Hep38.7-Tet 細胞を用いた化合物スクリーニング

最後にHep38.7-Tet細胞に対する既存抗 HBV剤の阻害能を検討するため，逆転写酵素阻

害薬のエンテカビル及びcccDNA形成阻害剤のCCC-0975（図22）の複製阻害活性を検討し た。HBV誘導開始と同時に化合物を処置して6日間培養後，Tet添加培地に交換してさらに 6日間培養後の細胞と培養上清を回収した。回収した細胞から精製したcccDNAをreal time PCR法で，培養上清中のHBeAgをELISA 法で及び細胞毒性を測定し，DMSO処置群と化 合物処置群の測定値から% of controlを算出した。また精製したcccDNAをsouthern blot法 により測定した。結果を図23に示した。エンテカビル及びCCC-0975ともに細胞毒性を示 さない濃度域でcccDNA産生及びcccDNAのサロゲートマーカーであるHBeAg分泌を濃度 依存的に阻害した（A）。またsouthern blot法でもreal time PCR法の結果と同様にエンテカ

ビル及びCCC-0975は濃度依存的にcccDNA産生を阻害した（B）。

図 22 CCC-0975 の構造式

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A HBeAg（ELISA），cccDNA（Real time PCR），Cell viability（CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay）

B cccDNA（Southern blot）

図 23 Hep38.7-Tet 細胞に対する既存抗 HBV 剤の cccDNA 及び HBeAg 阻害と細 胞毒性

*HBV誘導開始と同時に既存抗HBV剤を処理して，培養12日目のHep38.7-Tet細胞から精製したcccDNA をreal time PCR法及びsouthern blot法，培養上清中のHBeAgをELISA法，細胞毒性をCellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assayで測定した。HBV DNAであるrelaxed circular DNA（RC），double stranded linear DNA（DSL），covalently closed circular DNA（CCC）の泳動位置を示した。

次にFDA approval drug screening libraryを用いて，Hep38.7-Tet細胞のスクリーニングツー ルとしての有用性を検討した。標的分子が既知の 414 化合物に対して前述と同様な方法で 化合物（終濃度 10 µM）を処置し，培養上清中の HBeAgを ELISA 法で測定した。DMSO 処置群と化合物処置群の測定値から% of controlを算出し，% of controlが50%未満を示した 化合物を表16に示した。陽性対照化合物のCCC-0975が% of controlで50%未満を示す条件 で，FDA approval drug screening libraryの414化合物中，逆転写酵素阻害剤，HMG-CoA還元

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酵素阻害剤，ステロイドホルモン，免疫抑制剤，テトラサイクリン誘導体の異なる作用機 序の化合物が複数ヒットした。

これらの結果より，Hep38.7-Tet 細胞は化合物の抗 HBV 効果を検出可能であり，新規抗 HBV薬をスクリーニング可能な新規評価系であることが示された。

表 16 Hep38.7-Tet 細胞に対するヒット化合物の HBeAg 阻害活性

Compound HBeAg

(% control) Telbivudine Reverse transcriptase inhibitor 24

Entecavir Reverse transcriptase inhibitor 26 Tenofovir Reverse transcriptase inhibitor 23 Emtricitabine Reverse transcriptase inhibitor 29 Zalcitabine Reverse transcriptase inhibitor 32 Nelarabine Reverse transcriptase inhibitor 28 Pitavastatin HMG-CoA reductase inhibitor 41

Progesterone Steroid hormone 31

Mycophenolic Immunosuppressant agent 32 Leflunomide Immunosuppressant agent 24 Oxytetracycline Tetracycline antibiotic 12 Methacycline Tetracycline antibiotic 11 CCC-0975 cccDNA formation Inhibitor 22

*Hep38.7-Tet細胞でのDMSO処置群と化合物処置群の測定値から% of controlを算出し，% of controlが50%

未満を示した化合物を示した。

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