SPR解析 用い 精製したBmABCC2-Flag及びBtR175-TBR-Flagを得 た 、4.2.7 の 方 法 DDM 可 溶 化 し た 膜 画 分 を 0.22 µm の フ タ ー ニ ッ ト(Millex-LH， Millipore)を通過させたものを用いFlag-tag精製をおこ った ANTI-FLAG M2 Agarose Affinity Gel (sigma)の ト コ ー 従 い 精 製 を 行 っ た 溶 出 、3ェFlag
(sigma) を用い 行い、PBST 透析す こ を 除いた
4.2.9 銀染色
4.2.8 Flag-tag 精製したサン を 10％ポ アク ア を用いた SDS－
PAGE っ 分離した SDS-PAGE後の 、銀染色 ット Wako の トコー
従い染色した
4.2.10 ウエスタン ッテ ン
そ のBmABCC2変異体を発現させ た のAcNPVを感染させ、組換えウイ
ス由来のタン クを発現させたSf9細胞 第2章 2.2.13 同様の手法 調整した膜画 分をサン し 用いた 以降の操作 、第2章 2.2.9 同様の方法 行った
4.2.11 SPRを用いたBtR175及びBmABCC2 Cry1A毒素の結合性状の解析
4.2.7の要領 調整した膜画分また 、4.2.8のFlag精製の過程を経 精製さ た膜タ
ン ク質 、pH 4.0の10 mM 酢酸アン ニウ 4分の1量 (w/v) う添加し
118
CM5センサー ッ (GE Healthcare) ア ン ッ ン 法 固相化した Cry毒
素 の相互作用解析及び結合 ーターの算出 、第 2 章 2.2.12 同様の方法 行 った
119
第3節 結果 考察
4.3.1 BtR175-TBR及びBmABCC2のCry毒素 の結合動態の解析
本章の第一節 既 述 た通 、BmABCC2がCry毒素結合分子 あ 言え 証拠
、未 示さ い い し し が 、BmABCC2がCry毒素が細胞膜 刺さ 孔を
形成す のを 進す 受容体分子 あ こ 第2章、第3章 示した結果 明 あ 、その受容体機能を発揮す た BmABCC2 必 Cry 毒素 結合した瞬
間を持 あ 第2章2.3.2. BmABCC2_R-234Y発現培養細胞 おい Cry毒素
が検出さ た結果 Fig. 13 、Cry毒素 BmABCC2が結合したこ を意味す 考
え し し が 、4％ PFA 細胞を固定(細胞膜の流動性を失わせ ) 明
BmABCC2 結合す Cry毒素の量が減少したこ (Fig. 40)、第2章 2.3.2. みた
BmABCC2_R-234Y の発現培養細胞表面 検出さ たCry毒素 Fig. 13 、一 の仮説
し 膜 刺さっ い 状態を意味す 可能性があ こ が考え えた この う 、
細胞表面 の BmABCC2 Cry毒素の結合 いう状態が検出さ くい原因 し 、
BmABCC2 Cry毒素 確 結合す ものの、解離が非常 早く結合し も瞬時 解
離し しまう可能性、また 、Cry毒素 の結合段階自体が瞬時 あ 、結合した す 膜 刺さ 可能性が考え えた そこ 、結合を ア タイ え こ が
き SPR 表面 ン共鳴 解析 あ 、BmABCC2 Cry毒素の結合動態を解
析 き 考え、BtR175-TBR、BmABCC2 そ を発現させた培養細胞の膜画分
Cry毒素 の結合解離動態を Biacore を用い 解析す こ した 精製した膜画分
十分量のBtR175-TBR及びBmABCC2が含ま い を確認す た 、銀染色を行っ
たが、 がそ の分子 質量が一致す が 明 あ 、そ の分子 由来
す 考え バン 識別 き った (data not shown) し し が 、同サン
を 用 い ウ エ ス タ ン ッ テ ン を 行 っ た こ 、 両 分 子 の 存 在 が 確 認 さ
(Fig.41)、そ の抗体の力価を 推察す 少 く も膜画分懸濁液 1 ng/ µl
120
以上のBtR175-TBRまた BmABCC2を含 溶液 し 調整 き い こ が分 った
そこ 、さっそく Biacore を用いた SPR 解析 進み、センサー ッ 各固相化し、
Cry1Aa 毒素 の結合解離動態を解析した EGFP、BtR175-TBR、BmABCC2 発現細胞
の膜画分を固相化したそ のセンサー ッ 対し Cry1Aa毒素を200 nM、400 nM 添加し、センサー ッ 結合したCry毒素の量を示すセンサ を得た ネ
テ コント ー し 用いたEGFPを単独 発現した細胞 、結合した絶対量
、50 RU以 非常 少 く、Cry1Aa毒素のBiacoreの流路への添加を終了し毒素を
含ま い緩衝液 置換す 120 秒を過 急漓 結合量が落 、緩衝液への置換後 240秒間 、結合した毒素のほ が解離す こ を意味す センサ が得
た(Fig. 42) こ 対し、BtR175及びBmABCC2区 、毒素の添加後 EGFP区
も明 大き 反応値がえ 、毒素の添加が終了し もそのほ が が こ く、多くの毒素分子が お結合状態 あ こ を意味す センサ が得 た
(Fig. 42) こ の結果 、Sf9細胞膜画分 も も Cry1Aa毒素 結合性を持 分
子が存在す こ 、 っ 全 の膜画分 Cry1Aa毒素 弱い相互作用のバック ウン が存在す こ を示すもの 思わ た また、BtR175 BmABCC2の発現細胞
の膜画分 おい 、BtR175 お びBmABCC2 Cry1Aa毒素の相互作用分の上積み
が フ 表 お 、さ そ の結合の多く バック ウン 見 た結合 違っ 解離し くい性状のもの あ こ を意味す 考え た 一方、結合親 和性を示す各 ーターを比較し み 、KA、KD値 そ 、BtR175が1.12×107 8.97×10-8 あ 、BmABCC2 5.61×107 1.78×10-8 RU あ Table 7 、ほ 同
値を示した この結果 、期待し いた う 受容体 し の機能の違いを説明
き BtR175 BmABCC2の結合性状の違い 見え こ った し し、本来見え
き結合解離の動態の特性がバック ウン 埋も 分 くく っ い 可能性が考え えた
121
そこ 、次 、BtR175-TBR BmABCC2 Flag-tagを付加し、Flag-tag精製 そ を粗精製し センサー ッ 固相し、再度解析を試み こ した ま 、C 末端 Flag-tagを付けたBtR175-TBR-Flag及びBmABCC2-Flagが受容体 し の機能を 保持し い を見 こ 、tag を けたこ 機能の欠損が起こっ い い を確 た BtR175-Flag及びBmABCC2-Flagを発現させたSf9細胞 500 nMのCry1Aa 毒素を添加した こ 、毒素 反応し膨 い 細胞が観察さ (Fig. 43)、こ の tag 無し分子を発現させた細胞 同程度の感受性を持 こ が確認さ た す わ 、 tagを付加し もCry毒素受容体 し の機能 保持し い こ が確認 きた そこ
次 、こ の分子のFlag-tag 精製を行い、ウエスタン ッテ ン 確認
した こ 溶出区 目的の分子のバン が認 (Fig. 44 and 45)、さ そ の位
置 銀染色 バン が確認 きた(Fig. 46) こ の結果 、今回調整製した膜タン
ク質 、SPR解析 値す 精製度 あ 、溶液中 含ま そ のタン ク質の 濃度 、ウエスタン ッテ ン の結果を 少 く見積もっ も10 ng/ µl あ こ が推定さ た そこ 、そ の精製したタン ク質をセンサー ッ け、
Cry1Aa毒素 の相互作用を解析した その結果、未精製の膜タン クを用いた場合200
nMの各毒素を添加した際の120秒後の到達反応値 (Resonance Unit, RU) 、BtR175-TBR、 BmABCC2両者 もお そ100 RU あったの 対し (Fig.42)、今回 、250 RU 500 RU
あ 、反応値があが 、バック ウン 打 消さ 結合特性が解析 き 期 待 きた し し が 、結合親和性を示す ーター 、BtR175-TBR BmABCC2 そ 、KAが4.74ェ108、3.30ェ108、KD 4.97ェ10-9、4.93ェ10-9RU あ 、期 待し いた う 受容体 し の機能の違いを説明 き 大き 違い 見 っ
た (Table 8) 今回の反応結果 算出した結合親和性を示す ーター いうの 、
解離の特性 、1:1 binding を適用 き もの そう いものがあ も関わ
、無理や 当 出た結果 し い ま 、BtR175 い も、BmABCC2
122
い も1:1 binding が適用 き い例を見 い 可能性があ APN1 Cry
毒素の結合動態 迫ったいく の先行研究 報告さ たセンサ 、結合の後
時間経過 共 解離がみ 、1:1 binding が適応さ 1 例 あ 言え
(Jenkins et al. 2000; Lee et al. 2001; Jenkins and Dean, 2001)(Fig. 48) 一方 、今回BtR175
及 び BmABCC2 い 得 た セ ン サ 、 解 離 が ほ 観 察 さ 、
1:1binding が適用さ 考え APN1 比 解離が極端 緩や あ
(Fig. 47) このこ 、こ 2分子 Cry毒素 の間の結合 、 マー化し
た分子が多点結合す こ 生 効果やその他の何 の理由 固定化した分子 解離 き く 効果の影響を受け い こ が想像さ す わ 、 ン タン ク質 のCry毒素の緩や 解離 Cry毒素の多量体 ン様タン ク質が多点 結合す こ 生み出さ 、抗体が2価 結合す 際 一般的 み
avidity効果をみ い もの 考え (Fig. 48) もしそう 、1:1 binding
当 う す 行 が間違っ お 、この 当 算出した結合親和性 を 表 す ー タ ー(KD や KA)の 示 す 値 何 の 意 味 も い こ 一 方 、
BmABCC2のセンサ も解離曲線の傾きが非常 緩や あ (Fig. 47)、1:1binding
当 い相互作用 あ 疑問がもた し し が 、PFA固定 細胞 結合した毒素が免疫染色 検出さ た結果 (Fig. 40)や、先行研究 おい 今ま 一度も結合対象 し 報告さ こ ったこ を考慮す 、この緩や 解離
ンタン ク質 同様の マー化 依存す avidity 効果をみ い 考え
くい また、センサ の形状を く見 み 、Cry毒素の添加が終了す 120
秒付近 、BtR75 、見 い急漓 解離が起こっ い こ が分 (Fig. 47)
400 nMのCry1Aa毒素添加時 毒素添加終了(120秒地点) 約10秒間の間 結合し
た毒素の全体量の約3分の1程 あ 約200RUの毒素が解離し い (Fig. 47) このこ
、Cry1Aa毒素 BmABCC2の結合 瞬時 解離す う 結合成分が含ま い
123
、換言す Cry1Aa毒素 BmABCC2 対し 解離しやすい相互作用の状態をも
こ を意味す の もし い (Fig. 48) そし 、そ 引き続きみ 一見avidity
く似た非常 緩や 解離 、培養細胞の系やアフ ツ エ の系 み きた
う BmABCC2を足場 Cry毒素が脂質膜 刺さ 、あ い BmABCC2分子
Cry1Aa 毒素が解離 き い状態 あ こ を意味す の もし い 実際、今回セ
ンサー ッ 固定化したABCC2分子の膜貫通領域 疎水部位 両親媒性の物質 DDMが結合し お 、そ 細胞膜表面の脂質二重層の代わ の役を果たし い
緩や 解離を生 理由 Cry 毒素が脂質膜 刺さったこ あ 可能性 否定 き
い (Fig. 48) この う 、今回得 たBmABCC2 Cry毒素の結合をみたセンサ
、 ン様タン ク質 Cry毒素の間 見 う 、複数の異 様 式の結合の総和を意味し い 可能性があ し し同時 、最も重要 こ 、この
センサ が確 Cry 毒素 BmABCC2 の間 結合 いう段階があ こ を示
すもの あ 点 あ
こ 、センサー ッ 上の BmABCC2 の周囲 本来このト ンスポーター分 子 予想さ 廃棄さ 対象 分子 も、このト ンスポーターの構造変換を 駆動す ATPも存在し い っ 、センサー ッ 上のBmABCC2 開口部位を閉
た状態 あ 予想さ 、本研究 得 た ータ 、Cry1Aa 毒素が開口部位を閉
たままの BmABCC2 を利用し 膜 刺さ こ を意味す 可能性があ このこ
、今後 さ 異 実験系を用い 確認さ 必要があ
4.3.2 細胞外 ー 領域2近傍がCry毒素 の結合領域 あ 可能性の検証
ここま の結果 、BmABCC2 Cry毒素 確 結合す こ が示さ たた 、
次 、BmABCC2の の領域がCry毒素 実際 結合す の さ 詳細 調 こ
した そこ 、ま 、本研究 BmABCC2 を受容体候補分子 し 扱うきっ け
124
った細胞 ー 領域の 234 位の変異 着目した 既 述 た通 、2012 年、渥美
っ 7 系統の Cry1Ab感受性 イコ 10 系統の抵抗性 イコ の間 み た
Cry1Ab感受性の違いが、BmABCC2分子の細胞外 ー 領域の2の234位への シ
ンの挿入 起因す こ が示唆さ た (Atsumi et al. 2012) また、第2章 、この234 位のア ノ酸挿入変異が確 、Cry1Aa Cry1Ab、Cry1Ac の間 み 感受性の 違いの原因 っ い こ をBmABCC2_S+234Y BmABCC2_R-234Yの2種類の変異 体を培養細胞 発現させそ の Cry1A 毒素感受性の違いを見 こ 証明し
た(Fig. 12) この う 、234 位の シン挿入 、少 く も Cry1Ab、Cry1Ac が
BmABCC2 結合す こ 影響を与え、細胞外の ー 領域 あ こ 、234位
の近傍が少 く もCry1Ab、Cry1Ac っ のBmABCC2上の結合領域 あ 可能性
が考え た そ を検証す た BmABCC2_S の細胞外 ー 領域 2 のア ノ
酸をア ニン 置換したア ニン置換変異体を 2 種類作出した 作出した Y233お び
234IS235をそ ア ニン 置換した変異体 対し Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Acそ
の毒素を50 nM, 500 nM,の2濃度 添加し、毒素 対す 反応を調 た その結果、
2 種 類 の 変 異 体 発 現 細 胞 、 生 型 あ BmABCC2_S 発 現 細 胞 同 ベ Cry1Aa,Cry1Ab, Cry1Ac毒素全 対し 反応がみ た (Table 9 and Fig. 49) このこ
、 ー 領域 2のア ノ酸 変異を入 も影響が いこ が明 った す わ 、 ー 領域 2 近傍の配列が BmABCC2 直接相互作用す 領域 い
あ う 考え えた Fig. 51
4.3.3 細胞外 ー 領域2 挿入さ ア ノ酸の種類の影響
細胞外 ー 領域2が、期待し いた う Cry毒素 の直接的 結合領域 い
が、234 位の シン挿入 、Cry1Ab、Cry1Ac 結合 き く いう現象が
起こ の 迫 こ 、Cry毒素 BmABCC2の結合領域を知 手が を得 こ