pThr Arg516 gly

3-2-3.

化 合 物 デ ザ イ ン

PLHSpT

ペプチド等価体の化合物デザインにあたり、

Plk1

と

PLHSpT

ペプチドとの複

合体

X

線結晶構造解析を参考にした

(Figure 3-2-2)

。

Figure 3-2-2. Plk1

と

PLHSpT

ペプチドの複合体

X

線結晶構造解析

PDB ID: 3HIKより作成した。PLHSpTペプチドフラグメントは緑で表示した。Plk1の表面構造における 炭素原子は白で示した。加えて結晶化条件における buffer 中のグリセロールをシアンで示した。また

PLHSpTペプチドの認識に重要なリン酸基を黄色円で、Plk1に特徴的なArg519との相互作用を黄色点線

で示した。

pThr

77

先行研究^3-1-11)では、

Plk1

と

PLHSpT

ペプチドの相互作用を模倣するには、以下の

4

つの相 互作用が鍵になり得ると主張されている。

①

SpT

モチーフによる静電相互作用

(Ser-pThr

からなるモチーフで

Plk1

に結合するペプチドに必須

)

②

N

末端

Pro

残基の静電相互作用および疎水性相互作用

[Plk1

に特徴的な

Arg516

のグアニジンと

Pro

残基のカルボニルの静電相互作用

(Plk2

と

Plk3

は

Arg

残基ではなく

Lys

残基が対応している

)

、および、

Trp414

と

Phe535

との疎水性相互作用

]

③結晶化条件において観察されたグリセロール

(PBD

によるリン酸化ペプチド認識への関与を示唆

)

④水分子によるネットワーク

(PBD

によるリン酸化ペプチド認識への関与を示唆

)

上記の相互作用模倣に重要と考えられる部位を模式化した図を示す

(Figure 3-2-3)

。著 者は重要な相互作用を模倣しうる化合物として、ターフェニル骨格を有する

PLHSpT

ペプ チド等価体を設計した

(Figure 3-2-3)

。ターフェニル骨格を採用した理由は、ターフェニ

ル骨格が

PLHSpT

ペプチドにおけるファーマコフォアを良く模倣した剛直な骨格であり、

かつ誘導体合成が容易であると考えたためである。特に、ターフェニル骨格の両端のベン ゼン環上に二つの親水性基を導入することにより、相互作用に重要である

SpT

モチーフお

よび

Arg516

と相互作用するカルボニルを模倣できると考えた。さらに中央ベンゼン環より

水酸基を伸長させることにより、

X

線結晶構造解析で見られたグリセリンの相互作用を模倣 することを期待した。

Figure 3-2-3. Plk1-PLHSpT

ペプチド相互作用模式図と化合物デザイン

Plk1とPLHSpTペプチドの相互作用に重要な部位をそれぞれ緑 (N末端相互作用) 、青 (グリセロール) 、 赤 (SpTモチーフ) で表記した。またPlk1側で相互作用に寄与する残基を灰色で表記した。

OH OH

OH glycerine N

NH O

O NH O

N NH

HN

O

NH OH OO OH

O P HO OHOH HN

NH₂ NH

Arg516

NH Asp416

Trp414 & Phe535

Trp414

O

O

OH

Plk1 inhibitor designed as PLHSpT peptide mimetics green: carbonyl mimic

blue: glyceline mimic (from crystlization buffer) red: phosphoric acid mimic

gray: Plk1 residue

hydrophilic group hydrophilic group

3-2-4.

化 合 物 の 合 成

化合物の合成スキームを以下に示す

(Scheme 3-2-1)

。

Scheme 3-2-1.

ターフェニル化合物の合成

出発原料

61

を一塩化ヨウ素・ピリジン複合体を用いてヨウ素化し、

2-

ヨウ化エタノール と

S

N

2

反応させることで、

Suzuki

カップリングの共通中間体

63

を得た。化合物

63

を

4-

シア ノフェニルボロン酸ピナコールエステルと

Suzuki

カップリングすることで、ジニトリル体

64

を得た。さらに

64

を加水分解することで、ジカルボン酸体

65

を得た。またジニトリル体

64

をアジ化ナトリウムと反応させ、ニトリル基をカルボン酸のバイオアイソスターとして 知られる脂溶性酸性官能基であるテトラゾール基へと変換したところ、モノテトラゾール 体

66

とジテトラゾール体

67

を得た。

O CN

N N

N NH OH

O

OH COOH HOOC

OH OH

O

OH

I I

I I

61 62 63

65

O

OH CN NC

64

64

N O N

N NH OH HN NN

N

66 67

ICl-pyridine CH₂Cl₂/H₂O = 2/1

0 ^oC to r.t.

7 h 69%

I OH

Cs2CO3 DMF 0 ^oC to 80 ^oC

9.5 h 84%

NC

B_pin Pd(dppf)Cl2

K3PO4 DMF 80 ^oC 65%

5 h

KOH EtOH reflux 6.5 h 13%

NH₄Cl LiCl NaN₃ DMF 100 ^oC

18 h

43% 11%

B_pin B O O

79

3-2-5. ELISA

に よ る

PBD-PLHSpT

ペ プ チ ド 相 互 作 用 阻 害 活 性 評 価

得られたターフェニル化合物群の

PBD-PLHSpT

ペプチド相互作用阻害活性を評価すべ く、先行研究^3-1-11)を元に、

ELISA

に基づく評価系の構築を行った。評価系の原理を以下に 示す

(Figure 3-2-4)

。

Figure 3-2-4. PBD-PLHSpT

ペプチド相互作用阻害活性評価の原理

Plk1

は

HeLa

細胞に高発現しているため、評価系の

Plk1

は

HeLa

細胞のライセートに含ま れるものを使用した。予め

HeLa

ライセートとペプチド等価体をプレインキュベーションし

た後、

PLHSpT

ペプチドが固定されたプレート上で、

Plk1

に対して

PLHSpT

ペプチドとペ

プチド等価体を競合させた。インキュベーション終了後、プレートの洗浄操作を行い、プ レート上の

PLHSpT

ペプチドと結合した

Plk1

を

1

次抗体、

HRP

標識

2

次抗体、および

TMB

の酸化による発色で検出することで、

PBD-PLHSpT

ペプチド相互作用阻害活性の評価を行 った。

!GGGGG!PLHST P !GGGGG!PLHST P !GGGGG!PLHST P !GGGGG!PLHSTP

!GGGGG!PLHST P !GGGGG!PLHST P

!GGGGG!PLHST P !GGGGG!PLHSTP

!GGGGG!PLHST P !GGGGG!PLHST P !GGGGG!PLHST P !GGGGG!PLHSTP

!GGGGG!PLHST P !GGGGG!PLHST P

!GGGGG!PLHST P !GGGGG!PLHSTP

!GGGGG!PLHST P !GGGGG!PLHST P !GGGGG!PLHST P !GGGGG!PLHSTP

!GGGGG!PLHST P !GGGGG!PLHST P

!GGGGG!PLHST P !GGGGG!PLHSTP

PLHSpT )

HeLa Plk1 )

PLHSpT

PLHSpT )

PLK1

1 HRP 2 )

TMB PLK

Plk1)(in)cell)lysate) Pep<de)mime<cs

washout incuba<on

H₂N

NH₂ TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)

PBD-PLHSpT

ペプチド相互作用阻害活性の評価結果を以下に示す

(Figure 3-2-5)

。

DMSO

処理時の結合強度を

100%

として規格化して示した。

Figure 3-2-5. PBD-PLHSpT

ペプチド相互作用阻害活性^a

ポジティブコントロールとして用いた

PLHSpT

ペプチドは、期待通り

PDB

とプレート上 の

PLHSpT

ペプチド相互作用を阻害した

(IC

50

5.27 µM)

。一方で期待に反して、ターフェ ニル化合物群

64-67

には

PBD-PLHSpT

ペプチド相互作用を増強する傾向が見られ、化合物

66

では顕著にその傾向が見られた。なお化合物

64

は溶解性が悪く

100 µM

までの評価しか 行っていない。

本実験で得られた結果は、ターフェニル化合物が

PBD-PLHSpT

ペプチド相互作用を阻害 するとした作業仮説に反して、ターフェニル化合物が

PBD-PLHSpT

ペプチド相互作用を増 強することを示唆する結果であった。その作用機序は不明であるが、ターフェニル化合物 が

Plk1

に作用し、その

PLHSpT

ペプチド認識の活性コンフォメーションを変えることによ

0"

100"

200"

300"

400"

500"

600"

700"

800"

900"

3"μM" 10"μM" 30"μM" 100"μM" 0.1"mM" 0.3"mM" 0.8"mM" 1"mM" 0.1"mM" 0.3"mM" 0.8"mM" 1"mM" 0.1"mM" 0.3"mM" 0.8"mM" 1"mM"

64 65 66 67

O OH

CN

NC O

OH COOH

HOOC O

N CN N

N NH OH

N O N

N NH OH HN NN

N

aPlk1 kinase activity was calculated based on the value of the DMSO-treated sample, taken as 100%.!

bIC₅₀ value of PLHSpT pentapeptide, used as a positive control is 5.27 μM.!

cThe maximum solubility of compound 64 was about 100 μM under the buffer condition for this assay system.

Rela4ve"intensity"of"Plk1?PLHSpT"pep4de"binding"(%)

81

3-2-6. ELISA

に よ る

Plk1

キ ナ ー ゼ 阻 害 活 性 評 価

前項

3-2-5

にて、ターフェニル化合物が

Plk1

の

PLHSpT

ペプチド認識能を向上させること が示唆されたため、ターフェニル化合物

66

による

Plk1

キナーゼ阻害活性を評価した。評価 系の原理を以下に示す

(Figure 3-2-6)

。

Figure 3-2-6. Plk1

キナーゼ阻害活性評価の原理

本実験ではキナーゼドメインの活性化ループ

(active-site loop)

に

T210D

の変異を有し、

恒常的に活性化されている変異

Plk1

の生成タンパク質を用いた。変異

Plk1

を

ATP

およびタ ーフェニル化合物存在下でプレート上に固定した基質タンパク質とインキュベーションす ることにより、基質タンパク質のリン酸化を行い、そのリン酸基を

1

次抗体、

HRP

標識

2

次 抗体、および

TMB

の酸化による発色を用いて検出・定量を行った。

Plk1 ATP '

'

1 HRP 2 TMB '

Plk1''

(T210D'ac2vated'mutant) Terphenyl'compounds

washout

substrate substrate

P

substrate substrate

P

TMB

incuba2on

H₂N

NH₂ TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)

Plk1

キナーゼ阻害活性の評価結果を以下に示す

(Figure 3-2-7)

。

DMSO

処理時のキナー ゼ活性を

100%

として規格化して示した。

Figure 3-2-7. Plk1

キナーゼ阻害活性^a

本実験系では

PLHSpT

ペプチドは

Plk1

キナーゼ阻害活性を示さなかったのに対して、タ ーフェニル化合物

66

は用量依存的に

Plk1

キナーゼ活性を阻害した

(IC

50

151 µM)

。本結果 は、ターフェニル化合物が

Plk1

の

PLHSpT

ペプチド認識部位とは別の部位に作用すること で、

Plk1

キナーゼ活性を阻害する可能性を示唆する結果である。

続いてターフェニル化合物

66

に見られた

Plk1

キナーゼ阻害活性に着目し、本活性の構造 活性相関を得るべく、さらなる構造展開を計画した。

0"

20"

40"

60"

80"

100"

120"

PLHSpT"100"μM" 30"μM" 100"μM" 300"μM" 1000"μM"

Pl k1 "k in as e" ac 9v ity "(% )

66

O CN

N N

N NH OH

66

aPlk1"kinase"ac9vity"was"calculated"based"on"the"value"of"the"DMSOItreated"

""sample,"taken"as"100%

83

3-2-7.

タ ー フ ェ ニ ル 化 合 物 の 構 造 展 開

ターフェニル化合物の構造活性相関を得るべく、種々の化合物の合成を行った。化合物 の合成には、共通中間体

63

と対応するフェニルボロン酸誘導体を

Suzuki

カップリングする ことで誘導遺体の合成を行った。以下に合成スキームを示す。

Scheme 3-2-2.

親水基のリンカー長が異なる誘導体

72a-c

の合成

Scheme 3-2-2

では親水基のリンカー長を検討すべく、リンカー長の異なる誘導体

72a-c

を合成した。即ち化合物

68a-c

のカルボキシル基をベンジル基で保護し、ピナコールエステ ル誘導体へと変換した後、共通中間体

63

と

Suzuki

カップリングおよびベンジル基の除去を 行うことで、目的とする化合物

72a-c

を得た。

Br

OH O n

Br

OBn O

n OBn

O n

O OH

COOBn BnOOC

n n

O OH

COOH HOOC

n n 68a (n = 0)

68b (n = 1) 68c (n = 2)

Bpin 69a (n = 0) (82%)

69b (n = 1) (73%) 69c (n = 2) (83%)

70a (n = 0) (64%) 70b (n = 1) (56%) 70c (n = 2) (54%)

71a (n = 0) (69%) 71b (n = 1) (63%) 71c (n = 2) (79%)

72a (= 65) (n = 0) (81%) 72b (n = 1) (78%) 72c (n = 2) (38%) B_pin B

O O Br

DMF 100 ^oC

13 h K₂CO₃

(PPh3)2PdCl2 O

B O

B O O

AcOK 1,4-dioxane

100 ^oC 3-6.5 h

O OH

I I

63

Pd(dppf)Cl2 K₃PO₄

DMF 80 ^oC 3 h

63 H2, Pd/C

1,4-dioxane r.t.

18 h (for 72a)

or

2 N NaOH aq MeOH

r.t.

1 d (for 72b-c)

Scheme 3-2-3.

メタ位にカルボキシル基を有する誘導体

76

の合成

Scheme 3-2-3

ではフェニル基上の親水性基の位置の影響を調べるべく、フェニル基のメ

タ位にカルボキシル基を有する誘導体

76

の合成を合成した。出発原料

73

のカルボキシル基 をベンジル保護し、カップリングによりピナコールエステル誘導体へと変換した後、共通

中間体

63

と

Suzuki

カップリング、およびエステル加水分解を行うことで、目的とする化合

物

76

得た。

Scheme 3-2-4.

アミド基を有する誘導体

79

の合成

O

OH

COOH HOOC

COOH

Br 73

COOBn

Br 74

COOBn

Bpin 75

76

Bpin B O O

O

OH

I I

63

Pd(dppf)Cl2 K3PO4

DMF 80 ^oC 6 h

2N NaOH aq MeOHr.t.

23 h 43 % (2 Steps)

Br

K2CO3 DMF 100 ^oC

96%

6.5 h

(PPh3)2PdCl2 O

B O

B O O

AcOK 1,4-dioxane

100 ^oC 10 h83%

63

Br Br

HN

O

HN

O

O

OH 68b

B_pin

77 78

79

NH O NH

O OH

O

MeNH₂ in MeOH HOBt•H₂O

DIPEA EDCI CH₂Cl₂

r.t.

23 h 32%

(PPh₃)₂PdCl₂ O

B O

B O O

AcOK 1,4-dioxane

100 ^oC 4.5 h

46%

Pd(dppf)Cl₂ K₃PO₄

DMF 80 ^oC

4 h 14 %

63

B_pin B O O

O

OH

I I

63

85

Scheme 3-2-5.

ジフルオロフェノールを有する誘導体

82

の合成

ジフルオロフェノールはカルボキシル基のバイオアイソスターとして知られている^3-2-3)。

Scheme 3-2-5

では、出発物質

80

を

NBS

を用いてブロモ化し、ピナコールエステル誘導体へ

と変換した後、共通中間体

63

との

Suzuki

カップリングを行い、ジフルオロフェノールを有 する誘導体

82

を得た。

Scheme 3-2-6.

中央ベンゼン環から水酸基を伸長しない化合物

84

の合成

Scheme 3-2-6

ではグリセロールを模倣すべく導入した水酸基の効果を検討すべく、中央

ベンゼン環から水酸基を伸長しない化合物

84

の合成を行った。中央ベンゼン環のフェノー ル性水酸基が無置換の中間体

62

に対して

Suzuki

カップリングを行い、ベンジル基を除去す ることで、目的化合物

84

を合成した。

上記得られた化合物群に関して、

Plk1

キナーゼ阻害活性の評価を行った。

3-2-3)

Meanwell NA. “Synopsis of some recent tactical application of bioisosteres in drug design.” J. Med. Chem. 2011, 54 , 2529

F F

OH

F F

OH Br

OH HO

F F

F F O

80 81 OH

82 NBS

DMF 0 ^oC to r.t.

88 %24 h

AcOK 1,4-dioxane

100 ^oC 10.5 h

Pd(dppf)Cl2 K₃PO₄

DMF 80 ^oC 3 % (2 steps)9 h

63

O

OH

I I

63 (PPh3)2PdCl2

O B O

B O O

OH COOBn

BnOOC

62 83

OH COOH

HOOC

84

I I

OH

OBn O

B Pd(dppf)Cl₂

K3PO4 DMF 80 ^oC 29 %3 h

H₂ Pd/C 1,4-dioxane

r.t.

22 h 11 %

O O

70a 70a

ドキュメント内 タンパク質間相互作用に着目したVDR阻害薬ならびにPlk1阻害薬の創製研究 (ページ 84-97)