（第 1 章）
5.2.12. 考察
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図 33 HepAD38 細胞のウイルス複製メカニズム
次にgenotype Dとは異なるgenotype A，B，CのHBV安定発現細胞の取得を試みた。患 者血清から高い複製能を有するHBV配列を正確に選抜するため，HBV増殖能が高い指標で
ある高いHBV DNA量とHBeAg陽性の慢性B型肝炎患者血清を使用し，正確性の高いPCR
酵素を用いてHBV遺伝子を増幅することで，PCRエラーを低減させた状態でHBV配列を 選抜することができた。またHBV安定発現細胞を取得前に，一過性発現系で患者HBVク ローンの複製能を複数のウイルスパラメータで検討することで，患者HBVクローンの複製 能を短時間に確度高く選抜することが可能であった。これらの検討により，複製活性が報 告されている既存のreference配列38）より高い複製能を示すgenotype A，B，CのHBV配列 が同定可能であったと考えられた。また選抜したHBV配列から構築したgenotype A，B，C のHBV安定発現細胞の取得では，遺伝子導入時のトランスフェクション試薬を高い導入効 率で低毒性の試薬を選択し，限界希釈法によるクローニングでは増殖した全細胞について HBV複製能を確認したことで，HBV複製能を有する細胞が取得可能であったと考えられた。
今回取得したHBV 安定発現細胞は既存細胞の HepG2.2.15 細胞より複製能は低いが，細胞 内複製のcore DNA産生能，HBV mRNA転写能及び細胞外複製のextracellular HBV DNA分 泌能，HBeAg分泌能，HBsAg 分泌能が確認されたこと，既存抗HBV 剤の感受性評価では 抗HBV効果を示すことが報告されている複数の化合物27, 28, 29）の感受性が確認され，既報 の結果を反映する結果を示したことから，HBV安定発現細胞は抗HBV薬スクリーニングに 十分使用可能な細胞評価系であることが確認された。またエンテカビルの感受性はgenotype 間でほぼ同等であり，実臨床でのエンテカビルは genotype 間で感受性に違いがないことか
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ら，genotype A，B，CのHBV安定発現細胞は実臨床での抗HBV効果を推測可能であると 考えられた。またHBV安定発現細胞由来ウイルスを感染許容細胞のHepG2/NTCP細胞に感 染させると，細胞外複製の細胞外HBV DNA分泌，HBsAg分泌が経時的に増加したことか ら，感染から複製までのウイルスステップを解析可能であり，取得したHBV安定発現細胞 はウイルス感染評価系の材料となるgenotype A，B，Cの感染性ウイルスを取得するツール にも使用可能であると示唆された。
このことから，既存細胞から選抜した Hep38.7-Tet 細胞及び患者血清から構築した HBV 安定発現細胞は複製能を有する細胞であり，化合物スクリーニング可能な新規genotype A，
B，C，DのHBV安定発現細胞であることを明らかにした。これらのHBV安定発現細胞系
をgenotype A，B，C，Dを指標とした化合物評価に用いることで，pan-genotypicな薬剤や
genotype特異的な薬剤の開発が可能であり，臨床における genotype に対する薬剤の有効性
を推測することも可能であり，またHBVライフサイクルに関与するウイルス因子や宿主因 子を探索することで，新薬の標的因子や genotype の特徴を規定する因子を同定可能と考え られた。さらには今回の細胞取得法はHBV領域に留まらず，他のgenotypeや他のウイルス 領域における安定発現細胞の取得にも応用可能と示唆された。
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6. 総括
本論文は「C 型肝炎ウイルスの新規耐性変異同定法とB 型肝炎ウイルスの新規安定発現 細胞系の構築に関する研究」と題し，2章で構成されている。
第1章では「C型肝炎ウイルスの新規耐性変異同定法に関する研究」と題し，ウイルス複 製過程に必須な酵素であるHCV ポリメラーゼを標的とするJTK-853の患者血清を用いて，
新規の耐性変異同定法の研究を実施した。今回の耐性変異同定法はJTK-853のin vitro耐性 試験で検出された耐性変異が複数の患者で検出され，低頻度の耐性変異も同定可能であっ たことから，耐性変異を確度高く検出可能であることを明らかにした。この耐性変異同定 法により臨床での耐性変異を感度高く検出することで，早期に患者毎に適したDAAの開始 や変更が可能であり，耐性変異により起こるウイルスの再燃を未然に防ぐことが期待され る。また今回の同定法の原理は，HCVポリメラーゼ阻害薬以外のHCVのウイルスタンパク を標的とした他のDAA（NS3/4Aプロテアーゼ阻害薬及びNS5A阻害薬）や他のウイルス領 域における耐性変異解析に対しても応用可能と示唆された。
第2章では「B型肝炎ウイルスの新規安定発現細胞系の構築に関する研究」と題し，世界 で分布している主なgenotypeであるgenotype A，B，C，DでHBV複製活性が高く，化合物 スクリーニングに使用可能な新規HBV安定発現細胞系の構築の研究を実施した。今回取得 したHBV安定発現細胞はHBV発現能を有しており，既存薬の阻害も確認されたことから，
新規抗HBV薬のスクリーニングに使用可能であることを明らかにした。これらのHBV安 定発現細胞系を化合物評価に用いることで，pan-genotypic な薬剤や genotype特異的な薬剤 の開発が可能であり，臨床における genotype に対する薬剤の有効性を推測することも可能 であると考えられた。またHBVライフサイクルに関与するウイルス因子や宿主因子を探索 することで，新薬の標的因子や genotype の特徴を規定する因子を同定可能と示唆された。
さらに今回の細胞取得法はHBVの他のgenotypeや他のウイルス領域における安定発現細胞 の取得にも応用が期待される。
本研究より，HCV領域では薬効予測に重要な耐性変異同定法を，HBV領域では新薬探索 に使用可能な細胞系を確立し，共に新薬創出における新規評価系を構築した。これら評価 系の確立により迅速な新規肝炎治療薬の創出につながると期待できる。
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