（第 1 章）
5.2.9. HBV 安定発現細胞の HBV 複製能
5.2.8.で選抜したHBV安定発現細胞のHBV複製能を検討するために，各HBV 安定発現
細胞を培養開始から 7 日間継続培養した。細胞及び培養上清を回収後，細胞から精製した core DNA，HBV RNA及び培養上清中のextracellular HBV DNA，HBeAg，HBsAgを測定し た。培養開始1，4及び7日目のcore DNAをreal time PCR法及びsouthern blot法で，HBV RNA をRT-real time PCR法で，extracellular HBV DNAをreal time PCR法で，HBeAg及びHBsAg をELISA法で測定した結果を図27に示した。各HBV安定発現細胞のcore DNAはHBV誘 導開始から7日目まで経時的に増加したが，A-1，B-1，C-1由来のHBV安定発現細胞のcore DNA量は既存細胞のHepG2.2.15細胞（genotype D）と比べて，いずれの測定時点でも低か った（A）。またA-1，B-1，C-1由来のHBV安定発現細胞のcore DNAはsouthern blot法で も確認された（B）。さらにHBV RNA（C），extracellular HBV DNA（D），HBeAg（E），HBsAg
（F）もcore DNAと同様に経時的に増加し，発現が確認された。
これらの結果より，A-1，B-1，C-1由来のHBV 安定発現細胞の細胞内ではHBV mRNA
転写，core DNA産生のウイルス複製が，細胞外ではHBV DNA分泌，HBeAg分泌，HBsAg
分泌が起こっており，細胞内のウイルス複製に応じた細胞外へのウイルス分泌が生じてい ると確認された。
A Core DNA（Real time PCR）
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B Core DNA（Southern blot）
C HBV RNA（RT-real time PCR）
D Extracellular HBV DNA（Real time PCR）
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E HBeAg（ELISA）
F HBsAg（ELISA）
図 27 HBV 安定発現細胞の HBV 複製量（core DNA，extracellular HBV DNA，
HBV RNA，HBeAg，HBsAg）の経時変化
*培養開始1，4及び7日目のHBV安定発現細胞から精製したcore DNAをreal time PCR法及びsouthern blot 法，HBV RNAをRT-real time PCR法，培養上清中のextracellular HBV DNAをreal time PCR法，HBeAg及 びHBsAgをELISA法で測定した。 HBV DNAであるrelaxed circular DNA（RC），double stranded linear DNA
（DSL），single stranded DNA（SS）の泳動位置を示した。
5.2.10. HBV 安定発現細胞を用いた化合物評価
HBV安定発現細胞に対する既存抗HBV剤の阻害能を検討するため，逆転写酵素阻害薬の エンテカビルの複製阻害活性を検討した。HBV誘導開始1日後に化合物（終濃度0.03，0.3，
3 nM）を処置して6日間培養後の細胞と培養上清を回収した。回収した細胞から精製した
core DNA及び培養上清中のextracellular HBV DNAをreal time PCR法で測定し，DMSO処置 群と化合物処置群の測定値から% of controlを算出した。結果を図28に示した。エンテカビ
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ルは濃度依存的にcore DNA産生（A）及びextracellular HBV DNA分泌（B）を阻害した。
また% of controlから算出されるエンテカビルのEC50の結果を表18に示した。各genotype のcore DNA 及びextracellular HBV DNAに対するEC50は，core DNAで0.31，2.5，0.15，0.49 nM，extracellular HBV DNAで0.20，0.56，0.069，0.74 nMを示し，core DNA及びextracellular
HBV DNA共にgenotype間で感受性の違いは10倍程度であり，同等の阻害を示した。
A Core DNA（Real time PCR）
B Extracellular HBV DNA（Real time PCR）
図 28 HBV 安定発現細胞に対するエンテカビルの core DNA 及び extracellular HBV DNA 阻害
* HBV誘導開始1日後にエンテカビルを処理して，培養7日目のHBV安定発現細胞から精製したcore DNA
及び培養上清中のextracellular HBV DNAをreal time PCR法で測定した。
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表 18 HBV 安定発現細胞に対するエンテカビルの core DNA 及び extracellular HBV DNA 阻害活性
Cell line Genotype EC50 (nM)
core DNA Extracellular HBV DNA
A-1 A 0.31 0.20
B-1 B 2.5 0.56
C-1 C 0.15 0.069
2.2.15 D 0.49 0.74
*各HBV安定発現細胞において，DMSO処置群と化合物処置群の測定値から% of controlを算出し，% of controlからエンテカビルのEC50を算出した。
次に複数の既存抗HBV剤を用いて，HBV安定発現細胞のスクリーニングツールとしての 有用性を検討した。抗HBV効果が報告されている化合物（逆転写酵素阻害剤：テノホビル，
ラミブジン，エンテカビル，core assembly阻害剤：Bay41-4109，HBsAg分泌阻害剤：HBF-0259，
RNase H阻害剤：β-Thujaplicinol，I型インターフェロンα：IFN，図29）に対して前述と同 様な方法で化合物を処置し，細胞から精製したcore DNAをreal time PCR法で測定した。
DMSO処置群と化合物処置群の測定値から% of controlを算出した結果を図30に示した。既 知の報告より，core DNA産生経路を阻害する6化合物（テノホビル，ラミブジン，エンテ カビル，Bay41-4109，β-Thujaplicinol，IFN）は細胞毒性を示さない濃度でcore DNA産生を 阻害した。一方，core DNA産生とは異なる経路を阻害するHBF-0259はcore DNA産生を阻 害しなかった（A，B）。
これらの結果より，A-1，B-1，C-1由来のHBV安定発現細胞は化合物の抗 HBV効果を 検出可能であり，新規抗HBV薬をスクリーニング可能な新規評価系であることが示された。
Bay41-4109 HBF-0259 β-Thujaplicinol
図 29 Bay41-4109，HBF-0259， β-Thujaplicinol の構造式
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A Core DNA（Real time PCR）
B Cytotoxicity（CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay）
図 30 HBV 安定発現細胞に対する既存抗 HBV 剤の core DNA 阻害と細胞毒性
*HBV誘導開始1日後に既存抗HBV剤を処理して，培養7日目のHBV安定発現細胞から精製したcore DNA をreal time PCR法，細胞毒性をCellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assayで測定した。
5.2.11. HBV 安定発現細胞の感染性ウイルス産生能
最後にHBV安定発現細胞由来ウイルスの感染性及び複製能を検討した。安定発現細胞の 培養上清から精製，濃縮したウイルスを感染許容細胞の NTCP 恒常発現 HepG2 細胞
（HepG2/NTCP細胞）に感染させ，18日間継続培養後の培養上清を回収した。培養開始7，
11，14及び18日目の培養上清中のextracellular HBV DNAをreal time PCR法で，HBsAgを ELISA法で測定した結果を図31に示した。各HBV安定発現細胞のextracellular HBV DNA
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（A）及びHBsAg（B）はウイルス感染開始から18日目まで経時的に増加したが，A-1，B-1，
C-1由来のウイルス感染細胞のextracellular HBV DNA及びHBsAg量は，HepG2.2.15細胞由 来のウイルス感染細胞と比べて，いずれの測定時点でも低かった。
A Extracellular HBV DNA（Real time PCR）
B HBsAg（ELISA）
図 31 HBV 安定発現細胞由来感染細胞の extracellular HBV DNA 量及び HBsAg 量の経時変化
*HBV感染7，11，14及び18日目のHBV感染細胞の培養上清中のextracellular HBV DNAをreal time PCR 法，HBsAgをELISA法で測定した。
次にHBV安定発現細胞由来のウイルス感染細胞に対する既存抗HBV 剤の阻害能を検討 するため，逆転写酵素阻害薬のエンテカビルの複製阻害活性を検討した。前述と同様な方
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法でエンテカビル（終濃度10 µM）を処置し，細胞から精製したcore DNAをreal time PCR 法で測定した。DMSO処置群と化合物処置群の測定値から% of controlを算出した結果を図 32に示した。エンテカビルはHBV安定発現細胞のcore DNA産生を阻害した。
これらの結果より，A-1，B-1，C-1由来のウイルスは感染許容細胞に対して感染性及び複 製能を示すことが確認された。
図 32 ウイルス感染細胞に対するエンテカビルの core DNA 阻害
*HBV感染6時間後にエンテカビルを処理して感染18日目のHBV感染細胞から精製したcore DNAをreal time PCR法で測定した。
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