Morphineはアヘンの主成分であり、アヘンアルカロイドの10% 以上と最も多量に含
まれる。強い鎮痛、鎮痙、鎮咳および止瀉作用を有し、癌性疼痛、手術痛、内臓痛など の激しい疼痛に用いられている。非常に重要な鎮痛薬として紀元前から現在でも未だ頻 繁に使用されている。しかし、morphine などopioid 系鎮痛薬には連用による耐性、薬物 依存性が形成されやすく、呼吸抑制などの副作用が知られる。臨床では、morphineの投 薬が1回限りで終ることはほとんどなく、連続的あるいは間欠的に繰り返し投与され、
強度の耐性や精神および身体依存が形成されるため、その使用には、大きな制限がなさ れている。また、morphineおよびその誘導体であるheroineの乱用により引起す身体的重 度な依存、中毒ひいては致死のケースが近年増加の一方を辿っている。身体依存を形成 した後、急に休薬すると、震顫、不安、不眠、痙攣、発汗、鼻汁、流涙、発熱、血圧上 昇、頻脈、散瞳、下痢、腹痛、嘔吐など多彩な禁断症状が発現する。Morphineによる副 作用には、基本的にopioid受容体拮抗薬であるnaloxone投与により消失するが、同時に 主作用である鎮痛作用も減弱されるため、morphine過量投与による呼吸抑制など生命の 維持が脅かされない限り、対症療法的に副作用を軽減させる処置が望まれている。そこ で、中国において古来からmorphineの解毒に使用され、今だ薬理学的解明がなされてい ない金牛草のmorphineに対する作用を検討し、その有効性を検討した。
まず、金牛草の80％ MeOHエキス (PT-E) を使って、morphineの主作用である鎮痛作 用に対する金牛草の作用、また副作用であるmorphineの依存や耐性、更にはmorphine による自発運動量の増加、空間記憶障害に対する作用を、マウスを用いて行動薬理学的 に検討した。また、学習や記憶には、脳内アセチルコリン神経系が重要な役割を担うこ とが知られていることより、中枢アセチルコリン神経系に対する金牛草の作用を、ムス カリン受容体作用薬であるoxotremorineにより誘発される振戦を指標に検討した。さら に、金牛草の作用メカニズムを明らかにするため、morphine血漿中濃度に対する金牛草 の影響について、薬物動態学的な検討を行った。
第1 節 サンプルの調製
本章では金牛草の80％ MeOHエキス (PT-E) がmorphineの各種の薬理作用の影響に 対してマウスにて行動薬理学的な研究を行う。そのため、まず、金牛草のエキスの調製 を行った。
小金牛草1.5 kg、95% EtOHを用いて還流抽出、エキス198.4 gを得た。それを適量の hexaneにて還流して、 hexane可溶部 (148 g) とhexane不溶部 (49.5 g) に分けた。hexane 不溶部はDiaion HP-20カラムに付し、H2O→30% MeOH→50% MeOH→80% MeOH→ MeOHにて漸次溶出して、80% MeOH流出部 (18.4 g) を得て、サンプルとした。
次に、下記の条件により金牛草80% MeOHエキス (PT-E) のHPLCプロフィールを作 った(Fig. 13)。単離した各種の化合物を、Telephiose A, B, C, D (1, 2, 3, 4)、 ならびに Isomangifelin (9), 3-O-β-D-glucopyranosyl quescetin (10) を対照とした。
F ig .1 3 . HP LC P ro fi le o f 8 0 % M eO H Ex tr ac t ( P T -E) f ro m P . te le p h io id es
Pump: L-6200 (Hitachi) Detection: λ270nm; L-4000 UV (Hitachi) Column: YMC-ODS 150×4.6 mm 5µm Solvent: A CH3CN/H2O/TFA=20:80:0.05; B CH3CN /H2O=80/20 (v/v) gradient: A 100~75% B 0~25% Flow rate: 1ml/min Column temperature: 40°C 1. Isomangiferin 2. 3-O-β-D-Glucopyranosyl quescetin 3. TelephioseC 4. TelephioseB 5. TelephioseA 6. TelephioseD1 23 45
6
10 15 20 30 35 40
25
5
0
F ig .1 3 . HP LC P ro fi le o f 8 0 % M eO H Ex tr ac t ( P T -E) f ro m P . te le p h io id es
Pump: L-6200 (Hitachi) Detection: λ270nm; L-4000 UV (Hitachi) Column: YMC-ODS 150×4.6 mm 5µm Solvent: A CH3CN/H2O/TFA=20:80:0.05; B CH3CN /H2O=80/20 (v/v) gradient: A 100~75% B 0~25% Flow rate: 1ml/min Column temperature: 40°C 1. Isomangiferin 2. 3-O-β-D-Glucopyranosyl quescetin 3. TelephioseC 4. TelephioseB 5. TelephioseA 6. TelephioseD1 23 45
6
10 15 20 30 35 40
25
5
0
第2 節 Morphine の鎮痛作用に対する金牛草の作用
本節では、hot-plate法を用いて、morphineの主作用である鎮痛作用に対する金牛草の 作用を検討した。Hot-plate法は、熱刺激を加えて急性痛を評価するテストで、上位中枢 を介した逃避行動の評価が対象となる。
2.1 実験方法
2.1.1 実験動物: 6週齢のddY系雄性マウス（体重25-30 g；九動、佐賀）を用いた。
2.1.2 薬物および投与方法: 金牛草 80% MeOH エキス (PT-E) は、4% Tween 80 (Sigma) に懸濁溶解して用いる。塩酸モルヒネ（武田薬品工業）およびnaloxone (Sigma) は 生理食塩水 (saline) に溶解する。薬液の容量は、マウスの体重10 g当り0.1 mlとした上 でそれぞれの試薬の濃度を調製した。
Morphine 10 mg/kg は、試行直前に皮下投与 (s.c.) し、PT-E 10, 100, 300 mg/kg および naloxone 10 mg/kg は、試行30 分前にいずれも経口投与 (p.o.) および腹腔内投与 (i.p.) した。なお、金牛草の鎮痛作用を観察する場合は、試行直前にPT-E 10, 100, 300 mg/kg を p.o. 投与する。また、vihicle群として、saline (s.c.) と4% Tween 80 (p.o.) を投与した。
2.1.3 実験手続き: Morphineおよび金牛草を投与したマウスを、一定の温度 (55 ±
0.5°C) に保たれた熱板上に置き、二つの指標 1) 後ろ足を舐めるlicking, 2) ジャンプす るjumping までの時間を測定する。Cut off timeは60秒とし、morphine または金牛草の 投与後 0, 15, 30, 60, 90分ごとにテストを行う。
2.1.4 実験結果の統計処理: Mann-Whitney’s U testを使用した。
2.2 実験結果
PT-E 10, 100 および300 mg/kg、 p.o. の単独投与では、鎮痛作用やmorphine様の挙尾 反応は全く見られなかった (Fig. 14)。一方、マウスにmorphine 10 mg/kg を皮下投与 (s.c.)
100, 300 mg/kg の用量では、時間経過とともに有意な抑制作用が認められた (Fig. 15)。
PT-E (p.o.)
hot-plate test 0
licking, jumping
90 (min) 60
45 30
15 PT-E (p.o.)
hot-plate test hot-plate test
0
licking, jumping
90 (min) 60
45 30
15
0 5 10 15 20 25 30
pre 15 30 45 60 90
Time after injection (min)
Latency (sec)
vehicle (n=9) PT-E 10mg/kg (n=9) PT-E 100mg/kg (n=9) PT-E 300mg/kg (n=9)
Fig. 14. Analgesic Effects by Alone Administration of PT-E 0
5 10 15 20 25 30
pre 15 30 45 60 90
0 5 10 15 20 25 30
pre 15 30 45 60 90
Time after injection (min)
Latency (sec)
vehicle (n=9) PT-E 10mg/kg (n=9) PT-E 100mg/kg (n=9) PT-E 300mg/kg (n=9)
Fig. 14. Analgesic Effects by Alone Administration of PT-E
その抑制作用は時間の経過とともに強く現れて、学習によるものかどうかをみるため
に、morphine投与60分後の鎮痛作用に対する金牛草の作用を検討した。その結果、同様
0 15 30 45 60 90 (min)
morphine (s.c.) PT-E (p.o.)
naloxone (i.p.)
hot-plate test
licking, jumping
0 15 30 45 60 90 (min)
morphine (s.c.) PT-E (p.o.)
naloxone (i.p.)
hot-plate test
licking, jumping
Fig. 15 . Influence of PT-E on Analgesic Activity of Morphine Time after injection (min)
Latency (sec)
vehicle (n =8)
morphine 10mg/ kg (10mg)
morphine 10mg/ kg+ na lo xone10mg/kg (n =8) morphine 10mg/ kg+ PT-E 10mg/kg (n=8) morphine 10mg/ kg+ PT-E 100mg/kg (n=8) morphine 10mg/ kg+ PT-E300mg/ kg (n=8)
0 10 20 30 40 50 60 70
pre 0 15 30 60 90
††p< 0.01, ††† p < 0.001 vs. vehicle
∗∗∗
∗∗∗
∗∗∗
∗∗∗
∗∗
∗∗ ∗∗
∗∗
∗ ∗
†††
†††
†††
††
∗p< 0.05, ∗∗p< 0.01, ∗∗∗p< 0.001 vs. mo rphine
Fig. 15 . Influence of PT-E on Analgesic Activity of Morphine Time after injection (min)
Latency (sec)
vehicle (n =8)
morphine 10mg/ kg (10mg)
morphine 10mg/ kg+ na lo xone10mg/kg (n =8) morphine 10mg/ kg+ PT-E 10mg/kg (n=8) morphine 10mg/ kg+ PT-E 100mg/kg (n=8) morphine 10mg/ kg+ PT-E300mg/ kg (n=8)
0 10 20 30 40 50 60 70
pre 0 15 30 60 90
††p< 0.01, ††† p < 0.001 vs. vehicle
∗∗∗
∗∗∗
∗∗∗
∗∗∗
∗∗
∗∗ ∗∗
∗∗
∗ ∗
†††
†††
†††
††
∗p< 0.05, ∗∗p< 0.01, ∗∗∗p< 0.001 vs. mo rphine
Time after injection (min)
Latency (sec)
vehicle (n =8)
morphine 10mg/ kg (10mg)
morphine 10mg/ kg+ na lo xone10mg/kg (n =8) morphine 10mg/ kg+ PT-E 10mg/kg (n=8) morphine 10mg/ kg+ PT-E 100mg/kg (n=8) morphine 10mg/ kg+ PT-E300mg/ kg (n=8)
0 10 20 30 40 50 60 70
pre 0 15 30 60 90
††p< 0.01, ††† p < 0.001 vs. vehicle
∗∗∗
∗∗∗
∗∗∗
∗∗∗
∗∗
∗∗ ∗∗
∗∗
∗ ∗
†††
†††
†††
††
∗p< 0.05, ∗∗p< 0.01, ∗∗∗p< 0.001 vs. mo rphine
PT-E (p.o.) naloxone (i.p.)
hot-plate test morphine
(s.c.)
licking jumping
0 60 (min)
PT-E (p.o.) naloxone (i.p.)
PT-E (p.o.) naloxone (i.p.)
hot-plate test hot-plate test
morphine (s.c.) morphine
(s.c.)
licking jumping
0 60 (min)
vehicle (n =8)
morphine 10mg/ kg (n=8)
morphine 10mg/ kg+ na lo xone10mg/kg (n =8) morphine 10mg/ kg+ PT-E 10mg/kg (n=8) morphine 10mg/ kg+ PT-E 100mg/kg (n=8) morphine 10mg/ kg+ PT-E 300mg/kg (n=8)
Fig. 16. Influence of PT-E on the Analgesic
Activity After 60 min Morphine Administration
pre 60 min
0 10 20 30 40 50 60 70
†††p<0.001 vs. vehicle
∗p<0.05, ∗∗p<0.01, vs. mo rphine
**
†††
*
*
vehicle (n =8)
morphine 10mg/ kg (n=8)
morphine 10mg/ kg+ na lo xone10mg/kg (n =8) morphine 10mg/ kg+ PT-E 10mg/kg (n=8) morphine 10mg/ kg+ PT-E 100mg/kg (n=8) morphine 10mg/ kg+ PT-E 300mg/kg (n=8)
Fig. 16. Influence of PT-E on the Analgesic
Activity After 60 min Morphine Administration
pre 60 min
0 10 20 30 40 50 60 70
†††p<0.001 vs. vehicle
∗p<0.05, ∗∗p<0.01, vs. mo rphine
**
†††
*
*
第3 節 Morphine の自発運動量増加に対する作用
マウスなどの小動物にmorphineを投与した場合、特有な自発運動活性の促進が認めら れる。本節では、morphineによる自発運動量増加に対する金牛草の作用を検討した。
3.1 実験方法
3.1.1 実験動物および使用薬物: 第2節と同様に行う。
薬物の投与では、morphine 10 mg/kgは運動量測定の30分前に皮下投与 (s.c.) し、PT-E 10, 100, 300 mg/kg は、測定の1時間前に予め経口投与 (p.o.) する。 なお、vehicle群と して、saline (s.c.) と4% Tween 80 (p.o.) を投与する。
3.1.2 実験手続き: 自発運動量の測定には、open-field装置 (Fig. 17) を用いた。テ
スト方法は、薬物を投与したマウス を装置の中心に静かに入れ、3分間 に底面の区画を横切った
(ambulation) 回数を測定し、この数 値を自発運動量とする。
3.1.3 実験結果の統計処理:
Mann-Whitney’s U testを使用した。
3.2 実験結果
薬物を投与していないvehicle群では、周辺環境への慣れが生じて、test時の運動量は
300 mg/kg を予め投与しておくと、morphine による運動量増加は用量依存的に抑制され た (Fig. 18)。
一方、データには示していないが、金牛草10, 100 および300 mg/kg, p.o. の単独投与 では、マウスの自発運動量には影響を与えなかった。以上から、金牛草10, 100 および
300 mg/kg は、それ自体では自発運動量や立ち上がり動作などには何ら影響を与える事
はなかったが、morphineによる自発運動量の増加に対しては、300 mg/kgの用量で有意に 抑制することがわかった。
PT-E (p.o.)
morphine (s.c.)
counts (3 min) 0
PT-E (p.o.)
morphine (s.c.)
counts (3 min) 0
Fig. 18. Effects of PT-E against Behavioral Excitement Caused by Morphine in Mice
vehicle (n =9)
morphine 30mg/ kg (n=9))
morphine 30mg/ kg+ PT-E 10mg/kg (n=9) morphine 30mg/ kg+ PT-E 100mg/kg (n=9) morphine 30mg/ kg+ PT-E 300mg/kg (n=9)
0 20 40 60 80 100 120 140
pre test
Counts/3 min
††p< 0.01 vs. vehicle
∗p< 0.05, vs. morphine
††
*
Fig. 18. Effects of PT-E against Behavioral Excitement Caused by Morphine in Mice
vehicle (n =9)
morphine 30mg/ kg (n=9))
morphine 30mg/ kg+ PT-E 10mg/kg (n=9) morphine 30mg/ kg+ PT-E 100mg/kg (n=9) morphine 30mg/ kg+ PT-E 300mg/kg (n=9)
0 20 40 60 80 100 120 140
pre test
Counts/3 min
††p< 0.01 vs. vehicle
∗p< 0.05, vs. morphine
††
*
††
*
第4 節 Morphine 退薬症状に対する作用
Morphineを始めとするopioid類の慢性投与による依存形成後に急激な退薬を行うと、
退薬症状（禁断症状）が発現する。ヒトの場合、退薬症状として頻脈、頻呼吸、異常発 汗、嘔気、意識混濁、痙攣などが発現する。マウスでは、体重減少、wet-dog shake, teeth chattering, stretching, jumping, paw shake, head shake などが誘発される。本節では、jumping を退薬症状の指標とし、金牛草の影響を検討した。
4.1 Morphine退薬症状の発現条件の確立
過去の文献では、マウスを用いたmorphine退薬症状モデルの作成方法がいくつかある が、本実験では、退薬症状の一つとするjumpingの再現性の確立を高めるため、morphine の投与方法、マウスの種差などの条件を検討した。また、退薬症状の発現にはµ 受容体 拮抗薬であるnaloxoneの最適用量も検討した。
4.1.1 実験動物
実験動物は6-8週齢のCD-1 (ICR) 系雄性マウス（体重20-25 g；九動、佐賀）、ddY系 雄性マウス（体重25-35 g；九動、佐賀）、およびC57BL/6NCrj系雄性マウス（体重15-25 g；チャールズリバー、東京）を用いた。
4.1.2 使用薬物: 第1節と同様である。
4.1.3 実験装置
退薬症状 (jumping) の測定装置は、高さ 40 cm × 幅15 cmの円柱の台を用いた (Fig. 19)。Naloxone投与直後にマウスを測 定装置に乗せて、プレートから飛び降りる (jumping) 回数を数えて退薬症状の指標と
4.1.4 Morphine依存モデルの作成
1) model Ⅰ: morphine (10, 20, 40 mg/kg) を1日3回 (8:00, 14:00, 20:00), 3日間皮下投与 (s.c.) を行う。
2) model Ⅱ: morphineを1日2回 (10:00, 18:00), 4日間漸増投与 (10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 mg/kg, s.c.) を行う。
それぞれの方法で依存モデルの作成を試みた。また、vehicle群として、いずれもsaline (s.c.) を投与した。
4.1.5 結果と考察
Morphineの投与方法については、modelⅡのmorphineを1日2回投与で4日間漸増す る結果がより安定しており、投与間隔が長いことが依存の形成に適していると考えられ た。また種差について、ddYマウスはjumping があまり見られないことから、morphine の依存が形成されにくいことが考えられた。一方、C57BLマウスでは、jumpingが全て 見られ、特にばらつきないことから、C57BLマウスがmorphine依存形成されやすく、退 薬症状モデルとして適していることがわかった。
4.2 Morphine退薬症状に対する金牛草の作用
6週齢のC57BL/6NCrj系雄性マウスを用い、morphine 1日2回の4日間漸増投与し、
naloxone 10 mg/kg により発現するjumping を指標として、金牛草によりnaloxoneと同様 の退薬症状が起こるのか、あるいは、退薬症状を抑制するのかどうかを検討した。
4.2.1 薬物の投与
6週齢のC57BL系雄性マウスに、morphineを1日2回 (10:00, 18:00)、4日間漸増投与 (10, 15, 20, 25, 30, 35,40, 45 mg/kg, s.c.) した。なお、PT-E (10, 100, 300 mg/kg) は、morphine 投与の30 分前に予めp.o. 投与し、5日目のmorphine最終投与の2時間後にnaloxone 10 mg/kg、i.p. 投与を行う。また、morphine退薬症状に対する金牛草単回投与の作用をみる ため、naloxone投与の30 分前に、またはnaloxoneの代わりにPT-Eをそれぞれ投与した。
4.2.2 実験手続き
Morphine依存マウスにnaloxone または金牛草投与後すぐに4.1.3の測定装置に乗せて、
30 分間観察する。