Flow

第3章 熱損傷大腸菌に対する誘電特性解析の基礎検証

46

図3.7 セルデバイス概略

図3.8 マイクロフィルタ概略 [a]

[b]

[c] [d] [e]

[f]

第3章 熱損傷大腸菌に対する誘電特性解析の基礎検証

47

3.2.5コロニーカウント計測法による生育活性計測

加温処理によるATCC 11775生育活性変化量を調査するため，混釈平板培養法によっ て生育するコロニー数を計測した．DM溶液で10⁶ - 10⁷倍希釈した各処理サンプル1 mL を，滅菌済みプレート2枚ずつに分注した．培地及び培養条件は3.2.2節と同様とした．

なお，DEPIMは行っていないが，追加で333 K（60 ℃）の温度でも加温処理を実施し，

コロニー生育数を計測した（コロニーカウント計測法の詳細は付録B参照）．

3.2.6 数値解析による熱損傷大腸菌の誘電特性評価

2.1節で示した式(2.16)について，_MW ^をMaxwell-Wagnerの誘電緩和時間として

， (3.1)

とおくと，Clausius-Mossotti関数は，

(3.2)

と表すことができ，このことから，

(3.3)

という関係が得られる^[18]．

これらのことから，DEPによる力の方向と大きさの関係は，低周波数では

σ

1および

σ

2

の大小に依存し，高周波数では

ε

1および

ε

2の大小に依存することが分かる．つまりこ れらの関係から，処理温度変化による

σ

/

ε

の変動を見極められると解釈できる．

これらを検証するために，2.1 節の式(2.15)における Clausius-Mossottii 関数の実部

（Re[K^*()]）に対する数値解析を実施した．本解析ではATCC 11775を，外殻から細胞 外膜（outer membrane: om），ペリプラズム空間（periplasmic space: ppls），細胞内膜（inner

membrane: im）及び細胞質（cytoplasm: cp）からなる4層構造球体としてモデル化した（図

1 2

1 2

2 2







 



 

MW

1 2

1 2

0  



 



 



















 

1 1 ) 2

( ⁰

1 2

1 2

*

j MW

K j











 













 



 







1 2

1 2

*

1 2

1

* 2 0

)] 2 ( [ lim

)] 2 ( [ lim







 







 





K K

第3章 熱損傷大腸菌に対する誘電特性解析の基礎検証

48

3.9）．ここで，E. coliの代表的な構造例を図3.10に示す．また，本解析に用いた各パラ

メータを表3.1に示す．このパラメータに基づき，cp及びpplsの導電率及び誘電率を変 化させることによってRe[K^*()]の周波数特性を検証した．今回の解析において媒質は純 水とし，

σ

= 2.0×10^-4 S/m,

ε

r = 80と設定した^[19]（計算プログラムの詳細は付録C参照）．

図3.9 E. coliの4層構造球体モデル

図3.10 E. coli（グラム陰性菌）の構造（右：全体概要，左細胞壁構造）

細胞外膜（outer membrane: om）

ペリプラズム空間

（periplasmic space: ppls）

細胞内膜

（inner membrane: im）

細胞質

（cytoplasm: cp）

第3章 熱損傷大腸菌に対する誘電特性解析の基礎検証

49

表3.1 本解析に用いる各パラメータ

3.3 実験結果及び考察

3.3.1 細菌捕捉による電極間のコンダクタンス変化

計測時間と電圧印加開始時からのΔGとの関係例（周波数：100 kHz，加温処理温度：

309 K）を図3.11に示す．また，DEPIM中における電極間での細菌捕捉状況を図3.12に

示す．図3.11[A]の電圧印加開始から90 sec後の図3.10[B]の時点でATCC 11775試料を注 入した．約100 secの図3.11[C]の時点から，電極間にATCC 11775が捕捉され始めるのと 同時にΔGの増加が見られた．ATCC 11775は電極全体で捕捉され，図3.12 (b)に示すと おり電極間の各でpearl chainが形成したが，pearl chainの一部は水流の力によって流れ方 向に滑走し，最終的には多量のpearl chainが，電極下流部の折り返し部（図中赤枠部）

に集結した．ただし，電極上流部の折り返し部において，同様に細菌捕捉は保持された．

電圧印加を停止した図3.11[D]の時点では，捕捉されていたATCC 11775が瞬時に放出さ れた．また，界面親和剤の効果によって，電極間に残存するATCC 11775は極めて少な

く，図3.12 (c)のとおり電極への付着も殆ど確認されなかった．

ここで，計測時間tにおける電極間ΔG及びΔCの変化を図3.13示す．また，本結果 に基づいた両者の関係を図 3.14 に示す．ΔG 及び ΔC は電圧印加開始から同様の増加傾

Property SI unit Condition

cp diameter r_cp m 1.0×10^-6

im diameter r_im 7.0×10^-9

ppls diameter rppls 1.0×10^-8

om diameter r_om 7.0×10^-9

cp conductivity σ_cp S/m 0.22

im conductivity σ_im 0

ppls conductivity σ_ppls 3

om conductivity σ_om 0

Medium conductivity σ_a 2.0×10^-4

IPA conductivity σ_IPA 3.5×10^-4

cp relative permitivity ε_cp 100

im relative permitivity ε_im 6

ppls relative permitivity ε_ppls 60

om relative permitivity ε_om 10

Medium relative permitivity ε_a 80

第3章 熱損傷大腸菌に対する誘電特性解析の基礎検証

50

向を示した．また，図 3.14 に示す通り，両者は直線関係にあり，この結果は，2.2 節の 式(2.22)の関係を証明するものである．また，同式の通り，細菌はRCの並列回路として 成立し，ΔG及びΔCは，細菌のキャパシタンスCB及び抵抗RBの乗算値CBRBを係数と する比例関係を示す（図 3.14参照）．この比例係数は菌固有の値とされる^[4]．図 3.14 の 結果をもとに，近似曲線解析から導出したCBRBは約1.5×10^-6 FΩであった．参考として，

K12という別菌株のE. coliを用いた末廣らの実験結果^[7]を図3.15に示す．ここでは，当 該菌種における本係数値を約0.82×10^-6 FΩと推量している．

これらの顕微鏡観察及びDEPIM結果から，捕捉菌量とΔGの関係は，細菌をRCの並 列回路として扱うことが可能であり，末廣らが提唱した等価回路モデルが適用できるこ とを示唆している．よって，本マイクロフィルタを用いたDEPIM法は妥当であると結論 される．

なお，Fdepによる電極間での微生物捕捉の詳細な状況については，4.3.1節及び5.3.1節 での実験結果を併せて参照されたい．

第3章 熱損傷大腸菌に対する誘電特性解析の基礎検証

51

図3.11 測定時間とΔGの関係

図3.12 DEPIM中におけるCr電極間での菌捕捉状況

（観察位置：電極下流部の折り返し部）

(a) 0 sec，(b) 150 sec，(c) 900 sec 0

4 8 12 16 20

0 200 400 600 800 1000

Δ G [μ S]

t [s]

[D]

[B]

[A] [C]

Pearl chains (b)

(c) Flow

(a)

第3章 熱損傷大腸菌に対する誘電特性解析の基礎検証

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図3.13 計測時間tにおけるΔG及びΔCの変化

図3.14 ΔG及びΔCの関係

0 2 4 6 8 10 12 14 16

0 2 4 6 8 10 12 14 16

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900

Δ G [μ S]

Δ C [pF]

t [s]

ΔC

ΔG

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

0 2 4 6 8 10 12

Δ C [pF]

ΔG [μS]

ΔC = C

_B

R

_B

ΔG

_T

C

_B

R

_B

≒ 1.5 ×10

^-6

第3章 熱損傷大腸菌に対する誘電特性解析の基礎検証

53

図3.15 E. coli K12菌株におけるGT及びCT（ΔG及びΔC）の関係（末廣ら^[7]）

第3章 熱損傷大腸菌に対する誘電特性解析の基礎検証

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3.3.2 加温負荷処理とコンダクタンス変化量との相関

周波数100 kHz時における加温処理温度とΔGとの関係を図3.16に，1 MHz時におけ

る加温処理温度とΔGとの関係を図3.17に示す．ここでは，電圧印加開始300，600及び

900 sec時点のΔGを表示した．100 kHzでは，処理温度の上昇に伴ってΔGは増加し，

300 K（27 ℃）付近で最も高い値を示した．それ以降では，加温処理温度の上昇と共に

ΔGは減少した．完全に失活したと推測される353 K（80 ℃）では，300 sec時のΔGは 低温処理（277 K）時と比較して高いものの，900 sec時のΔG増加は抑制された．処理温 度におけるΔGの変動は，測定時間内におけるATCC 11775捕捉量及びpearl chainの形成 状況が，加温処理によって変化したことに起因している．特に高温処理（353 K）におい て電極間への捕捉量が明らかに減少したことは，DEPIM時の顕微鏡観察によって観察さ れている．また，電極間の他でも，電極エッジ部にATCC 11775が局所的に捕捉される 現象が観察された．これはエッジ部に高い∇E が形成され，強力な Fdepが作用したため と考えられる．1 MHz時の場合，277 K - 320 Kの範囲において緩やかなΔGの減少が計 測された．また，3.3.1節で観察されたpearl chainの顕著な滑走現象が発生した．一方で，

100 kHz時とは異なり，353 Kで処理されたATCC 11775は電極間で殆ど保持されず，pearl

chain も形成されなかった．結果的に，当該温度における ΔG の増加は見られなかった．

本結果は，周波数条件1 MHzにおいて，高温処理されたATCC 11775に対するFdepの作 用は極めて小さい事を示唆している．

通常，生細胞と死細胞では誘電特性が大きく異なる．この性質を利用して，生・死菌 を分離する研究報告がなされているが[2],[3],[20],[21]，本実験において，加温処理による細菌 の活性（または生死）状態の相違による誘電特性の変化を確認することができた．

第3章 熱損傷大腸菌に対する誘電特性解析の基礎検証

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図3.16 加温処理温度とΔGの関係（１）

（周波数：100 kHz，印加電圧：10 Vpp）

図3.17 加温処理温度とΔGの関係（２）

（周波数：1 MHz，印加電圧：10 Vpp）

0 5 10 15 20

260 280 300 320 340 360 380 400

Δ G [μ S]

ドキュメント内 第 1 章 (ページ 56-65)