3.2.4 作製した各遺伝子のcDNA配列を挿入したpGEMHEベクターを 込ませ形
質転換させた大腸菌株DH5αを培養し、 ス を抽出した 抽出した ス を 鋳 型 、 T7 ー タ ー 領 域 対 し 作 製 し た イ マ ー
5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3' SP6領域の 流 対し 作製した イマー
5'-CAGCTATGACCATGATTACGCCAAGC-3'を用い PCR 反応を行った PCR 産物 、
GEL/PCR Purification Mini Kit (Favorgen)を用い 精製し、MilliQ水 溶解した 精製
したPCR産物を鋳型 mMESSAGE mMACHINE® T7 Transcription Kit (Ambion) の トコー 従いそ のcRNAを合成し、吸 度計を用い 濃度を測定し、MillQ水
cRNA濃度が1 µg/µl う調整した
3.2.7 電気生理学的解析
40.4 nlのcRNAをXenopus laevisの卵母細胞 イン クトし、MBS(Ca2+) 中 72
時間20℃ イン ュベートした 毒素 っ 形成さ Pore 由来す 卵母細胞内 へ の 陽 イ ン の 流 入 の 結 果 起 こ 電 流 値 の 変 化 、 二 本 刺 膜 電 位 固 定 法 用 の ア ン OC725C (Warnar Instrument) ー タ 得 、 解 析 用 フ ト ウ ア pClamp10 (Axon
Instrument) を 用 い 記 録 し た 電 極 、 芯 入 ス ーGC150TF-10
(HARVARD APPARATUS) を用い、電極 ー Warnar の約3分の１が3M KCl
満たさ う 電極中 3 M KCl を注入した 測定中の卵母細胞 ンバー 、
Standard Ringer solution (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 1.8 mM CaCl2, pH7.4) 満たした
85
3.2.8 ウエスタン ッテ ン
cRNA をイン クト後 72時間、20℃ イン ュベートした卵母細胞そ 5
を1% n-dodecyl-β-D-maltoside DDM /MBS (+Ca2+) Protein inhibitor (Roche)を添加し た溶液を各200 µl添加し、 ッテ ン 卵母細胞を破壊、懸濁した ーテー ターを用い 、4℃ 60分間振盪した後、16,000 rpm、4℃、10分の遠心分離操作を行 い、上清を新しい1.5 mL ュー 移した SDS-PAGEサン バッフ ーを添加し、
95℃ 5 分間保温し、タン ク質を変性させたものを SDS-PAGE のサン した
SDS-PAGE以後の操作 、第2章 2.2.9 同様の操作を行った APN1のウエスタン
ッテ ン 、1 次 抗体 し 抗 APN1-7 (40 - 317 a.a. 対す 血 清)及 び、抗 APN1-314(190 - 987a.a 血 清)を 用い、2 次抗 体 、horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse IgGを用いた
3.2.9 APN1発現Sf9細胞の免疫染色
Sf9細胞 AcNPV-APN1を感染後72時間の細胞を4% PFA/ PBSを用い 固定した 以降の操作 、第 2 章 2.2.10 同様の手法 行い、3.2.7 記載した APN1-7 及び、
APN1-314を1次抗体 し 用いた 2次抗体 、Alexa Fluor® 555 Conjugate抗マウ ス抗体を用いた
3.2.10 受容体発現アフ ツ エ 卵母細胞の免疫染色
cRNA をイン クト後 72時間、20℃ イン ュベートした卵母細胞を凍結組織切
片作製用包埋剤 テ シュー テック O.C.T. コン ウン (サク フ インテック) 満たした フ 作製した直 1.5cm の包埋皿 沈 、-80℃フ ー ー中 速 や 凍結させた 凍結させた組織 ック ク イ スタット (サク フ インテ ッ ク) を 用 い 厚 さ 12 µm の 薄 切 切 片 を 作 製 し 、MAS-GP type A Micro slide glass
86
(Matsunami) 伸展させた ス イ ス上 伸展させた組織切片 、4% PFA/ PBS
室温、10 分間反応させ こ 固定の操作を行い、PBS 2 回洗った その後
の操作 、第2章 2.2.10 同様の方法 行った
3.2.10 毒素結合実験
cRNA をイン クト後 72 時間、20℃ イン ュベートした卵母細胞 、100 µM
Cry1Aa 毒素を含 MBS (+Ca2+) 浸し、60分間20℃ ーテーター 振盪し が 反
応させた その後、MBS (+Ca2+) 3回洗い、1% DDMを含 MPB (+Ca2+) 200 µl中 移し、 ッテ ン 卵母細胞を破 し、 ーテーター 振盪し が 60分間 4℃ イン ュベートした 28,933 g 4℃ 10分間の遠心操作を行い上清を新しい1.5 ml
ュー 移し、2×サン バッフ ーを加え、 マー化した毒素を見 目的 50℃ 、また通常の観察を目的 す 場合 95℃ 5分加熱し、
SDS-PAGE (10 %ポ アク ア ) 分離した 1次抗体 抗Cry1Aa毒素
抗体、2次抗体 抗ウサ 抗体を用い 第2章 2.2.9 同様の操作 ウエスタン ッテ ン を行った
87
第3節 結果 考察
3.3.1 BtR175-TBR BmABCC2_Sの共発現細胞 み Cry1A毒素 対す 高い
感受性
単独 そ がCry毒素受容体 し 機能す BtR175 BmABCC2が、現在提唱 さ い 作用機構仮説 おけ APN1、ALP ン様タン ク質の関係の う
、連続す １連の作用上 働く分子 あ 可能性や2分子が協調的 働く可能性
い 調 こ した 2 種類のAcNPV を共感染させ こ 、1 の細胞 2 種類
の受容体BtR175及びBmABCC2_Sを発現させたSf9細胞を作 、3種類のCry1A毒素 対す 感受性を評価した その結果、3種類のCry1A毒素 対し そ 10 pM以 上添加した際 膨潤した細胞が観察さ た (Fig. 28A) 3種類す のCry1A毒素 対 し 、BmABCC2_S け (Fig. 11A) もしく BtR175 け (Fig. 18A) を発現させた際
も両者を発現した細胞 高い感受性を示した す わ 、細胞が膨張を開始す 最も い濃度を比較す 、Cry1Aa の場合 、BmABCC2_S けを発現させた場合 も 両者を発現した細胞の感受性 10倍上 し、BtR175 けを発現させた場合 も感受
性 15000倍上 した また、同様の比較 、Cry1Abの場合 、1000倍 15000倍、
Cry1Acの場合 100倍 45000倍 あった こ のこ BtR175 BmABCC2
細胞上 協調的 働き感受性を高 合う関係 あ こ を示唆し い そこ 次 実 際 、生物統計学的手法を適用し、本研究 観察さ た現象が協調作用 呼 現象 あ の を検証した Fernández-Luna がCry4Ba and Cry11Aa Cyt1Aaの間 み
相乗作用を示すの 用いたフ ッシ ーの正確確率検定 Fernández-Luna et al. 2010
を使用し 、BmABCC2 BtR175 の間 見 た協調作用が確 相乗的 効果
もの あ を確 た その結果、3種類の毒素そ おい 100 pM 1 nMの2点 おい 協調作用が起こ いう仮説が棄 さ い結果が得 た Table
88
5 この結果 、H. virescence おけ ン様タン ク質 ABCC2の両方の機
能を欠損した抵抗性系統 Cry1Ac 対し 感受性系統 あ JEN系統 も少 く も3000倍高い抵抗性を示し(Gahan et al. 2010)、その抵抗性 ベ が ンのみを 欠損したYFOの40倍、そし ABCC2のみを欠損したYEEの約4倍高い (Gahan et al.
2010) こ 見 け上 く似た現象 あ 一方、BtR175-TBR BmABCC2_Rを共発
現 さ せ た Sf9 細 胞 い も 細 胞 毒 性 を 評 価 し た そ の 結 果 、Cry1Aa い
BtR175-TBR BmABCC2_S を共発現させた際 ほ 同様 10 pM以上の毒素を添加
した際 反応が見 た (Fig. 28B) Cry1Ab い 、100 nMの毒素を添加した際
23 %の細胞が膨潤し い こ が確認 きたが、10 nM おい 膨潤した細胞
観察 き (Fig. 28B)、BtR175-TBR けを発現させた際 (Fig. 18A) 同程度の感受
性 あった Cry1Ac い 100 nM添加した際 も反応し い 細胞 1 も観察
さ (Fig. 28B)、こ 関し もBtR175-TBR けを発現させた際 (Fig. 18A) 同程 度の感受性 あ こ が伺えた こ BtR175 BmABCC2の共発現細胞の結果 見え きた2分子の協調的 働きが、BtR175 BmABCC2の間 け 起こ もの あ
い 考察す た 、現在提唱さ い 作用仮説 おい BtR175
が の作用の過程 働く 考え い (Pacheco et al. 2009) 受容体 あ 報告 のあ APN1の組換え型AcNPVを作出し、BmABCC2_S分子 の協調的作用が観察さ 否 を評価した ま 、作出したAcNPV-APN1を感染させ、正しい分子量 Sf9 細胞膜上 目的の分子が発現す う を APN1 血清 免疫染色お びウエス タン ッテ ン 解析を行った 2種類のAPN1のア ノ酸配列の異 箇所 を抗原 したAPN1血清、APN1-7 (40 - 317 a.a. 対す 血清)及び、抗APN1-314(190 -
987a.a 血清)を用いた免疫染色 、発現マー ー あ EGFP が発現し い 細胞の
輪郭が浮き立 う 染色さ 、APN1 が細胞膜上 発現し い こ が確認 きた
(Fig. 29A) また、同APN1血清を用いたウエスタン ッテ ン の結果 もAPN1
89
が 120kDa の理論値通 の質量を持った形 Sf9 細胞 発現し い こ が示さ た
(Fig. 29B) し し が 、APN1発現細胞 Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Acをそ 、3 µM、
600 nM、1.6 µM添加した後60分後の観察を行った こ 3種類全 の毒素 おい 膨
潤した細胞 １ も観察さ った (data not shown) また、APN1 BmABCC2_S の共発現細胞の3 種類の Cry1A毒素 対す 感受性 ベ 、BmABCC2_S 単独発現
細胞 同程度 あ 、BtR175 BmABCC2の共発現細胞 見 た感受性の協調的増
大 観察さ った (Fig. 28C) Luo M. sexta のAPN1を培養細胞 発現させ、
APN1が正しい分子量 、本来あ き酵素活性を持った分子 し 培養細胞膜表面上
発現し い こ を確 た も関わ 、Cry1C 対す 感受性を示さ ったこ
を報告し、その原因 し 、実際の腸管 糖鎖 の修飾が異 た い
主張し い (Luo et al. 1999) 糖鎖 の修飾を含 APN1が本来の形 Sf9膜上
発現し い こ を示すこ 困 の 、APN1 BmABCC2 協調作用す 機能が
いこ を完全 証明す こ 現時点 可能 あ し し、現在ま ン ー マッ ン の手法 APN1 が抵抗性の原因 あ こ が確 た例 ま
い このこ もまた APN が ン様タン ク質や ABCC2 協調的 働く分
子 いこ を示唆す の もし い
3.3.2 BmABCC2 BtR175の協調作用のCry毒素の活性発現 おけ 意味
BtR175 BmABCC2の受容体 し の機能が異 Cry毒素 い も当 ま
こ あ 否 を検討した B. mori 対し 活性を持 Cry1Fa 、 虫目 対す
活性 あ がB. mori 対し 活性を持た い 報告さ い Cry8Ca、Cry3Bbを用
い 、BtR175-TBR単独発現細胞、BmABCC2_S単独発現細胞、あ い こ の共発
現細胞 対す 活性を調 た BtR175-TBR発現細胞 い 、こ 3種類の毒素
を300 nM添加し も膨潤し い 細胞が観察さ った (Fig. 30B) H. virescence
90
の ン様タン ク質をDrosophilaのS2細胞 発現させCry1A毒素 Cry1Fa毒
素の感受性を調 たJurat-Fuentes も ン様タン ク質発細胞が、Cry1Fa毒素 対す 感受性 獲得 き ったこ を報告し い (Jurat-Fuentes et al. 2006)、本研究
同様、Cry1Fa 毒素 対す ン様タン ク質の受容体 し の役割 いこ
を示唆し い Cry1Fa Cry8Ca い 大腸菌発現型BtR175 の結合親和性を
Biacore を用い 解析した こ 、Cry1A 毒素 比較し 極 い親和性し 持た
いこ が明 (Fig. 31)、こ がBtR175-TBR単独発現細胞 感受性が見
った現象の一因 あ 考え た
次 、BmABCC2_S発現細胞 対し 各毒素を10 nM 作用させた こ 、Cry1Aa、
Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Fa 毒素 い そ 72%、14.9%、54.9%、40.1%の細胞
が膨潤したの 対し、Cry8Ca ウイ ス未感染の細胞 あ 対照区の1.7% 同 ベ の3%未満の膨潤した細胞し 観察さ 、Cry3Bb い 膨潤した細胞 観察さ
った(Fig. 30C) Cry8Ca、Cry3Bb い 毒素濃度を上げ 試験した こ 、
Cry8Ca い 100 nM 25％の細胞 膨潤が見 た Fig.30F し し、Cry3Bb
い 、500 nM も膨潤し い 細胞 観察さ った (data not shown)
3種のCry1A毒素 対し 最も高い感受性を示したBtR175-TBR BmABCC2_Sを共発
現した細胞 い 10 nM Cry1Fa、Cry8Ca、Cry3Bb 対す 感受性を評価した こ
、B. mori幼虫 対し 活性があったCry1Fa い 60%以上の割合 膨潤した細
胞が観察さ 、高い感受性が見 た (Fig. 30D) 一方、B. mori ほ 活性の
いCry8Ca 対し 膨潤細胞の比率が17％ あ い感受性が認 (Fig. 30D and
G)、またCry3Bb毒素 対し 膨潤細胞の比率が0% あ 感受性 認 っ
た (Fig. 30D) BmABCC2単独発現の時 同様、Cry3Bb Cry8Ca い 、毒素濃度
を上げ 試験した こ 、Cry3Bb 500 nM添加した際 も膨潤した細胞 観察さた
った (Fig. 30I) 一方、Cry8Ca 、100 nMの濃度 毒素を添加した際 、40%の割合
91 の細胞が膨潤し い 様子が観察さ た (Fig. 30H)
各受容体を発現させた培養細胞の感受性 イコ 幼虫の感受性の関係性を調 目的 、実際 イコ 幼虫の感受性試験を行った ト シン っ 活性化した Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Fa、Cry8Ca、Cry3Bb毒素を人工飼料中 練 こみ、
イコ 幼虫 供試した後、2 日後の死亡個体数を計測し、��50を算出した その結果、
BmABCC2_S BtR175共発現細胞 対し 高い活性を示した (Fig. 30D) イコ 活
性のあ 報告さ きたCry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1FaのLC50値 、そ 、 0.45、0.26、1.5、1.1 µg/ g diet あった(Table 6) また、既 述 た う 、こ の毒
素 い もCry8Ca 先行研究 一般的 投与濃度 おい イコ 対す
活性が見 いこ が報告さ い (Ohba et al. 1992; Donovan et al. 1992) し し、
本実験 Cry8Ca2 µg/g diet 投与し 2日間観察した こ 、死 個体 出現し
ったものの、顕著 摂食阻害が観察さ た(data not shown) そこ 、 高濃度の毒素 試験 個体死が観察さ こ を期待し、大量のCry8Ca毒素の前駆体を用意し
、次 その毒素前駆体を用い 再度試験をおこ った 73 µg/ g diet のCry8Ca毒素 前駆体を供試し、同様のバイ アッセイを行った こ 、2 日後 30 中5 の個 体が死亡した (Tabale 6) す わ 、こ ま Cry8Ca が イコ を す ョ ウ目昆虫 対し 活性を持た い さ いた見解 間違い あ こ が明
った また、この結果 Cry8CaがBmABCC2_S BtR175共発現細胞 対し い が も細胞膨潤活性を示したこ 矛盾が った 一方、BmABCC2_S BtR175の 共発現細胞も感受性を示さ ったCry3Bb毒素 対し 、 イコ 幼虫 4 µg/g diet も感受性を示さ 、Cry8Ca同様、50 µg/g diet いう高濃度の前駆体Cry3Bbを用いた 再試験 おい も死亡個体 こ 摂食阻害す 観察さ った (Table 6) したがっ
、Cry3Bb こ ま の報告通 イコ 対し 活性を持た いこ が確
た また、BmABCC2_S BtR175-TBRの共発現細胞が反応を示すCry1Aa、Cry1Ab、