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BmABCC2_S+234Y を導入したウイ ス、AcNPV-BmABCC2_S +234Y を 作出した (Fig.
12A) このウイ スを感染させたBmABCC2_S+234Y発現Sf9細胞の感受性を評価した
こ 、Cry1Aaを100 nM添加した際 膨潤した細胞が見 たの 対し 、Cry1Ab、
Cry1Ac毒素 い 、そ が500 nM も反応した細胞 観察さ った (Fig.
12B, Upper) す わ 、BmABCC2_S+234Y発現Sf9細胞 Cry1Aa 毒素 対し 感受
性を保っ いたが、Cry1Ab、Cry1Ac毒素 対し 抵抗性 あった 次 、BmABCC2_R
の234位のTyrosineを 除いた BmABCC2_R-234Yを作製し組換え型バ ュ ウイ
ス AcNPV-BmABCC2_R-234Y を作出し た(Fig. 12A) こ のウ イ スを 用い
BmABCC2_R-234Y発現Sf9細胞を作 その細胞の感受性を評価した こ 、100 nMの
Cry1Aa 反応す 、BmABCC2_R発現細胞 感受性を示さ った500 nM
のCry1Abお び100 nM のCry1Ac も反応し膨潤した細胞が観察さ た (Fig. 12B,
Lower) こ のこ 234位の シンの増加 BmABCC2の細胞 対す Cry1A
毒 素 感 受 性 付 与 能 力 重 要 影 響 を 与 え 部 位 あ こ が 示 唆 さ た ま た 、 抗 Cry1Aa抗体を用い 免疫染色を行い、BmABCC2_S+234Y及びBmABCC2_R-234Y発現細
胞表面上 Cry1Aa, Ab毒素が結合また 細胞膜 刺さっ い 状態が検出 き を
確 た BmABCC2_R-234Y発現細胞 、比較的EGFPの発現量の多い細胞 おい
両毒素が細胞表面 検出さ た Fig. 13 一方 、BmABCC2_R+234Y発現細胞 おい
、Cry1Aa毒素のみが細胞表面 検出さ た (Fig. 13) このこ 、BmABCC2_R
み たBmABCC2_S １残 多く存在す 234位の シン BmABCC2_R
Cry1Ab毒素の相互作用 悪影響を及 し い こ が示唆さ た
2.3.3 BtR175がSf9 与え 感受性付与能力のBmABCC2 の比較
Cry毒素活性 対す 生理的 機能が報告さ きたBtR175 (Nagamatsu et al. 1999;
Hara et al. 2003) の 細胞 対 す 感 受 性 付 与 能 力 を BmABCC2 比 較 す 目 的 、
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BtR175を完全長 (BtR175-full) もしく Cry1Aa結合領域BtR175-TBR
(Nagamatsu et al. 1999) し 導入した AcNPV あ 、AcNPV-BtR175-full 及び AcNPV-BtR175-TBRを作出し、Sf9細胞 感染させBtR175-full BtR175-TBR (Fig. 14)
を発現させた おAcNPV-BmABCC2の時 同様 ウイ ス感染細胞を識別 き
う す 目的 、こ のウイ ス 同時 EGFP cDNAを導入した 感受性を評価
す 前 、目的分子がSf9細胞表面上 期待通 発現し い こ を確 目的 、 こ の組換えウイ スを感染させたSf9細胞 対し 3 の実験を行った ま 、ウ
エスタン ッテ ン を行った こ 、BtR175-full発現細胞 BtR175-TBR発現細胞
、そ 175 kDa 70 kDaの理論値通 のバン が検出さ た (Fig. 15A
次 、抗BtR175抗血清 ウイ ス感染Sf9細胞 対し免疫染色を試みた その結果、
こ の感染細胞の約 60％が感染マー ー あ EGFP を発現し いたが、その中 もEGFPが強く発現し い う 見え 一部の細胞 おい BtR175血清 染まっ
い こ が認 た (Fig. 15B) さ 、BtR175-TBR発現細胞を ア ヒ
固定した後、Cry1Aaが細胞表面 結合す 否 を検討した 抗Cry1Aa抗血清を用い
た細胞 結合したCry1Aaの検出系 も、BtR175抗血清を用いた免疫染色同様、EGFP
が強く発現し い う 見え 一部の細胞 Cry1Aa毒素が結合し い こ が認
た Fig. 15C こ のこ 、BtR175-TBR発現細胞 Cry1Aa 結合す
性 状 を 保 っ た 形 BTR175-TBR を 細 胞 表 面 提 示 し い 考 え た 一 方 、
BtR175-full発現細胞 関し も膜上の発現が確認さ Fig. 15B 、BtR175-TBR発現細
胞 同様 Cry1Aa 対す 結合性状を保っ い こ が期待さ た
BtR175 が期待通 細胞膜上 正しい分子量 発現し い こ が確認 きたた 、
次 、BtR175 発現細胞の Cry1Aa 毒素 対す 感受性を評価した ま 、BtR175-TBR
発現細胞 Cry1Aa、毒素を500 nM う 添加し、細胞の形態変化を経時的 観
察した こ 、毒素添加 20 min経過時 EGFPマー ーを多量 発現し い
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BtR175発現細胞特異的 膨潤が観察さ 始 、60分後 さ 多くのEGFP陽性細
胞 膨潤が見 た (Fig. 16) し し、さ 6時間後ま 観察を続けたが、EGFP陽
性細胞の膨潤の程度 60 分後の観察 ほ 変わ 、BmABCC2発現細胞の場合
違っ 破裂す 細胞 ほ 見 った(data not shown) 次 、BtR175-full発
現細胞 Cry1Aa 、Cry1Ab、Cry1Ac毒素を添加し、60分後のそ の形態変化を位
相差顕微鏡 観察した こ 、Cry1Aa Cry1Ab 対し 600 nM 膨潤す 細胞
が観察さ たが、Cry1Ac 対し 600 nM も膨潤細胞 観察さ った(Fig. 17A)
一方、BtR175-TBR発現細胞 Cry1Aa、Cry1Abお びCry1Ac 対し、そ 150 nM, 150 nM, お び450 nM 以上の濃度 膨潤が観察さ Fig. 17B and Fig. 18A 、3種の
Cry1A 毒素 対し BtR175-full 発現細胞 高い感受性を持 こ が示さ た そこ
、こ 以降の実験 BtR175-TBR発現細胞を用い こ した お、 々が作っ
たBtR175-TBR発現Sf9細胞のCry1Aa 対す 感受性 Nagamatsu が報告し い
BtR175-TBRを発現させたSf9細胞の感受性 ベ やTsuda が報告した完全長BtR175
を発現させた HEK293 細胞の感受性 ベ ほ 同 ベ あった (Nagamatsu et al.
1999; Tsuda et al. 2003)
AcNPV-BmABCC2_S AcNPV-BtR175-TBR 感染したSf9細胞のEGFP発現量
大き 差 認 った(Fig. 8 and 16) し し が 、EGFPを発現し い 細胞
おけ BtR175 BmABCC2_S発現細胞のCry毒素 対す 反応を比較し み 、
BtR175発現細胞 EGFPの発現量が高い細胞のみがCry1A毒素 反応し い の 対
し Fig. 16 、BmABCC2_S 発現細胞 、EGFP発現量が い細胞 もCry1A毒素
対し 明 高い感受性を示し い う 見えた (Fig. 8) す わ 、BmABCC2_S 発現細胞の場合 、 少 いBmABCC2_Sの発現 ベ もCry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac
対し そ 100 pM、10 nM、お び1 nM 感受性を示した したがっ 、BtR175
がSf9細胞 付与す 感受性 、BmABCC2_Sが付与す 感受性 もCry1Aa、Cry1Ab、
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Cry1Acそ 関し 約1000倍、約10倍、約100倍以上 いもの 思わ た (Fig.
11A and 18A) H. virescens おけ Cry1Ac っ 選抜さ た抵抗性系統 も、
ン 様 タ ン ク 質 の 機 能 を 欠 損 し い YFO 系 統 お い 5 µg/ml ベ の
Cry1Ac 感受性を示すの 対し 、ABCC2 分子の機能を欠損し い YEE 系統
50µg/ml ベ の、す わ 10 倍 い感受性を持 こ が示さ い (Gahan et al.
2010) こ のこ 、Cry1A 毒素 対す 感受性を細胞 与え 役割 おい 、
BmABCC2がBtR175 も 大き 意味を持 こ を示唆し い 考え
す 示した通 、BtR175-TBR発現細胞 Cry1Aa、Cry1Abお びCry1Ac 対し、
そ 150 nM, 150 nM, お び450 nM 以上の濃度 感受性を示し、BtR175-TBR 発 現細胞 ３種の毒素 対し 若干の感受性差があ こ が分 った(Fig. 18A) ここ
観察さ た、BtR175が細胞 与え 3種のCry1A毒素 対応した感受性の高さの違
い 、BtR175 こ の毒素の結合親和性の違い 由来す 可能性があ そこ 、
この可能性を確 た 、大腸菌発現型 BtR175-TBR を固定化したセンサー ッ CM5 chipを用い Biacore J 3種のCry1A毒素 BtR175-TBRの結合親和性 い
解析した 12.5 nM 200 nMの5段階 希釈した毒素を用い 解析を行った こ
200 nMの各毒素を添加した際の120秒後の到達反応値 (Resonance Unit, RU) Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Acそ おい 870、200、お び350 RU 、Cry1Aa Cry1Ab、Cry1Ac
のそ 、約4.3倍、2.5倍高い値 あった (Fig. 18 B-D) 一方、結合親和性を示す
各 ーターを比較し み 、KD値 Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Acそ おい 2.87(±1.38)× − M、4.21(±1.24)× − M、3.02(±1.39)× − M あった Table 3 し
たがっ 、BtR175-TBR 対し 解離定数が さい毒素ほ 細胞毒性が高い いう単純
関係性 見 、BtR175-TBRの毒素 対す 結合性の良し悪し以外の未知の他の
要素も細胞の毒素 対す 感受性 影響を及 し い 考え た
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2.3.4 コ ABCC2のCry毒素受容体 し の機能の確認
ここま の実験 、 イコ おい 、BmABCC2がCry1A毒素の受容体 し
機能し、本研究 行った Sf9 感受性を与え 能力を比較す 限 、BtR175 もその能力 高いこ が示唆さ た し し、ABCC2のCry1A毒素 対す 受容体 し の役割の一般性 関し 様々 昆虫種 おい さ 検討さ 必要が残さ
い 一方、コ おい 、一般の系統 比較し Cry1Ac 対し 約300倍の抵 抗性を示す抵抗性が出現したこ が報告さ た (Personal communication) そこ 、コ
おい もABCC2がCry1A毒素受容体 し 機能す 、また抵抗性コ の抵抗
性の原因がABCC2分子の変異 起因す の を調 こ した コ ABCC2
い 、2011年 、Baxter がCry1Ac抵抗性のコ い ン ー マッ ン
解析を行い、抵抗性コ の原因が ABCC2 分子 あ 、細胞膜貫通 イン 12 の 領域 110ア ノ酸の変異があ こ を報告した Baxter et al. 2011 本研究 使用し
たCry1A毒素抵抗性コ い もABCC2のcDNAをク ーニン し、感受性コ
の配列 比較した こ 、翻訳開始点 の位置862位 869位の8 塩 1038 位 1059位の22塩 の 所の欠失 3778位以降ト ンスポ ンの挿入 破 壊が確認さ た(Fig. 19 and 20) す わ 、抵抗性系統のABCC2分子 第5膜貫通領 域の の部分 C 末端部位を失っ い 予想さ た そこ 、感受性、抵抗性
そ のコ 由来のABCC2を発現す AcNPVを作製し、 イコ の場合 同様、
Cry1A毒素 対す 感受性を確 た 感受性コ のABCC2 あ PxABCC2_Sを
発現させ、毒素 反応させた こ 、毒素 反応し膨 い 細胞が観察さ た(Fig.
21) Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac そ 対す 反応性 イコ のBmABCC2_S
異 、そ の毒素を100 nM、1 nM、100 pM以上添加した際 初 膨 い
細胞が観察さ た (Fig. 21) こ の結果 、コ おい も ABCC2 分子が
Cry1A毒素の受容体 し 機能す こ が明 った 一方 、抵抗性型のABCC2
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あ PxABCC2_Rを発現させた細胞 、Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、そ の毒素
を1 µM添加し、60分反応させた場合 も毒素 反応し膨 い 細胞 確認 き
った (data not shown) この う PxABCC2_R発現細胞が非感受性 原因がこ
の 分 子 が 細 胞 膜 上 正 し く 発 現 し い せ い あ 可 能 性 が 考 え た た 、
PxABCC2_S及びPxABCC2_R発現細胞 細胞膜画分を調整し、BmABCC2抗血清の
交 性 を 利 用 し 、 ウ エ ス タ ン ッ テ ン を 行 っ た そ の 結 果 、 細 胞 膜 上
PxABCC2_R PxABCC2_S 同 ベ 発現量し い こ が確認 きた(Fig. 22) 一
方、す 述 た通 、ABCC2遺伝子の異常 H. virescens、P. xylostella、B. mori お
い Cry1A毒素 対す 抵抗性の原因 あ こ が報告さ い Gahan et al. 2010;
Baxter et al. 2011; Atsumi et al. 2013 こ のこ 、ABCC2が ョウ目昆虫 おい
広くCry1A毒素の受容体 し 機能し い こ を示唆し い 考え 一方、
Cry1A毒素抵抗性コ 由来のABCC2 Cry毒素受容体 し 機能し いこ が確認
さ たこ 、個体 観察さ た Cry1A 毒素抵抗性の重要 原因 っ い 可能
性が考え た また、細胞膜 発現し い も わ 、PxABCC2_RがCry毒 素受容体 し 機能し い理由 、ア ノ酸の欠失 PxABCC2_Rの構造が正常の
もの 異 た あ 考え た また、Heckelの報告 あ う ABCC2分子
が Cry 毒素受容体 し 機能す 際 、ABCC2 分子が本来持 ATPases associated with diverse cellular activities domain (以 AAA イン) の働きの結果起こ 構造変換
が必要 あ 可能性が考え こ を考慮す PxABCC2_Rの欠失部位がAAA
イン2の一部 あ た 、PxABCC2_Rの分子の動きが失わ 、Cry毒素受容体
し 機能す こが き く った可能性も考え た (Heckel 2012)
2.3.5 AaABCC2のCry4Aa受容体 し の機能の有無の調査
ABCC2が の範囲の ョウ目昆虫 おい Cry1A毒素受容体 し 機能す