Cry1Aa1 (AA22353) 毒素 い 、第1章2節 (2.2) 使用したもの 同様の組換
え型大腸菌を用いた Cry1Ab8 (AAA22551) 毒素のDNA配列 、Atsumi et al. (2005) 使 用 さ た Cry1Ab8 の DNA 配 列 が 組 み 込 ま た ス DNA を 鋳 型 5´tcaatCCCGGGacatggataacaatccgaacatc3´ 5´gtccaatgctGCGGCCGCttattcctcca の イマ
ーを用い PCR反応 増幅した 獲得したDNA配列 、pGEX4t-3ベクターのSmaI
NotIのサイト 組み込 Cry1Fa毒素 い 、Fentes et al. (2006)の記載通 活性化、精製さ たタン ク質をDr. Jurat-Fuentes 分与いた いたものを用いた Cry1Ac(AAA22331)毒素のcDNA配列 、B. thuringiensis HD-73の ス DNAを鋳
型 5'-gcaaGTCGACatggataacaatccgaacat-3' and 5'-atcGCGGCCGCctattcctccataaggagt-3'
イマー PCR反応 増幅した 獲得したDNA配列 、pGEX-4t-3ベクター
のNotI SalIのサイト 組み込 獲得したcDNA配列 pGEX-4t-3のNotI SalI
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のサイト 組み込 Cry9Aa毒素の配列 、Bacillus genetic stock center 寄せ
た Cry9Aa 遺伝子配列を組み込 pSB1402 ス (BGSC No. ECE130)を鋳型
5’-ACGCgtcgacATGAATCAAAATAAACACGG-3’
5’-CGTgcggccgcTTACTTTTCTGTTTCAACG-3’の イマーを用い PCR反応 増
幅し、pGEX-4t-3ベクターのNotI, SalIサイト 組み込 Cry毒素遺伝子を組み込
pGEX-4t-3ベクター 、大腸菌株BL21 形質転換し第1章、2.2 同様の方法 大
腸菌を培養し、Cry毒素の封入体を精製した 精製し、200 mM Tris-HCl (pH8.3) 透析 したCry毒素前駆体タン ク質 、終濃度 0.2 mg/mlのト シンを加え37℃ イン ュベートす こ 活性化した 活性化し凝集したタン ク質 、28,933 g, 10 min, 4 ℃の遠心分離 っ 沈殿 し 回 し、PBS 3回洗った後、再びNaOH 可溶化
し、PBS 透析した PBS 透析したタン ク質 、 ンシト ト ー法 濃度を 定量し 用いた Cry9Da2毒素 、Sinkawa et al., (1999) 記載さ い Cry9Da2のみ を産生す B. thuringiensis japonensisis株(AF032733, genebank)を培養し、同論文 あ 2 層分配法を用い 精製した毒素を他の毒素 同様の方法 活性化、定量したものを用い た(Sinkawa et al. 1999)
2.2.5 LDHアッセイ
Sf9細胞 そ のAcNPVを感染させ、72時間、25℃ イン ュベートした 細
胞 、PBS 洗い、96 well ート 播種し、Cry1Aa 毒素を添加し、25℃ １時間
イン ュベートした イン ュベート後の細胞 、Cytotoxicity Detection KitPLUS (Roche) の トコー 従い、放出さ た乳酸脱水素酵素 (Lactate Dehydrogenase; 以 LDH) を ート ー ーを用い 測定した
2.2.6 細胞傷害率の算出
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Sf9細胞 そ のAcNPVを感染させ、72時間、25℃ イン ュベートした 細
胞を回 し、細胞の懸濁液を バー ス上 各100 µl添加し、静置させ こ 細胞 を バー スへ貼 付けた 細胞を貼 付けた バー ス 、PBS 洗い死細胞や 活 力 を 失 っ た 細 胞 を 除 去 し た 後 、Cry 毒 素 溶 液 を 入 た 2 穴 の ス イ ス
(Matsunami) 細胞を接着させた面がCry毒素溶液 触 う 向き 被せた ス
イ ス 、60 分 25 度 イ ン ュ ベ ー ト し 、 蛍 顕 微 鏡 (BX50 Olympus light microscope) 、BX-FLA epifluorescence unit (Olympus) を用い 観察した 細胞傷害
率 、1視 中の膨潤した細胞の割合を算出す 操作を5視 分行いその 均値を用い 計算した
2.2.7 抗血清の作製
BtR175抗血清を作製す た の抗原 、Hara et al.(2003) 使用さ たBtR175の毒素
結合領域 TBR を発現す 大腸菌 発現させたタン ク質を用いた BmABCC2抗血 清を作製す た の抗原を作製す た 、本章 2.2 作製した pBAC4x-1-EGFP
BmABCC2_S の 配 列 を 組 み 込 を 鋳 型
5’-GCAAgtcgacTCGTTGGAACGCATTCAAAA-3’
5’-ATCgcggccgcTTTCACTGCAGACAAATAC-3’の イマーを用い PCR 反応を行っ
た 増幅したPCR断片 、pGEX4t-3ベクター SalI、NotIサイトを用い 組み込 組換えた ス 、大腸菌株BL21 形質転換し、第1章2.2 同様の手法 タン
ク質を生産させ、封入体を精製した 精製した封入体 、 422 エ クト エ
ューター(Bio-Rad)を用い エ クト エシューション法 目的タン ク質の断
片を切 出し、PBS 透析し、濃度を定量し、抗原タン ク質 した BtR175 抗血清
を得 た 、抗原タン ク質をJcl:ICRマウス6終齢雌個体 5回免疫し、全採血し、
一晩4℃ 静置した後、2,290 g、 10 min の遠心分離操作を行った上清を抗血清 し
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用いた 抗血清 0.005%ア 化 ト ウ 終濃度 50％の セ ー を加え －
20℃ 保存し以後の実験 用いた BmABCC2抗血清 い 、マウス ウサ の両 方を作製した マウス血清 、BtR175 同様の方法 作製した ウサ 抗血清 、株 式会社 蛋白精製工業 外注し、作製さ たものを用いた
2.2.8 BmABCC2変異体発現細胞表面上の毒素の染色
Sf9上 発現させたBmABCC2_R-234Y BmABCC2_S+234YのCry1Aa, Cry1Ab結合能 を 調 た 、 そ の 組 み 換 え 型 AcNPV を 感 染 さ せ た 細 胞 、 NoStickHydrophobic Microtubes (Scientific Specialties Inc., Lodi, USA) 回 し、PBS 細 胞を洗った そ 20 mM Cry1Aaもしく Cry1Ab 10分間室温 反応させ、4%PFA 10分間固定した 固定した細胞 、PBS 3回洗い抗Cry1Aaウサ 抗血清 16時 間 4℃ 反応させ、PBS 3 回洗った後 、Alexa 594-conjugated goat anti-rabbit IgG (Molecular Probes, Eugene, OR) 1時間室温 反応させPBS 3回洗った後、封入し、
2.6 記載した顕微鏡 観察した
2.2.9 ウエスタン ッテ ン
2.2.6 同様の手法 そ のAcNPVを感染させたSf9細胞 、1.5 ml ュー
回 し、PBS 3回洗った後、SDS-PAGE sample bufferを加え煮沸し、SDS-PAGEのサ
ン した SDS-PAGE の操作 、10%ポ アク ア を用い 分離し、
分離後の PVDF膜 Perkin Elmer Life Sciences 転写した タン クを転写した
PVDF 膜 、5%ス ク/TNT 1 時間、室温 振盪し が ッ ン し、
BtR175 抗 血 清 を 添 加 し 、1 時 間 、 室 温 振 盪 し た 2 次 抗 体 horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse IgGを用い、バン 、Immobilon detection system (GE Healthecare)を用い 検出した
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2.2.10 免疫染色
発現細胞上のBtR175-TBR BtR175-fullの免疫染色 以 の う 行った 2.6 同 様の手法 そ のAcNPVを感染させ培養した細胞 、MAS-GP type A Micro slide
glass上 播種した 4％PFA/PBS 10分間固定した後、抗BtR175マウス抗血清を添加
後、16時間、4℃ イン ュベートし、PBS 3回洗った 2次抗体 、
Alexa-555-conjugated-anti-mouse IgG (Molecular Probes) を用い、1時間室温 反応させた 後封入し、2.2.6 記載した蛍 顕微鏡 観察した
2.2.11 BtR175発現細胞表面上の毒素の検出
Cry1AaのBtR175 対す 結合能を調 た 、2.6 同様の手法 、BtR175を発現
させたSf9細胞をMAS-GP type A micro slide glass (Matsunami) 播種し、4%PFA 固 定した PBS 3回洗った後、10 nM のCry1Aa 毒素 16時間4℃ 反応させ、抗Cry1Aa ウサ 抗血清 1 時間反応させた PBS 3 回洗った後、Alexa 594-conjugated goat anti-rabbit IgG (Molecular Probes) 1時間室温 反応させ、封入し、2.2.6 記載した蛍
顕微鏡 観察した
2.2.12 SPRを用いたBtR175 Cry1A毒素の結合性状の解析
大腸菌 発現させたBtR175-TBRの封入体の精製、可溶化 、Hara et al. (2003) 同様
の方法 行った 精製したBtR175 pH 4.0の10 mM 酢酸アン ニウ 終濃度 50 µg/
ml う 希釈し、CM5センサー ッ (GE Healthcare) ア ン ッ ン 法
固相化した Cry1A毒素 そ 各70 µl う PBST 希釈し5濃度
用意し、BtR175-TBRを固相化した CM5 センサー ッ 120 秒間イン クト
した 解離曲線を得 た 、Cry1A毒素溶液 PBST buffer 切 替え240秒間記
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録を った 反応曲線 、1:1 Langmuir binding modelを使った ーバ フ ッテ ン
を行い、結合速度定数 (ka) 及び解離速度定数 (kd) を算出した また、センサー
ッ の再生 、40 µlの5 mM NaOHを用いた
2.2.13 膜画分の調整
25 cm2の培養フ スコ (Orange scientific) コンフ エント 状態のSf9細胞を滅菌
した100 mlの 角フ スコ 30 mlの培地 共 移し、そ のAcNPVを30
µl添加し25 ℃ 72時間振盪培養した 細胞 PBS 2回洗い、
Complete Protease Inhibitor Cocktail (Roche) を添加したPBS 5 ml 懸濁後、氷上
イ ーを用い 3000 rpm 破 した 細胞の破 液 、5000 rpm、10 分、4℃ 遠心分離し、上清を回 した 回 した上清 、新しい50 mlの遠沈管 移し16,000 rpm、 4℃、40 分の遠心分離操作 膜画分を沈殿させた 上清を除去した膜画分 １% n-dodecyl-β-D-maltosideを含 PBSを加え1時間、4℃ ーテーター上 攪拌し、16,000 rpm、20分、4℃の遠心分離操作後の上清を可溶化した膜画分サン し 使用した
44 第3節 結果 考察
2.3.1 イコ ABC transporter C2 (BmABCC2) のCry毒素受容体 し 機能の確認
ま 、Cry1Ab 感 受 性 の イ コ B. mori Ringetsu (Rin) 由 来 の BmABCC2
(BmABCC2_S) をSf9細胞表面 発現させ、受容体 し 機能す を確 た 実験
を行う前 、EGFP発現Sf9細胞のCry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac 対す 応答を観察した
こ 、1 µM の高濃度 も応答 見 った (Fig. 7) こ 対し、BmABCC2_S
を発現させた細胞 Cry1Aa を100nM添加す 、20分後 EGFPを共発現し い
こ BmABCC2_S が発現し い 考え 細胞が毒素の傷害を受け、膨潤
し い 様子が位相差顕微鏡 観察さ た また、毒素添加 60分後 さ 多くの膨 細胞が観察さ (Fig. 8)、その後膨 細胞 破裂した BmABCC2_S
発現細胞 Cry1Ab、Cry1Acを100 nM添加し、経時的 観察した際 も同様の反応が
み た (data not shown) 次 、Cry1A毒素 っ 傷害を受けた細胞の割合を定量
す た 、BmABCC2_S発現細胞 Cry1Aa毒素を用い 、毒素 っ 傷害を受け
た細胞 放出さ LDHを測定した Cry毒素濃度依存的 反応曲線 得 たが、
ウイ ス感染 っ 弱った細胞のバック ウン 値が高く 出 こ 毒素 対 す 反応性の違いを議論す の 適した 精度の高い反応曲線が け いこ が 分 っ
た (Fig. 9) そこ 、LDHアッセイ 代わ 細胞傷害率の定量法 し 、PBS ウ
イ ス感染 死 細胞を洗い 流す効果を含 バック ウン を抑え こ
が期待 き Cell swelling assayを行うこ した BmABCC2発現細胞 、様々 濃度
の3種類の異 Cry1A毒素を添加し、60分後の観察を行った こ 、Cry1Aa、Cry1Ab、
Cry1Acそ 100 pM、10 nM、1 nM以上添加した際 、毒素 傷害を受け膨
い 細胞が観察さ た (Fig. 10 and 11A) また、50%の細胞が膨 毒素の度 、 Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Acそ い お そ0.8 nM、80 nM、8 nM あった (Fig.
11A)
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