸 膜 炎 を 惹 起 して5時 間 後 に お け る 滲 出 液 量 お よ び 血 管 透 過 性 反 応 を 同 程 度 に 低 下 さ せ た 。 一 方 、 各 プ ロ ス タ ノ イ ド レ ベ ル に対 して は 薬 物 間 に差 が み ら れ 、PGE2レ ベ ル に 対 し て は 、 い ず れ の 薬 物 も ほ ぼ 同 程 度 に低 下 させ た が 、TXB2お よ び6-keto-PGF1、 レベ ル に 対 して は 、 メ ロ キ シ カ ム 、 ピ ロ キ シ カ ム お よ び ア ス ピ リ ン は 低 下 さ せ た が 、COX-2特 異 性 の 高 いNS-398の 作 用 は 、 他 の・3者 と比 較 して 明 ら か に 弱 い 作 用 で あ っ た 。 以 上 の 結 果 か ら 、 カ ラ ゲ ニ ン 胸 膜 炎 モ デ ル で は 、 滲 出 液 中 の プ ロ ス タ ノ イ ドの 中 で 主 と してPGE、 がCOX-2を 介 し て 産 生 さ れ る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 第3章COX-2阻 害 薬 の1η 卿oに お け る 特 異 性 ラ ッ トの 胃 に お け るPGE2産 生 お よ び 胃粘 膜 傷 害 作 用 に対 す るCOX阻 害 薬 の 効 果 を検 討 し た 。 ラ ッ ト の 胃 内 腔 に 高 張(1M)食 塩 液 を注 入 す る と 、COX-1由 来 と さ れ るPGE、 の 産 生 が 時 間 依 存 的 に 増 加 した 。 こ のPGE2産 生 の 増 加 は 、COX-2に 対 して 選 択 性 を 有 す る ニ メ ス リ ドお よ び メ ロ キ シ カ ム に よ っ て 抑 制 さ れ な か っ た 。 一 方 、 選 択 性 の な い ピ ロ キ シ カ ム はPGE2産 生 を 強 く抑 制 した 。 こ れ ら の 結 果 か ら、1ηvf孟ro で 見 られ たCOX阻 害 薬 のCOX-1お よ びCOX-2に 対 す る選 択 性 の 違 い はfηvfyoに お い て も反 映 さ れ る こ

とが 示 唆 さ れ た 。 更 に 、 メ ロ ギ シ カ ム 、 ピ ロ キ シ カ ム あ る い は イ ン ドメ タ シ ン を ラ ッ トに 単 回 経 口 投 与 し た 場 合 の 胃粘 膜 傷 害 の 発 生 を 検:討 し、 メ ロ キ シ カ ム は 、 ピ ロ キ シ カ ム に 比 べ て 胃 粘 膜 傷 害 作 用 が 弱 い こ と を 示 し た 。 従 っ て 、COX-2に 対 し て 選 択 性 を 示 す 薬 物 は 抗 炎 症 作 用 と副 作 用 の 胃 粘 膜 傷 害 作 用 と が 分 離 さ れ た 有 用 な 抗 炎 症 薬 に な る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 ま た 、 滲 出 液 中 に 検 出 さ れ る プ ロ ス タ ノ イ ドの 中 で 、 PGE2が 血 漿 滲 出 に 最 も大 き く関 与 して い る こ とが 推 測 さ れ た(第2章)が 、TXB2や6-keto-PGF1。 の 関 与 も否 定 で き な い た め 、COX-2阻 害 薬 を投 与 した 場 合 の 滲 出 液 中 の 各 プ ロ ス タ ノ イ ド レベ ル と血 管 透 過 性 反 応 との 相 関 に つ い て 解 析 し た 。 そ の 結 果 、PGE2レ ベ ル の み が 血 管 透 過 性 反 応 と有 意 な 相 関 を示 し た こ とか ら、 カ ラ ゲ ニ ン胸 膜 炎 に お け る 血 漿 滲 出 に は 、 プ ロ ス タ ノ イ ドの 中 でPGE、 が 最 も 大 き く関 与 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。 第4章 ラ ッ トの カ ラ ゲ ニ ン胸 膜 炎 急 性 期 に お け る デ キ サ メ タ ゾ ン の 効 果 ス テ ロ イ ド性 抗 炎 症 薬 で あ る デ キ サ メ タ ゾ ン を用 い て 、 カ ラ ゲ ニ ン胸 膜 炎 に お け る 抗 炎 症 作 用(滲 出 液 量 、 血 管 透 過 性 反 応 、 滲 出 液 中 の プ ロ ス タ ノ イ ド レベ ル 、 お よ び 胸 腔 内 へ の 好 中 球 お よび 単 核 球 の 浸 潤 に 対 す る作 用)を 調 べ 、 同 時 にCOX-2の 発 現 お よ びPLA、 活 性 に対 す る 作 用 を検 討 し、 ス テ ロ イ ド性 抗 炎 症 薬 の 抗 炎 症 作 用 機 序 を 明 らか に す る こ と を 試 み た 。 そ の 結 果 、 デ キ サ メ タ ゾ ン はCOX-2の 発 現 を 高 用 量 で の み 低 下 させ た 。 ま た 、PLA2活 性 は 、 高 用 量 の デ キ サ メ タ ゾ ン に よ っ て も影 響 さ れ な か っ た 。COX-2 の 発 現 お よ びPLA2活 性 に は 影 響 し な い 低 用 量 の デ キ サ メ タ ゾ ン に よ っ て 滲 出 液 量 、 血 管 透 過 性 反 応 お よ _79_

び プ ロ ス タ ノ イ ドレ ベ ル は 低 下 し、 こ の と き浸 潤 好 中 球 数 も有 意 に 減 少 した 。 以 上 の 結 果 か ら 、 デ キ サ メ タ ゾ ン の プ ロ ス タ ノ イ ド レベ ル 低 下 作 用 お よ び 血 漿 滲 出 抑 制 作 用 は 、 炎 症 部 位 に お け るCOX-2発 現 と も PLA,活 性 と も相 関 しな い こ と が 示 唆 さ れ た 。 デ キ サ メ タ ゾ ン の プ ロ ス タ ノ イ ド レベ ル 低 下 作 用 は 炎 症 部 位 へ の 白 血 球 浸 潤 の 抑 制 に よ る こ と 、 ま た 、 デ キ サ メ タ ゾ ン の 血 漿 滲 出 抑 制 作 用 に は 、 白 血 球 浸 潤 抑 制 を 介 した プ ロ ス タ ノ イ ド産 生 抑 制 に よ る も の の ほ か 、 そ れ 以 外 の 機 序 も 関 与 し て い る 可 能 性 を示 唆 し た 。 第5章 ラ ッ トの カ ラ ゲ ニ ン胸 膜 炎 後 期 に お け るCOX-2の 役 割 カ ラ ゲ ニ ン胸 膜 炎 後 期 の 壁 側 胸 膜 か ら細 胞 を 採 取 し 、COX-2の 発 現 を 調 べ た 結 果 、 カ ラ ゲ ニ ン溶 液 を 注 射 し て12∼24時 間 後 の 中 皮 細 胞 にCOX-2の 強 い 発 現 が 見 ら れ た 。 ま た 、 カ ラ ゲ ニ ン胸 膜 炎 を 惹 起 し て14時 間 後 の 滲 出 液 中 に は 、PGE2、TXB2お よ び6-keto-PGF1。 が 検 出 さ れ た が 、6-keto-PGF1、 レベ ル は 他

に比 べ て 明 らか に 高 値 で あ っ た 。こ れ ら の プ ロ ス タ ノ イ ド レベ ル は い ず れ も ア ス ピ リ ン に よ っ て 低 下 し た 。 一 方_{、6-keto-PGE.レ ベ ル は 、NS-398お よ び ニ メ ス リ ドに よ っ て 有 意 に低 下 し た が 、TXB、 レベ ル は 変 化} せ ず 、PGE2レ ベ ル もNS-398に よ っ て 低 下 し な か っ た 。更 に 、 カ ラ ゲ ニ ン胸 膜 炎 を 惹 起 して24時 間 後 に は 、 胸 膜 の 明 ら か な 肥 厚 が 認 め ら れ 、 こ の 胸 膜 の 肥 厚 は ニ メ ス リ ドに よ り抑 制 さ れ た 。 以 上 の 結 果 か ら、 炎 症 の 後 期 に 中 皮 細 胞 に 発 現 し たCOX-2はPGI,産 生 を 介 して 胸 膜 の 増 生 肥 厚 に 関 与 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 胸 膜 の 肥 厚 は 炎 症 の 修 復 過 程 の 丁 環 と考 え ら れ 、 カ ラ ゲ ニ ン胸 膜 炎 に お い て もCOX-2が 炎 症 の 修 復 過 程 に 関 与 して い る こ とが 示 唆 さ れ た 。 .ズ 本 研 究 で は 、 ラ ッ トの カ ラ ゲ ニ ン胸 膜 炎 モ デ ル を 活 用 し、 炎 症 に お け るCOX-2の 役 割 と そ の 選 択 的 阻 害 薬 の 有 用 性 に つ い て 検:討 した 。 そ の 結 果 、COX-2は 炎 症 初 期 に お け る 血 漿 滲 出 にPGE2産 生 を 介 して 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る こ と を 示 唆 し た 。 一 方 、COX-2は 炎 症 の 修 復 過 程 に も 関 与 し て お り 、COX-2を 介 し て 産 生 さ れ るPGI、 が 胸 膜 の 肥 厚 に 関 与 し て い る 可 能 性 を示 し た 。 こ の よ う に 、COX-2は 炎 症 急 性 期 と後 期 で 、 そ れ ぞ れ 炎 症 の 進 展 と修 復 に 関 与 し、 二 面 性 を有 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。 ま た 、COX-2 を 選 択 的 に 阻 害 す る 薬 物 は 主 作 用 の 抗 炎 症 作 用 と副 作 用 の 胃 粘 膜 傷 害 作 用 とが 分 離 さ れ た 有 用 な 抗 炎 症 薬 に な る 可 能 性 を示 し た 。 一80一

審 査 結 果 の 要 旨

シ ク ロ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ(COX)に はCOX-!お よ びCOX-2の2種 類 の ア イ ソ フ ォ ー ム が 存 在 す る 。 COX-1は ほ と ん ど全 て の 細 胞 に構 成 的 に 発 現 し 、 細 胞 の 生 理 機 能 の 調 節 に か か わ る プ ロ ス タ グ ラ ン ジ ン

(PG)の 合 成 に 関 与 して い る 。 一 方 のCOX-2は 、 起 炎 性 メ デ ィ エ ー タ ー に よ っ て 炎 症 部 位 の 細 胞 に発 現 誘 導 さ れ 、COX-2を 介 し て 産 生 さ れ るPGが 炎 症 の 場 に お い て 重 要 な 役 割 を 果 た して い る と さ れ て い る 。

しか し、COX-2を 発 現 す る 細 胞 に は 常 にCOX-1が 存 在 して お り 、 産 生 さ れ たPGはCOX-1あ る い は COX-2の い ず れ を 介 して 産 生 さ れ た もの か 明 ら か で は な い た め 、 炎 症 反 応 に 関 与 す るPGとCOX-2と の 関 係 は 必 ず し も明 確 で は な い 。 そ こ で 本 研 究 で は 、 ラ ッ トの カ ラ ゲ ニ ン胸 膜 炎 モ デ ル を 活 用 し て 、 炎 症 の 進 展 お よ び修 復 過 程 の 双 方 に 焦 点 を あ てCOX-2の 役 割 に つ い て 解 析 し た 。 まず 、 カ ラ ゲ ニ ン胸 膜 炎 に お け る 炎 症 反 応 とPGな ら び にCOX-1お よ びCOX-2の 関 与 に つ い て 解 析 し た 。 す な わ ち 、 血 管 透 過 性 反 応 が 充 進 し て い る 時 期 に 一 致 して 滲 出 液 中 のPGE2、TXB2お よ び6-keto-PG FI、の レベ ル が 高 い こ と 、 お よ び 浸 潤 白 血 球 中 に はCOX-2が 誘 導 さ れ て い る こ と を示 し、 本 モ デ ル に お け る 血 漿 滲 出 に は 、COX-2を 介 して 産 生 さ れ るPGが 関 わ っ て い る 可 能 性 を 示 唆 し た 。 次 に 、COX-2選 択 的 阻 害 薬 を 投 与 す る こ と に よ り血 漿 滲 出 が 抑 制 さ れPGE2レ ベ ル の み が 低 下 す る こ と を 示 した 。 ま た 、 各 種 のPGの レ ベ ル の 中 でPGE2の レベ ル だ け が 血 管 透 過 性 反 応 と有 意 な 相 関 関 係 が あ る こ と を 明 らか に し、 本 モ デ ル に お け る 血 漿 滲 出 に は 滲 出 液 中.のPGの 中 でPGE2が 最 も大 き く関 与 し て い る 可 能 性 を示 した 。 ま た 、 ラ ッ トにCOX阻 害 薬 を経 口 投 与 す る こ と に よ り、COX-2に 対 して 選 択 性 を 示 す 阻 害 薬 は 選 択 性 を持 た な い 阻 害 薬 に 比 べ て 胃 粘 膜 傷 害 作 用 が 弱 い こ と を示 し、COX-2選 択 的 阻 害 薬 は 抗 炎 症 作 用 と副 作 用 で あ る 胃 粘 膜 傷 害 作 用 とが 分 離 さ れ た 有 用 な 抗 炎 症 薬 に な る 可 能 性 を 示 した 。 さ ら に 、ス テ ロ イ ド性 抗 炎 症 薬 で あ る デ キ サ メ タ ゾ ン の カ ラ ゲ ニ ン胸 膜 炎 に お け る 抗 炎 症 効 果 を 検 討 し、 低 用 量 の デ キ サ メ タ ゾ ン は 浸 潤 白血 球 中 に お け るCOX-2の 発 現 に もPLA2活 性 に も影 響 せ ず 、 胸 腔 内 へ の 白 血 球 の 浸 潤 を抑 制 す る こ と に よ っ てPGE、 の レ ベ ル を低 下 させ 、 血 漿 滲 出 を抑 制 す る 可 能 性 を 示 し た 。 最 後 に 、 カ ラ ゲ ニ ン胸 膜 炎 後 期 相 に お い てCOX-2が 中 皮 細 胞 に 発 現 し て い る こ と、 お よ びCOX-2を 介 し て 産 生 さ れ るPGI、(安 定 代 謝 物 で あ る6-keto-PGFI、 と して 測 定)が 胸 膜 の 肥 厚 に 関 与 し て い る 可 能 性 を 示 し た 。 胸 膜 の 肥 厚 は 炎 症 の 修 復 過 程 の 一 環 と 考 え ら れ る こ と か ら 、 本 モ デ ル に お い てCOX-2が 炎 症 の 修 復 過 程 に 関 与 して い る こ と を 示 唆 した 。 以 上 、 本 研 究 で は 、 ラ ッ トの カ ラ ゲ ニ ン胸 膜 炎 モ デ ル を 用 い て 、COX-2が 炎 症 急 性 期 と後 期 に お い て そ れ ぞ れ 炎 症 の 進 展 と修 復 に 関 与 し て い る こ と、 お よ びCOX-2選 択 的 阻 害 薬 の 抗 炎 症 薬 と して の 有 用 性 に つ い て 明 らか に し た 。 以 上 の 一 連 の研 究 成 果 に よ り、 本 論 文 は 博 士(薬 学)の 学 位 論 文 と し て 合 格 と認 め る 。 一81一