+TGGC

同 町

TGGCTGGC

^{問 国}

a a

^傭

TGGCTGGCTGGCTGGC

^{駒 山}

図 ふ

5

lacI遺伝子上に生じる

TGGC

変異

41 

•••••••••• ••••••••• ••••••••• ••••••• •••

@ ^@ @ 

@ 

@ 

@ 

@ 

@翠塁語

A 

1100 

& 

1000  600  800 

@ 

400 

•

@ 

200 

@ 

‑50 

. . . . & . . . . . . . .  

••••••••••••• ^{. .} ••••••• ^{. . 窃} ••• ^.

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@傘書量@怒翠罫言語@翠傘.. 摩翠

B 

1100 

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@傘傘言語 感iI!I . 

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800  600 

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•

."8

^語言

400  200 

••

‑50 

lacI遺伝子上に検出された突然変異。 (A)未処理群で検出された変異 の分布図。 (B)グリオキサール処理群で検出された変異の分布図。

図4・6に検出された突然変異の lacI遺伝子上の分布を示した。変異の種類に ある lつの突然変異を 1つの点で表わしている。未処理群及びグリ 図

4‑6

関係なく、

オキサール処理群ともに、

630

番目付近の位置に変異のホットスポットが観察 このホットスポットの変異は全て TGGC変異を表わしているo いずれ の場合にも、他の位置にはホットスポットは観察されず、変異は lacI遺伝子ょ にほぼ均一に分布している。すなわち、 lacI遺伝子上に生じた塩基置換変異にお された。

いては変異のホットスポットが観察されなかった(図 4・7)0 

ひ3 寸4

5 ・ー町一GACACCAT CGAATGGCGC AAAACCTTTC GCGGTATGGC ATGATAGCGC CCGGAAGAGA GTCAATTCAGGGTGGTGAAT  30 

T  G 

C 

GTGAAACCAG TAACGTTATA CGATGTCGCA GAGTATGCCG GTGTCTCT~A TCAGACCGTT TCCCGCGTGG TGAACCAGGC CAGCCACGTT TCTGCGAAAA  130 

f j

，  T  AA  T 

AT  A 

CGCGGGAAAA AGTGGAAGCG GCGATGGCGG AGCTGAAT~A CATTCCCAAC CGCGTGGCAC AACAACTGGC GGsCAAACAG TCGTTGCTGA TTGGCGTTGC A  230 

/::，.  C  T  T  ‑‑Z;:‑ C 

CACCTCCAGT CTGGCCCTGC ACGCGCCGTC GCAAATTGTC GCGGCGATTA AATCTCGCGC CGATCAACTG GGTGCCAGCG TGGTGGTGTC GATGGTAGAA  330 

C  A  A 

CGAAGCGGCG TCGAAGCCTG TAAAGCGGCG GTGCACAATC TTCTCGCGCA ACGCGTCAGT GGGCTGATCA TTAACTATCC GCTGGATGAC CAGGATGCCA  430 

E 

G 

E 

TTGCTGTGGA AGCTGCCT~C ACTAATGTTC CGGAGTTATT TCTTGATGTC TCTGACCAGA CACCCATCAA CAGTATTATT TTCTCCCATG AAGACGGTAC  530 

T  623 

GCGACTGGGC GTGGAGCATC TGGTCGCATT GGGTCACCAG CAAATCGCGC TGTTAGCGGG CCCATTAAGT TCTGTCTOGG CGCGTCTGCG TCTGGCTGGC  630 

/::"A  平石

+G 

634  T 

TGGCATAAAT ATCTCACTCG CAATC山 町 CAGecGMAG CGFCGGGA AGiCGACTGG AGT2CCAm ccGSTmCAACAMeCATG CAAATGCTGA  730  λ 

ATGAGGGCAT CGTTCCCACT GCGATGCTGG TTGCCAACGA TCAGATGGCG CTGGGCGCAA TGCGCGCCAT TACCGAGTCC GGGCTGCGCG TTGGTGCGGA  B30 

A  + T d   T 

TATCTCGGTA G略 22ATACG A C G A m m A  A G M A 2 m m m T M A T e c  c

雪

CGTCAAC CACCAmAA C A m m T c m m c T G G g  m A A m z c  

m 

ム

GTGGACCGCT TGCTGCAACT CTCTCAGGGC CAGGCGGTGA AGGGCAATCA GCTGTTGCCC GTCTCACTGG TGAAAAGAAA AACCbCCCTG GCGCCCAATA  1030 

T  C T  

T  C 

CGCAAACCGC CTCてrCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAAT GCAGCTGGCA CGACAGGTTT CCCGACTGGA AAGCGGGCAG TGA叫 ‑‑3

・

10B3

図

4^・7 lacI

遺伝子上に検出された

1

塩悲変異

(1

塩法の晦基置換変異及びフレームシフト型変異)。未処埋群で検出され

た変異を配列の上部に、またグリオキサール処理!詳で、検出された変異を下部に示している

^o 付加

i 変 異 は +

(付加

された権基) "で表わし、欠失変異は ム"で表わしている。また、これらの変異が伺‑!益法の述なる領域で生じた

場合は、総を記している。

43 

表4‑2 グリオキサールによって変異した塩基の隣接塩基 Mutation  5にsite 3'‑site 

Bases Cases  Bases  Cases  Base^幽pairsubstitution 

G:C

→

A:T  T

1 2 .  

10  GC  10  GG  3  GG  5  C

1 2 .  

2 

1 2 .

T  2  AG  2 

G:C

→

T:A  C

1 2 .  

^{5  ♀C}  5  GG  5  GA  3  T

1 2 .   1 2 .

G  2 

1 2 .

T  G:C

→

C:G  GG  GC  A:

丁 →

C:G C ，6 2  ，6T  2 

T ，6 AC  2  G ，h

A:T

→

G:C  TA  AT  AA  ，6A  A:T

→

T:A  C ，6 ，6T  A ，h AG  One‑base deletion a 

G:C  TG  2  GC  3  C

1 2 .  

A:T  GA  AC 

Total  41  41  a One base‑deletions that occured in  the G or A tract are not  included. 

次に、グリオキサールの誘発する変異における隣接塩基の関与について検討 した。 G:C塩基対に変異が生じた場合の隣接塩基を表 4・2に示した。尚、 A:T 塩基対の変異の場合には隣接塩基の関与がみられなかった。また、表 4・2には、

G:C塩基対の G残基にグリオキサールが付加した結果、変異を誘発したと仮定 して、そのG残基の 5に及び3'・隣接塩基を示しているo変異したGの5'‑隣接塩 基はT(5'♂立配列、下線は変異した G)である場合が最も多く、次いでG(5'‑GG 配列)または C (5'‑C立配列)となっている。一方、 3に隣接塩基は主として C

44 

(GC‑3'配列)であり、次いで G (GG‑3'配列)となっているo さらに、変異の 種類によって 5'圃隣接塩基の優先住が異なることが観察され、 G:C→A:Tトラン ジッションの場合には主として T、G:C‑→T:Aトランスバージョンの場合にはC 及び Gが優先するとの結果が得られた^D ある DNA修飾が変異を誘発する原因

として、その相補鎖への誤ったヌクレオチドの取り込みが考えられるが、その 際、近傍の配列によって取り込まれるヌクレオチドの種類が異なる報告もあるむ グリオキサールの作用により生成した DNA修飾の場合にも、塩基対形成におい て配列特異性を有する可能性がある。

Vi 

V~~~==-'!

g盟国=GCGCGTCT~GCGTCTGGCTGGCTGGC===3

"===-III=~ ト-41ト」

」 ーIV... 

図4‑8 lacI遺伝子のホットスポット近傍の配列。 lacI遺伝子の 610番目から 634番目の配列を示している。

これまで、に、lacI遺伝子上で、検出された自然突然変異及び誘発突然変異が数多 く報告されている 75，77・81。自然突然変異については、野生株の大腸菌における変 異の他に、Fpg蛋白質をコードしている mutM遺伝子を欠損した大腸菌(mutM‑

株)、 dUTPase欠損株(Dut‑株)あるいはヌクレオチド除去修復の欠損株(UvrB‑ 株)等の DNA修復酵素遺伝子の変異株における変異も報告されている 75，77，79₀

誘発突然変異の報告例としては、大腸菌をスーパーオキサイド産生剤であるメ ナジオンで処理した実験あるいは γ線照射実験等が挙げられる丸いずれの場合 にも、 lacI遺伝子上に最も高頻度で検出された変異がTGGC変異であり、本実 験において著者が得た結果と一致している。 この TGGC変異は、 DNA援製中

45 

に生じた「ず、れJによって引き起こされると考えられている。このことはTGGC 配列が 3回繰り返されている配列で生じる変異であることから容易に推測でき

るが、近傍の領域にも椙向性の高い配列がみられる。図 4‑8にlacI遺伝子の 610 番目から 634番目の配列を示した。配列

I

と

E

及び配列国とれ7は共に向ーの配 列であり、配列VとUは極めて相向性の高い配列であるo さらに、この TGGC 変異の誘発に abasicsiteが関与していることを示唆する報告もあるoSedwick 

らは、大腸菌 Dut‑株において TGGC変異が増加することを報告している 790

dUTPaseを欠損している Dut‑株においては、 DNA複製時に DNA中に dUTP が取り込まれた後、ウラシルDNAグリコシラーゼの作用により abasicsiteが 生成するため、 Dut+株に比べて多くの abasicsiteが生成することになるoこの abasic siteの存在がDNA複製における DNAの「ず、れJを誘発すると考えられ るD 本実験において、グリオキサールはTGGC変異をも誘発したことから、そ の変異誘発機構に abasicsiteが関与している可能性を示唆している。すなわち、

グリオキサールがDNAに作用し DNA付加体を形成した後、ある種の DNAグ リコシラーゼ活性により塩基部が脱離して abasicsiteを生成すると予想される。

これまでの報告から、グリオキサールがDNAに作用することにより形成される DNA付加体のほとんどがグリオキサール‑G付加体であると考えられる。グリオ キサール‑G付加体がどの様な DNAグリコシラーゼによって認識されるかにつ いては未だ不明であるが、この付加体に類似した構造を有する 1，N2‑エテノグア ニン(図4・9)は、 3‑メチルアデニン DNAグリコシラーゼの基質となることが 報告されている銭。このことからも、グリオキサール‑G付加体を認識する DNA グリコシラーゼが存在する可能性は十分に考えられるo

O 

図4・9 1，N2‑エテノグアニン残基

46 

これまでに、活性酸素による変異の解析実験は幾例も報告されており、

G:C

→

A:Tトランジション及びG:C

→

C:Gトランスバージョンが数多く検出され ているo大腸菌をメナジオンで処理した実験では、 G:C

→

A:T及びG:C

→

C:Gの 変異等が検出されている方。また、時乳動物細胞を過酸化水素で処理した実験で は、主としてG:C

→

A:T(58%)が検出され、G:C

→

C:G(20%)及びG:C

→

T:A(19%)  の変異も検出されているお。 Loebのグループは、 lacZa遺伝子を有するファー ジDNAを種々の活性酸素産生系で処理し、大腸菌内で誘発される変異を誠べて いる。その結果、 G

→

C、C

→

T、CC

→

TT、G

→

Tなどが誘発されることを報告 している品回。また、第 3章では、グリオキサールがサルモネラ菌において G:C

→

A:T、G:C

→

T:A、G:C

→

C:Gの変異及びG:C塩基対の欠失変異を誘発する ことを述べた九今回、大腸菌のグリオキサール処理実験で主として G:C

→

A:T

トランジションが検出されたことから、活性酸素による突然変異にグリオキサ ールが関与していることが考えられるo しかし、本実験では G:C

→

C:Gトラン スバージョンがほとんど検出されなかった点は矛盾している。この理由として、

変異を解析する標的遺伝子の配列の相違、

s o s

^{修復機構の有無(第}6章で詳し く述べる)、また、変異を解析する系によって DNA複製に携わる DNAポリメ ラーゼが異なること等が考えられる。

47 

第 5 章 哨乳動物細胞におけるグリオキサール

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