熊本大学学位論文
Polygala telephioides の成分
ならびに抗 Morphine 作用に関する研究
2005
李 建晨
Study on the Constituents Genus and Antagonistic Effects against Morphine Responses of Polygala telephioides
Li Jian-Chen Drug dependence is compulsive use of a substance despite negative consequences. Drug dependence is sometimes accompanied by severe mental state: a strong impulse to take a medicine periodically or continuously, euphoria of use and dysphoria of withdrawal. It is well known that morphine is one of the typical medicines that cause drug dependence. The withdrawal syndrome includes severe mental and physical symptoms, such as anxiety, convulsion, memory impairment and vomiting etc. Recently, population of opioids such as morphine and heroine dependence patients has been increasing over the world-wide.
Especially in China, the increasing trend is evident because of unsuccessful control in drug abuse, which consequently also brought serious social problems.
Even in near future, morphine would still be most effective analgesic medicine that can not be completely substituted. Researchers have tested numerous treatment methods against narcotic dependence, for instance, drug administration, surgery therapy and obligatory treatment in therapeutic communities, but so far none of them has achieved satisfactory effect.
The application of nature medicine in this field has been a subject of active investigation.
JinNiuCao, Polygala telephioides WILLD, is a wild plant distributed in south China, and the fresh or dried whole plants have been traditionally used for detoxification of opioid addiction.
However, its chemical constituents and pharmacological effects have not been clearly clarified. The aim of this study is to identify the pharmacological active substance. As a result, ten compounds were obtained, among which five oligosuccarides were designated as Telephiose A, B, C, D and E and three benzophenones named as Telephenone A, B and C were found as novel compounds.
O
O H
O H O H
H O O R
C O
O
O O H O
O R2
In order to confirm the detoxification effect of Jinniucao on opioid addiction, 80%
methanolic extract of polygala telephioides (PT-E) was co-administrated to mice with morphine, followed by investigating the antagonistic effects of PT-E against various activity of morphine using the method of behavioral pharmacology. The following findings were observed in the study: 1) PT-E 10, 100, and 300 mg/kg inhibited the analgesic effect of morphine in dose-dependently. 2) PT-E 10, 100, and 300 mg/kg suppressed the behavioral excitement caused by morphine 30 mg/kg. 3) Repeated administration of PT-E 10, 100, and 300 mg/kg remarkably reduced morphine withdrawal symptoms. 4) Repeated administration of PT-E 300 mg/kg steadily suppressed resistance of morphine. 5) PT-E 300 mg/kg improved morphine-induced memory impairment by single administration. 6) For oxotremorine-caused convulsion, PT-E 10, 100, and 300 mg/kg did not exhibit significant activity. 7) In all above experiments, no significant effect was observed, when PT-E alone was administrated. These results, suggest that PT-E may be able to suppress the physical dependence caused by morphine.
Furthermore, the impact of PT-E on morphine concentration in mice plasma was examined by pharmacokinetic method. First, PT-E 300 mg/kg was administrated to mice, followed by administration of morphine 30 min later. Then blood samples were collected at 30, 60, 90, 120 and 180 min after morphine administration. The samples were centrifuged and the concentrations of morphine in the plasma were analyzed by HPLC with fluorescence detection. The result showed that the concentrations of morphine in the mice treated with PT-E were significantly decreased in comparison with the control group, suggesting that the antagonistic activity of JinNiuCao against morphine addiction could be due to its ability to accelerate morphine excretion or metabolism.
In addition, we have surveyed DaJinNiuCao (Polygala chinensis L.), which has similar usage and a botanical relation with P. telephioides, for its chemical constituents. As a result, four compounds were obtained, which were isolated for the first time from the plant, and analogous compounds by comparison with those of P. telephioides.
熊本大学学位論文
Polygala telephioides の成分
ならびに抗 Morphine 作用に関する研究
2005 李 建晨
Study on the Constituents Genus and Antagonistic Effects against Morphine Responses of Polygala telephioides
目 次
緒論 本論
第 1 章 小金牛草 (Polygala telephioides WILLD.) の成分 第 1 節 抽出、分離
第 2 節 化学成分の解明 2-1 Telephiose A
2-2 Telephiose B 2-3 Telephiose C 2-4 Telephiose D 2-5 Telephiose E 2-6 Telephenone A 2-7 Telephenone B 2-8 Telephenone C
第 3 節 Telephiose D の安定性の初歩検討 第 4 節 小結
第 2 章 Morphine の種々の薬理作用に対する金牛草の作用
第 1 節 サンプル (PT-E) の調製
第 2 節 Morphine の鎮痛作用に対する金牛草の作用
第 3 節 Morphine の自発運動量増加に対する金牛草の作用 第 4 節 Morphine の退薬症状に対する金牛草の作用
第 5 節 Morphine の耐性に対する金牛草の作用
第 6 節 Morphine による空間記憶障害に対する金牛草の作用 第 7 節 中枢 acetylcholine 神経系に対する金牛草の作用 第 8 節 小結
第 3 章 マウス血漿中 Morphine に対する金牛草の作用 第 1 節 マウス血漿中 Morphine の蛍光定量法
第 2 節 マウス血漿中 Morphine 濃度に金牛草の影響
1
3 4 6 6 13 16 19 22 25 31 34 41 43 45 46 48 52 54 58 60 64 67 69 70 73
第 3 節 血漿中 Morphine の Hysteresis 第 4 節 小結
第 4 章 大金牛草 (Polygala chinensis L.) の成 分
第 1 節 抽出、分離 第 2 節 化学成分の解明 第 3 節 小結
総括 謝辞 実験の部 参考文献
76 77 79 81 89 90 93 94 104 75
緒 論
薬物依存は、「精神的に、時には身体的にも起こる状態で、生体と薬物の相互作用によ りもたらされる。その薬物の精神的な効果を体験しようとして、あるいは薬が切れたと きの不快を避けようとして、持続的または周期的に薬物を摂取したいという衝動を常に 伴っている状態」と定義されている (WHO, 1968)。
臨床では、癌疼痛の鎮痛薬として用いられるmorphineの投薬が1回限りで終ることは ほとんどなく、一般に連続的あるいは間欠的に繰り返し投与され、強度の耐性や精神お よび身体依存が形成されるため、その使用には、大きな制限がなされている。Morphine による副作用には、基本的にオピオイド受容体拮抗薬であるnaloxone投与により消失す るが、同時に、主作用である鎮痛作用も減弱されるため、morphine過量投与による呼吸 抑制など生命の維持が脅かされない限り、対症療法的に副作用を軽減させる処置が望ま れている。また、morphineの誘導体であるheroineは薬物依存の形成が速い麻薬であるた め、その使用は厳しく禁じられている。しかしながら、heroine、アヘンなどの摂取、注 射により惹起される中毒は、世界で重大な問題となっている。中国では近年の開放政策 と共に、麻薬品の乱用が急速に拡がり、その乱用によりさまざまな社会的、経済的問題 を引起している状況である。世界各国は非常に多量な人力、財力を入れて厳しく取り締 まっているが、麻薬の乱用は実に益々氾濫していくことは現状である。アヘン類依存患 者に対する対応策といえば、強制的に節制、薬物療法ひいては手術療法など多種の方法 が挙げられるが、いずれも期待する効果が得られていない。薬物療法では、methadone 替代療法は最も多くに用いられる。しかし、この方法においては、methadoneの自身も依 存が形成しやすいという大きな欠陥を抱えている。こういう状況の中、天然薬物、ある いは中薬の抗morphine作用を持つ解毒薬の開発が非常に期待されている。
そこで、中国において古来からmorphineの解毒に使用されている中草薬の金牛草が候 補に上る。金牛草は常用中草薬として、特に中国の南方地区で昔から広く使用されてい る。その植物基源としては、小金牛草Polygala telephioides WILLD. と大金牛草Polygala
chinensis L. が知られる。両者共、止咳、活血散於止痛などにおいて同じ適用方であるが、
解毒作用については、小金牛草は ｢解毒破血。解罌粟毒。｣、一方、大金牛草は｢散毒。
治蛇噛傷。｣の文献記載がある。しかし、金牛草の化学成分ならびに薬理学的解明はこれ までに殆ど検討されていない。
金牛草のmorphineに対する作用の主体を明らかにするため、まず、小金牛草ならびに
大金牛草の成分検索を企図した。続いて、小金牛草の80％ MeOHエキス (PT-E) に対し て、morphineの主作用である鎮痛作用に対する金牛草の作用、また副作用であるmorphine の依存や耐性、さらにはmorphine による自発運動量の増加、空間記憶障害に対する作用 を、マウスを用いて行動薬理学的に検討した。また、学習や記憶には、脳内アセチルコ リン神経系が重要な役割を果たしていることが知られていることから、中枢アセチルコ リン神経系に対する金牛草の作用を、ムスカリン受容体作用薬であるoxotremorineによ って誘発される震顫を指標に検討した。さらに、金牛草解毒作用のメカニズムの探索と
して、morphine血漿中濃度に対する金牛草の影響についても、薬物動態学的な検討を行
った。
第 1 章 小金牛草 Polygala telephioides の成分
小金牛草 Polygala telephioides WILLD（別名：小花遠志 小金不換 金牛草）はヒメハ
ギ科Polygalaceae の植物で、中国の華南及び江西、湖南などに分布する。一年生草本で、
平地に生育する。茎は高さが8~15 cm、短柔毛がある。葉は互生し、楕円形あるいは円 状倒卵形、長さ5-10 mm、幅3-5 mmで、全縁、無毛である。総状花序は腋生、極短であ る。花は小さく、長さ約2.5 mm、藍紫色である。蕚片は5、長卵形、浅紫赤色で、縁毛 がある。朔果は倒卵形、偏平で、萼片は残留する。種子は卵形である。採取期は６、７ 月で、根つきの全草を薬用にする。《中薬誌》には「辛、平」「解毒破血。治風痰膈気、
解罌粟毒。」と記載され、《常用中草薬手冊》には「活血散於、止痛鎮咳。煎服して胸痛 咳嗽、百日咳、小児麻痺後遺症などに用いるとされる。鮮品は外用して角膜潰瘍、急性 結膜炎を治療する。」と記載されている。臨床報告によれば、金牛草鮮品50 g を水煎し て毎晩1剤を服用すれば、ハンセン病の神経反応の治療にも有効であることが明らかに されている。また、半数以上の治療例に顕著な治療効果が現れたことより、金牛草が明 らかに駆風除湿、疏筋活絡、消腫止痛などの治療効果を有するものとみなされる。
Fig. 1. Polygala telephioides （中薬大辞典より）
第1 節 抽出、分離
小金牛草乾燥全草を、95% EtOHで抽出し、そのエキスをhexaneで還流して、hexane 可 溶部と不溶部に分けた。Chart 1 に示すように、Diaion HP-20、Sephadex LH-20、silica gel、
および Chromatotex ODS各種のクロマトグラフに付し、hexane 可溶部からTelephiose A, B, E, PT-1、hexane 不溶部からTelephiose C, D, Telephenone A, B, C, PT-17と命名する oligosaccharide 誘導体5種とbenzophenone 誘導体3種、および flavone 誘導体1種、
xanthone 誘導体1種を得た。
MeOH Telephenone A
ex
t. (198.4g)
Extracted with 95%EtOH hexane Sol. (148g)hexane Insol. (49.5g) 2.1g MeO
H Sol.P. (1.5g)MeOH
Insol.P. (0.6g)
Diaion H2O~30%MeOH50%MeOH ( 11.2g)80%MeOH (18.4g) fr.1~2fr.3 PT-1
fr.3 (81mg) fr.4 (137mg) f
r.9 fr.11 (116mg)(39mg) Telephiose D
Telephiose A Telephenone BPT-17Telephiose C
Sephadex LH-20 MeOH silica gel C:M:W=8:2:0.1
→7
:3:0.5
silica
gel C:M
:W=7:3:0.5 →6:4:1
fr.4~7
Polygala telephioides 1500 g silica gel C:M=30:1→10:1 →C:M
:W=9:2:0.1
Chromatotex ODS 30-50% MeOH silica gel C:M:W=8:2:0.1 →7:3:0.5 silica gel C:M:W=15:5:0.6
Sephadex
LH-20 MeOH
silica gel 8:2:0.1→ 7:3:0.5 Chromatorex ODS 30-40% MeOH
fr.14 (191mg) silica gel 9:1:0.1-7:3:0.5 Chromatorex ODS 50-70% MeOH
fr.1
~2
2.2g (8mg)(10mg) (7mg)
(6mg)(6mg)
(4mg)(11mg)
(14mg) (34mg)
Sephadex LH-20 MeOH Telephenone CTelephiose B Chart 1
Tel
ephiose E
(6mg)
C:M:W=CHCl3:MeOH:H2O
第2 節 化学成分の解明
Telephiose A (1)
Telephiose A (1) は無晶形粉末、[α]D -11.0° ( MeOH) を示し、negative FAB-MSでは、
m/z 795に[M-H]- に由来するpeakを示す。TLC上で硫酸発色すると紫赤色を呈す。
1 の1H-NMRスペクトルでは、δ 1.89 (3H, s)、 2.07 (3H, s) に2個のacetyl methyl基に 帰属されるsignalを示す。 δ 3.91から 6.31まで密集するsignalが見られ、糖残基の存在 が予想された。また、δ 7.40 (4H, t, J=7.9 Hz)、7.55 (2H, t, J=7.9 Hz)、8.07 (2H, dd, J=1.2, 7.9 Hz)、8.26 (2H, dd, J=1.2, 7.9 Hz) などのsignalより芳香環の存在が推定された。
一方、13C-NMRスペクトルでは、δ 62.9 から 106.5 の間に18個のcarbon signal が観 察され、3個のhexosyl基に由来するsignalと推定された。その中の δ 106.5、103.1、92.1 の signalは、糖の anomeric carbon signalであると推定された。また、δ 103.1のsignalは 4級炭素であることより、1個のfructofuranoseの存在が予想された。さらに、δ 20.6、20.7 のsignalは2個のacetyl 基のmethyl groupの存在を示す。
なお、δ 128.7 から 133.5の領域に aromatic signalが見られ、carbonyl基signalは4個 存在するので、2個のbenzoyl基の存在が示唆された。
Table 1. 1H and 13C-NMR Data for Telephiose A (1) (in pyridine-d5)
position 1H 13C
glc
1 6.31 (1H, d, J=3.7 Hz) 92.1
2 4.08 (1H, dd, J=3.7, 9.8 Hz) 81.3 3 4.59 (1H, dd, J=9.8, 9.8 Hz) 70.8 4 5.67 ( 1H, dd, J=9.8, 9.8 Hz) 72.8
5 4.87 (1H, m) 69.0
6 4.50 * 63.1
4.50 *
Glc
1 5.08 (1H, d, J=7.9 Hz) 106.5
2 4.03 * 75.2
3 4.12 * 78.2
4 4.13 * 71.5
5 3.91 (1H, m) 78.7
6 4.31 (1H, dd, J=5.8, 11.9 Hz) 62.9
4.51 *
Fru
1 4.60 (1H, d, J=12.2 Hz) 65.3
5.12 (1H, d, J=12.2 Hz)
2 103.1
3 6.30 (1H, d, J=8.6 Hz) 79.9
4 5.15 (1H, dd, J=7.9, 8.6 Hz) 73.3
5 4.68 (1H, m) 84.8
6 4.43 (1H, dd, J=6.4, 12.4 Hz) 63.7 4.37 (1H, dd, J=3.4, 12.4 Hz)
Ac(Fru)
1 170.6
2 2.07 (3H, s) 20.6
Ac(glc)
1 170.2
2 1.89 (3H, s) 20.7
Bz(glc)
1 130.5
2, 6 8.07 (2H, dd, J=1.2, 7.9 Hz) 130.0
3, 5 7.40 (2H, t, J=7.9 Hz) 128.9
4 7.55 (1H, t, J=7.9 Hz) 133.5
α 165.8
Bz(Fru)
1 130.3
2, 6 8.26 (2H, dd, J=1.2, 7.9 Hz) 130.0
3, 5 7.40 (2H, t, J=7.9 Hz) 128.7
4 7.55 (1H, t, J=7.9 Hz) 133.5
α 166.1
*overlapped with other signals
次に、heteronucler multiple quantum coherence (HMQC) スペクトル (Fig. 2) を見ると、δ 6.31 (1H, d, J=3.7 Hz) および 5.08 (1H, d, J=7.9 Hz) の anomeric protonが、それぞれ2個 のglucopyranosyl基のanomeric carbonと相関があることが判明した。Glucopyranosyl基の anomeric protonのcoupling constantより、α-D-glucopyranosyl (J=3.7 Hz) および
β-D-glucopyranosyl (J=7.9 Hz) 各1個から成ることが明らかとなった。
Fig. 2. HMQC Spectrum of Telephiose A (1) (in pyridine-d5)
Fig. 3. HMBC Spectrum of Telephiose A (1) (in pyridine-d5)
従って、1 は3糖のoligosaccharideに benzoyl基が2 個、acetyl基が2個結合した構造 が推定された。また、3個のhexosyl基は、δ 62.9、63.1、63.7、65.3に4個のoxygen-bearing methylene の存在を示すことからも、2個のglucopyranosylと1個の fructofuranosylから 成ることが支持された。δ 165.8、166.1、170.2、 170.6 の signalは、エステル部のcarbonyl に由来するものであると考えられた。
続いて、1 の 1H-1H 2D chemical shift correlation spectroscopy (COSY) (Fig. 4) によって、
糖部を順次帰属していくと、すべてのproton signalはTable 1のように帰属された。
Fig. 4. 1H-1H COSY Spectrum of Telephiose A (1) (in pyridine-d5)
次に、HMBCスペクトルより、α-D-glucopyranosylのanomeric protonとfructopyranosyl 基のanomeric carbonの間、ならびにβ-D-glucopyranosylのanomeric protonと
α-D-glucopyranosylのC-2の間に関連があることが明らかとなった。従って、糖と糖の結 合位置が判明した。
H
HO H
H O
HO O
O
C C
O
C O
CH3
O OH
O
O O HO
O
O
O
OH HO
HO
C O
CH3
H H
H H
H
H H
H H
H H
H H H
Fig. 5. Key HMBC of Telephiose A (1)
Fru glc
Glc
さらに、糖部のprotonの chemical shiftを観察すると、fructofuranosyl基のH-3、なら びに α-D-glucopyranosyl基のH-4が、特に低磁場にシフトしていることが判った。従っ て、benzoyl基、或いはacetyl基が結合している可能性が推定された。 さらに、HMBC スペクトルより、fructofuranosyl基のH-3とδ 166.1のcarbon signalの間に、また
α-D-glucopyranosyl のH-4とδ 165.8のcarbon signalの間に、それぞれ関連があることが 判明した。従って、benzonyl基が糖部に結合する位置が推定された。さらに、同様な方 法で、acetyl基のsignalは帰属され、糖残基との結合位置を決定した (Table 1)。即ち、
α-D-glucopyranosyl の4位、およびfructofuranosylの3位にbenzoyl が結合し、acetyl基 が α-D-glucopyranosylの6位および β-D-fructofuranosylの1位に結合することが判明した。
また、α-D-glucopyranosyl の4位、およびfructofuranosylの3位のproton signalがそれぞ れ δ 5.67、6.30 に現れ、通常より低磁場へシフトしたという事実によっても証明された。
従って、Telephiose A (1) の構造は1-O-acetyl-3-O-benzoyl-β-D- fructofuranosyl-(2→
1)-[ β-D-glucopyranosyl-(1→2)] -4-O-benzoyl-6-O-acetyl-α-D-gluco -pyranosideで表わされる ものとした。
Telephiose A (1) C
O
OH
O
O O HO
O
O
O
HO OH HO
C O
CH3
O O
HO
OH
O C O
CH3 C
O
Telephiose B (2)
Telephiose B (2) は無晶形粉末で、[α]D -17.6° (MeOH) を示し、negative FAB-MSでは、
m/z 795に [M-H]- に由来するpeakを示す。TLC上で硫酸発色すると紫赤色を呈す。
その1H-NMRスペクトルでは、δ 1.91 (3H, s)、2.10 (3H, s) に2個のacetyl 基のsignal、
および δ 7.40 (2H, t, J=7.9 Hz)、 7.55 (1H, t, J=7.9 Hz)、8.29 (2H, dd, J=1.2, 7.9 Hz) に aromatic proton signalを示す。δ 3.94から 6.35の領域はsignalが密集し、糖残基の存在が 推定された。
13C-NMRスペクトルも、1 に非常に類似している。 δ 61.9 から106.6の間に、3個の hexosyl基に由来するとみられるsignal が合計18個見られる。この中の δ 106.6、102.9、
92.6は、それぞれに糖残基のanomeric carbon signalであると推定された。さらに、δ 102.9 のsignalは4 級炭素であることより、fructofuranosyl の存在を予想させる。δ 20.6、20.7 のsignalから、2個のacetyl methyl groupの存在が示唆された。δ 128.8より133.5の carbon signalより、benzoylの存在が予想された。低磁場に見られる δ 166.0、166.1、170.1、171.3 は、4個のcarbonyl carbon signalに帰属される。
従って、2の基本骨格は1と同じ、3個のhexosyl基と2個のbenzoyl基、さらに2個 の acetyl基から成ることが推定された。
以上の知見と共に、2の HMQCスペクトルによって、δ 6.26、5.04 のsignalは、それ ぞれ2個のglucopyranoseのanomeric carbonに連結する anomeric protonに帰属された。
また、HMBCスペクトルによって、δ 6.35のsignalはfructofuranoseのH-3であると判明 した。続いて、2の 1H-1H 2D COSYによって、糖部を順次帰属していくと、proton signal はTable 2 のように帰属された。さらに、glucopyranosyl基のanomeric proton のcoupling constantから、α-D- glucopyranosyl (J=3.7 Hz)、および β-D-glucopyranosyl (J=7.9 Hz) 各1 個が結合していることが判明した。
Table 2. 1H and 13C-NMR Data for Telephiose B (2) (in pyridine-d5)
position 1H 13C
glc
1 6.26 (1H, d ,J=3.7 Hz) 92.6
2 4.08 (1H, dd, J=3.7, 9.8 Hz) 81.7 3 4.66 (1H, dd, J=9.8, 9.8 Hz) 70.9 4 5.89 (1H, dd, J=9.8, 9.8 Hz) 73.2
5 4.87 (1H, m) 72.4
6 4.26 (1H, dd, J=2.4, 12.2 Hz) 61.9
4.10 *
Glc
1 5.04 (1H, d, J=7.3 Hz) 106.6
2 4.12 * 75.2
3 4.66 * 78.1
4 4.10 * 71.1
5 3.94 (1H, m) 75.1
6 4.75 (1H, dd, J=6.1, 11.6 Hz) 64.1 4.98 (1H, dd, J=2.4, 11.6 Hz)
Fru
1 4.65 (1H, d, J=12.2 Hz) 65.5
5.07 (1H, d, J=12.2 Hz)
2 102.9
3 6.35 (1H, d, J=8.6 Hz) 79.6
4 5.38 (1H, dd, J=7.9, 8.6 Hz) 73.0
5 4.66 (1H, m) 84.7
6 4.38 (1H, dd, J=6.4, 12.4 Hz) 62.8 4.52 (1H, dd, J=3.4, 12.4 Hz)
Ac(Fru)
1 171.3
2 2.10 (3H, s) 20.6
Ac(Glc)
1 170.1
2 1.91 (3H, s) 20.7
Bz(glc)
1 130.9
2, 6 8.07 (2H, dd, J=1.2, 7.9 Hz) 130.1
3, 5 7.40 (2H, t, J=7.9 Hz) 128.9
4 7.55 (1H, t,J=7.9 Hz) 133.4
α 166.0
Bz(Fru)
1 130.5
2, 6 8.26 (2H, dd, J=1.2, 7.9 Hz) 130.0
3, 5 7.40 (2H, t, J=7.9 Hz) 128.8
さらに、HMBCスペクトルより、α-D-glucopyranosyl基のanomeric protonと
fructofuranosyl基のanomeric carbonの間に、また、β-D-glucopyranosyl基のanomeric proton と α-D-glucopyranosyl基のC-2 の間に関連があることが明らかとなった。従って、糖と 糖の結合関係を構築することができた。
また、糖部のprotonのchemical shiftを観察すると、fructofuranosyl基のanomeric proton ならびに β-D-glucopyranosyl基のH2-6の低磁場shift値が特に大きいことが観測された。
その要因として、benzoyl基或いはacetyl基がこの位置に結合していることが示唆された。
また、HMBCスペクトルより、 fructofuranosyl基の anomeric protonと δ 171.3の carbon signalの間に、また β-D-glucopyranosyl のH2-6と δ 170.1のcarbon signalの間にそれぞれ 関連があることが判明した。このことによって、acetyl基が糖部に結合する位置が判明し た。さらに、同様な方法で、benzoyl基のsignal が帰属され、糖残基との結合位置が明ら かとなった。 即ち、α-D-glucopyranosyl の4位およびfructofuranosylの3位にbenzoyl基 が結合し、acetyl基が β-D-glucopyranosylの6位および β-D-fructofuranosylの1位に結合 することが判明した。α-D-glucopyranosyl の4位、およびfructofuranosyl の3位のproton signal がそれぞれ δ 5.89、6.35 に現れ、通常より低磁場へシフトすることによっても証 明される。従って、Telephiose B (2) の構造は式のように表わされるものと決定した。
Telephiose B (2) C
O
O
O
O O HO
O
OH
O
OH HO
HO O
O
HO
OH
O C O
CH3 C
O C
O CH3
Telephiose C (3)
Telephiose C (3) は無晶形粉末で、[α]D -19.5° ( MeOH) を示し、positive FAB-MS では、
m/z 713に [M+H]＋ に由来するpeak、ならびにm/z 735 に [M+Na]＋ に由来するpeakを 示す。TLCの上で硫酸発色すると紫赤色を呈す。
3の 1H-NMRスペクトルでは、δ 3.93 から 4.91までにsignal が密集し、糖残基の存 在を予想させる。低磁場の領域には、δ 5.21 (1H, d, J=7.3 Hz)、5.37 (1H, dd, J=7.3, 7.9 Hz)、
5.88 (1H, dd, J=9.2, 9.7 Hz)、6.35 (1H, d, J=3.7 Hz)、6.64 (1H, d, J=7.3 Hz) などのsignalが 見られたが、この中には、糖のanomeric proton signalが含まれるものと考えられた。 ま た、δ 7.41、7.55、8.09、8.35にaromatic proton signal が観察された。
一方、その13C-NMRスペクトルでは、 δ 62.0 から106.3までの範囲に、3個のhexosyl 基に帰属される18個のcarbon signalを示す。さらに、δ 128.8、128.9、130.1、130.2、130.8、 130.9、133.3、133.4 には、aromatic carbon signal が見られる。また、低磁場領域 δ 166.0、 166.1にsignal を示す。3 のスペクトルは、1に類似すると見られるが、 詳細に比較す れば、低磁場領域において δ 170 近辺のsignalが2個少なく、さらに高磁場側の δ 20 付近のsignalも2個減少していることが判る。即ち、1より2個のacetyl基が少ないこと が示唆された。
続いて、1を帰属したように、HMQC、HMBC、1H-1H COSYスペクトル、および coupling constantを考慮して、 3 は1と同じ3個の hexosyl 基より構成される、即ち、1個の α-D-glucopyranosyl基、1個の β-D-fructofuranosyl基、および1個のfructofuranosyl基から 成ることが判明した。即ち、糖部の基本骨格は1とまったく同じであることが判った。
次に、エステル基のcarbonyl groupのsignal は2個見られ、その上、aromatic carbonのsignal と見なされるのは8個観察されるから、2個のbenzoyl基が存在することが予想された。
そうすると、aromatic carbon signalがまだ4個存在するはずであるが、これは重なってい るものと考えられた。それぞれのprotonと carbonはTable 3のように帰属された。
Table 3. 1H and 13C-NMR Data for Telephiose C (3) (in pyridine-d5)
position 1H 13C
glc
1 6.31 (1H, d, J=3.7 Hz) 92.3
2 4.20 (1H, dd, J=3.7, 9.8 Hz) 81.3 3 4.76 (1H, dd, J=9.7, 9.7 Hz) 71.5 4 5.88 (1H, dd, J=9.7, 9.2 Hz) 73.1
5 4.91 (1H, m) 72.3
6 4.08 (1H, dd, J=6.1, 11.9 Hz) 62.0
4.22 *
Glc
1 5.21 (1H, d, J=7.3 Hz) 106.3
2 4.01 * 75.5
3 4.14 (1H, dd, J=8.5, 9.1 Hz) 78.3
4 4.05 * 71.8
5 3.93 (1H, m) 78.7
6 4.26 * 63.0
4.47 *
Fru
1 4.38 (1H, d, J=12.2 Hz) 64.8 4.47 (1H, d, J=12.2 Hz)
2 105.4
3 6.64 (1H, d, J=7.3 Hz) 80.0
4 5.37 (1H, dd, J=7.3, 7.9 Hz) 73.8
5 4.73 (1H, m) 85.1
6 4.35 (1H, dd, J=3.0, 12.2 Hz) 62.7
4.48 *
Bz(glc)
1 130.9
2, 6 8.07 (2H, dd, J=1.2, 7.9 Hz) 130.2 3, 5 7.40 (2H, t, J=7.9 Hz) 128.9
4 7.55 (1H, t, J=7.9 Hz) 133.4
α 166.1
Bz(Fru)
1 130.8
2, 6 8.26 (2H, dd, J=1.2, 7.9 Hz) 130.8 3, 5 7.40 (2H, t, J=7.9 Hz) 128.8
4 7.55 (1H, t, J=7.9 Hz) 133.3
α 166.0
*overlapped
糖部のproton のchemical shift を観察すると、fructofuranosyl 基のH-3、ならびに α-D- glucopyranosyl 基のH-4 が特に低磁場にシフトしている事実が判明した。このことより、
benzoyl 基が糖部に結合する位置を推定できた。HMBCスペクトルでは、fructofuranosyl 基のH-3と δ 166.0のcarbon signal の間に、および α-D-glucopyranosyl のH-4と δ 166.1
のcarbon signal の間にそれぞれ関連を示したことより、結合位置が裏付けられた。
以上の事実より、Telephiose C (3) の構造は下式のように決定された。即ち、
3-O-benzoyl-β-D-fructofuranotyl-(2→1)-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)]-4-O-benzoyl-α-D-gluc-op yranose で表わされる。
Telephiose C (3) C
O
OH
O
O O HO
O
OH
O
OH HO
HO O
O
HO
OH
OH C
O
Telephiose D (4)
Telephiose D (4) は無晶形粉末で得られ、negative FAB-MSでは、m/z 837 に [M-H]- に 由来するpeakを示す。TLCで硫酸発色すると紫赤色を呈す。
その1H-NMRスペクトルでは、δ 1.93 (3H, s)、2.09 (3H, s)、 2.13 (3H, s) にacetyl基由 来のsignalを示す。δ 3.97 から5.20 までの間にsignalが密集し、やや低磁場領域に δ 5.76 (1H, dd, J=9.2, 10.4 Hz)、 6.24 (1H, d, J=3.1 Hz)、 6.35 (1H, d, J=7.9 Hz) のsignalが見られ ることより、糖部の存在が予想された。 より低磁場に出現する δ 7.44、7.61、8.12、8.29 のsignalは、aromatic protonに由来するsignalであるので、aromatic部分構造の存在が示 唆された。
一方、4 の13C-NMRスペクトルを見ると、δ 63.4 から106.4 まで18個のsignalが見 られ、3個のhexosyl基の存在することが示唆された。その中には、δ 106.4、103.0、92.4 のsignal が見られるが、それらは糖残基のanomeric carbon のsignalであるとみなされた。
また、 DEPT から δ 103.0 の signal は4 級炭素であること、ならびに
δ 63.4、63.7、64.1、65.4 の signal は1級水酸基が結合するcarbon signal に帰属された。
従って、3個存在するhexosyl基の中、1個のfructofuranosyl基が含まれることが判明し た。 Aromaticの領域には、 δ 128.8、128.9、 130.0、130.1、130.3、130.5、133.56、133.59 などのsignal が見られる。より低磁場の領域には、δ 165.9、166.1、170.1、170.7、171.4 の各signal を示す。1 の13C-NMRスペクトルと比較すると、δ 171.4 のcarbon signal が 余分に1個多く存在することが判った。また、高磁場領域には δ 20.5、20.7にacetyl基 のmethylに由来するsignalを示す。1H-NMRスペクトルで3個のacetyl methyl signal が 見られるので、13C-NMR スペクトルでは1個のmethyl carbon signalが足りないと見られ た。しかし、δ 20.7に重なり、実は3個のmethyl基が存在することが推定された。
続いて、1 を帰属した方法で、HMQC、HMBC、1H-1H COSYスペクトル、ならびに coupling constantを考慮して、 4 は 1 と同様、3個の hexosyl 基より成り、即ち、1個 の α-D-glucopyranosyl 基、1個の β-D-glucopyranosyl 基および1個のfructofuranosyl基か ら成ることが判った。即ち、糖部の基本骨格は1とまったく同じであることが明らかと なった。
Table 4. 1H and 13C-NMR Data for Telephiose D (4) (in pyridine-d5)
position 1H 13C
glc
1 6.24 (1H, d , J=3.1 Hz) 92.4
2 4.11 (1H, dd, J=3.1, 9.8 Hz) 81.2 3 4.62 (1H, dd, J=9.2, 9.8 Hz) 70.5 4 5.76 (1H, dd, J=9.8, 9.8 Hz) 72.9
5 4.95 (1H, m) 69.0
6 4.60 * 63.7
4.75 *
Glc
1 5.09 (1H, d, J=9.2 Hz) 106.4
2 4.12 * 75.0
3 4.12 * 78.0
4 4.12 * 71.1
5 3.97 (1H, m) 75.2
6 4.95 * 64.1
4.75 *
Fru
1 4.63 (1H, d, J=12.2 Hz) 65.4
5.07 (1H, d, J=11.6 Hz)
2 103.0
3 6.35 (1H, d, J=7.9 Hz) 79.6
4 5.19 (1H, dd, J=7.9, 8.5 Hz) 73.6
5 4.75 (1H, m) 84.7
6 4.42 (1H, dd, J=3.0, 12.2 Hz) 63.4 4.50 (1H, dd, J=6.1, 11.6 Hz)
Ac(Fru)
1 170.1
2 2.09 (3H, s) 20.7
Ac(glc)
1 170.7
2 1.93 (3H, s) 20.7
Ac(Glc)
1 171.4
2 2.13 (3H, s) 20.5
Bz(glc)
1 130.3
2, 6 8.12 (2H, dd, J=1.2, 7.9 Hz) 130.0
3, 5 7.44 (2H, m) 128.8
4 7.61 (1H, t, J=7.9 Hz) 133.6
α 166.1
Bz(Fru)
次に、carbonyl signal 5個、methyl signal 3個および aromatic signalの存在を考慮すれば、
4 には、3個のacetyl groupと、2個のbenzonyl基が存在することが推測された。しかし、
aromatic carbon signalと見なされるのは8個しか観察されず、4個不足する。しかし、こ れはaromatic carbon signal が重なっている可能性が考えられた。
さらに、1を帰属した方法で、HMQC、HMBC、1H-1H COSYスペクトルにより、また coupling constand を考慮して、4 は3個のhexosyl基から形成される基本骨格を有し、2 個のbenzoyl基、3個のacetyl基が結合する構造であることが明らかとなった。それぞれ のprotonと carbonの帰属はTable 4のようになった。
従って、Telephiose D (4) の構造は下式のように表わされるものと決定した。即ち、4 は Telephiose A (1) のacetyl誘導体である。
Telephiose D (4) C
O
O
O
O O HO
O
O
O
OH HO
HO
O O
HO
OH
O C O
CH3 C
O C O
CH3
C O
CH3
Telephiose E (5)
Telephiose E (5) は無晶形粉末で、[α]D +36.7°(MeOH) を示し、negative FAB-MSでは、
m/z 795に [M-H]- に由来するpeakを示す。TLC上で硫酸発色すると紫赤色を呈す。
その1H-NMRスペクトルでは、δ 1.89 (3H, s)、2.10 (3H, s) に2個のacetyl 基のsignal、 および δ 7.31 (2H, t, J=7.9 Hz)、 7.45 (1H, t, J=7.3 Hz)、7.50 (1H, t, J=7.3 Hz)、7.57 (2H, t, J=7.9 Hz)、8.18 (2H, d, J=7.3 Hz)、8.46 (2H, d, J=7.3 Hz)にaromatic proton signalを示す。δ 3.90から6.49の領域はsignalが密集し、糖残基の存在が推定された。
13C-NMRスペクトルも、1 に非常に類似している。 δ 63.1 から106.7の間に、3個の hexosyl基に由来するとみられるsignal が計18個見られる。この中の δ 106.7、103.3、
92.9は、それぞれに糖残基のanomeric carbon signalであると推定された。さらに、δ 103.3 のsignalは4級炭素であることより、fructofuranosylの存在を予想させる。δ 20.5、20.8 のsignalから、2個のacetyl methyl groupの存在が示唆された。δ 128.4より133.5の carbon signalより、benzoylの存在が予想された。低磁場に見られる δ 166.6、166.7、170.1、170.9 は、4個のcarbonyl carbon signal に帰属される。
従って、5の基本骨格は1と同じ、3個のhexosyl基と2個のbenzoyl基、さらに2個 の acetyl基から成ることが推定された。
5の HMQCスペクトルによって、δ 6.49、4.92 のsignalは、glucopyranose anomeric proton に帰属された。また、HMBC により、δ 6.44のsignal はfructofuranoseのH-3と判明し た。続いて、5 の 1H-1H COSYにより、糖部のproton signal はTable 5 のように帰属さ れた。さらに、anomeric proton のcoupling constant (J=3.1 Hz、J=7.3 Hz) から、
α-D-glucopyranosyl、および β-D-glucopyranosyl 各1個が結合していることが判明した。
さらに、HMBCスペクトルより、1のように糖と糖の結合関係がわかった。
Table 5. 1H and 13C-NMR Data for Telephiose E (5) (in pyridine-d5)
position 1H 13C
glc
1 6.49 (1H, d, J=3.1 Hz) 92.9
2 4.34 (1H, dd, J=3.7, 9.8 Hz) 79.2 3 6.38 (1H, dd, J=9.8, 9.8 Hz) 75.7 4 4.12 ( 1H, dd, J=9.8, 9.8 Hz) 71.8
5 3.97 (1H, m) 78.6
6 4.32 * 63.2
4.51 *
Glc
1 4.92 (1H, d, J=7.9 Hz) 106.7
2 4.32 * 75.2
3 3.97 * 78.0
4 3.90 * 74.4
5 4.93 (1H, m) 71.6
6 4.52 (1H, dd, J=5.8, 11.9 Hz) 63.1
4.54 *
Fru
1 4.47 (1H, d, J=12.2 Hz) 64.5
5.15 (1H, d, J=12.2 Hz)
2 103.3
3 6.44 (1H, d, J=8.6 Hz) 79.0
4 5.23 (1H, dd, J=7.9, 8.6 Hz) 73.4
5 4.72 (1H, m) 84.8
6 4.75 (1H, dd, J=6.4, 12.4 Hz) 64.4 5.00 (1H, dd, J=3.4, 12.4 Hz)
Ac(Fru)
1 170.6
2 2.10 (3H, s) 20.5
Ac(glc)
1 170.2
2 1.89 (3H, s) 20.8
Bz(glc)
1 130.6
2, 6 8.18 (2H, dd, J=1.2, 7.9 Hz) 130.1
3, 5 7.31 (2H, t, J=7.9 Hz) 128.4
4 7.45 (1H, t, J=7.9 Hz) 132.2
α 166.6
Bz(Fru)
1 131.7
2, 6 8.46 (2H, dd, J=1.2, 7.9 Hz) 130.5
3, 5 7.57 (2H, t, J=7.9 Hz) 129.2
4 7.50 (1H, t, J=7.9 Hz) 133.5
α 166.1
*overlapped with other signals
また、糖部のprotonのchemical shiftを観察すると、fructofuranosyl基のanomeric proton ならびにH2-6の低磁場shift値が特に大きく、benzoyl 基或いはacetyl 基がこの位置に結 合していることが示唆された。また、HMBCでは、 fructofuranosyl 基の H-1と δ 170.1 の間に、また H2-6 と δ 170.9のcarbon signalの間にそれぞれ関連があることを示した。
これにより、acetyl 基が糖部に結合する位置が判明した。さらに、α-D-glucopyranosyl の 3位、および fructofuranosyl の3位の proton signal がそれぞれ δ 6.38、6.44 に現れ、通 常より低磁場へシフトすることによって、benzoyl基の結合位置が判明された。従って、
Telephiose E (5) の構造は式のように決定した。
Telephiose E (5) C
O OH
O
O O O
HO
OH
O
HO OH
HO C
O CH3 O O
HO
O
O C O
CH3 C
O
Telephenone A (6)
Telephenone A (6) は黄色の粉末で、negative FAB-MSでは、m/z 437に [M-H]-に由来す るpeakを示す。TLCはUV下紫赤色を示し、硫酸で発色すると黄色を呈す。UV λmaxは 211、314 nmにpeakを有する。
まず、6 の13C-NMRスペクトルを見ると、δ 55.8 にmethoxy基に由来するsignalを示 す。やや低磁場の領域では、1個の糖残基に由来するsignal が δ 62.1、71.4、74.2、77.0、
80.3、82.9 に見られる。 さらに δ 96.7 から197.4 までの領域に13 個のcarbon signal が出現することから、xanthoneの構造骨格の可能性が予想された。その中、δ 197.4は carbonyl 基の signalであると考えられる。
一方、6 の1H-NMRスペクトルでは、δ 3.69 (3H, s) にmethoxy 基の proton signalを示 す。糖部の領域に現れたsignal を詳細に解析すると、そのanomeric carbon signalは δ 5.84 (1H, d, J=9.8 Hz) に出現するものと推定された。
それから、1H-1H COSYスペクトル (Fig. 6) により、糖部の proton signal が帰属され た。低磁場の領域では、δ 8.04 (1H, d, J=2.3 Hz)、7.70 (1H, dd, J=2.3, 8.4 Hz)、6.90 (1H, d, J=8.4 Hz)、6.49 (1H, s) などのsignal が観察された。これらのproton のcoupling constant から、ortho、ortho-meta ならびに meta coupling が存在することが判った。δ 6.49 はsinglet signalであるから、xanthone骨格上にあるprotonの結合位置を推定すると、δ 8.04、7.70、
6.90 の3個のprotonはすべて一方のベンゼン環に存在し、即ち、1, 2, 4位、または 1, 3, 4位に結合するものと予想された。
Table 6. 1H and 13C-NMR Data for Telephenone A (6) (in pyridine-d5)
Position 1H 13C
1 ---- 134.8
2 8.04 (1H, d, J=2.4 Hz) 117.6
3 ---- 147.6
4 ---- 152.2
5 6.90 (1H, d, J=8.6 Hz) 111.1 6 7.70 (1H, dd, J=2.1, 8.1 Hz) 122.7
1’ ---- 108.2
2’ ---- 160.8
3’ ---- 105.6
4’ ---- 162.6
5’ 6.49 (1H, s) 96.7
6’ ---- 160.4
Carbonyl ---- 197.4
Methoxyl 3.69 (3H, s) 55.8
Glc -1 5.84 (1H, d, J=9.8 Hz) 77.0 -2 4.90 (1H, dd, J=8.5, 9.8 Hz) 74.2
-3 4.40 * 80.3
-4 4.44 * 71.4
-5 4.13 (1H, m) 82.9
-6 4.48 (1H, dd, J=2.4, 11.6 Hz) 62.1
4.44 *
*overlapped with other signals
Fig. 6. 1H-1H COSY Spectrum of Telephenone A (6) (in pyridine-d5)
次に、HMBC (Fig. 7)、およびcarbon signalの chemical shiftによって、それぞれのproton の位置を帰属した。 δ 6.49 はxanthone 骨格のH-5又はH-7 に帰属されることが判った が、他の3個protonの結合位置を決める際、xanthone骨格では矛盾を来たした。HMBC では、δ 197.4のcarbonが2個のprotonとの関連が明瞭に見られたが、これもxanthone 骨格では説明出来ない。
Fig. 7. HMBC Spectrum of Telephenone A (6) (in pyridine-d5)
次に、HMQC (Fig. 8) により、糖部のcarbon signal がそれぞれ帰属された。HMBCで は、糖残基のC-1はxanthone骨格と関連するが判った。さらに、糖残基のC-1由来signal は δ 77.0であることより、本化合物はC-C配糖体であることが判った。
