Cyp4f39 の欠損によるマイバム脂質中の C16:1 OAHFA の減少

3. ω 水酸化脂質による涙液バリア形成機構の解明

3.2. 結果

3.2.4. Cyp4f39 の欠損によるマイバム脂質中の C16:1 OAHFA の減少

Cyp4f39がマイボーム腺においてOAHFAの産生に関わることを明らかとする

ために，LC-MS/MSを用いたマイバム脂質中のOAHFA解析を行うこととした。

しかしながら，OAHFAのLC-MS/MSによる解析法は十分に確立されておらず，

標準品も市販されていないことから，特異的な分離分析は困難であった。そこで本研究では，初めにOAHFAの標準品として[(O-C18:1)-ω-OH C22:0 FA]をω-OH behenic acid (C22:0 FA)とoleoyl (C18:1) chlorideを有機化学的に縮合させることで作製した。作製したOAHFA 標準品をLC-MS/MS を用いたプロダクトイオンスキャンによって測定した結果，[C18:1 FA−H]^–に帰属されるm/z 281.06と

図 19. Cyp4f39 欠損マウスにおけるマイバム脂質合成関連遺伝子の正常な発現

12 ヶ月齢のコントロールマウス [Tg-Cyp4f39^+/+（n=3）] と Tg-Cyp4f39⁻^/⁻マウス

（n=3）のマイボーム腺から総RNAを調製し，定量的RT-PCR を用いてマイバム脂質合成関連遺伝子（Awat1, Awat2, Far1, Far2,

Soat1, Cyp4f39）とハウスキーピング遺伝子としてHprtの発現量を定量した。各

遺伝子の発現量は，Hprtの発現量に対する相対値として求め，平均値±標準偏差を示し，Student’s t-検定によって有意差を求めた。*P<0.05; Tg –/–，Tg-Cyp4f39⁻^/

−

[M−H−(C18:1 FA−OH)]^–に帰属されるm/z 354.95の2つのフラグメントイオンが検出され，目的のOAHFA標準品であることが確認された（図20A，B）。また，

OAHFAは構造中に ω-OH FA を有するとされているが，水酸基の位置異性体が

存在する可能性も想定された。生体内の水酸化 FA としては，ω-OH FA に加えて，Fa2h（Fatty acid 2 hydroxylase）によって産生される脂肪酸2 (α)位が水酸化されたα-OH FAが知られている^1,80)。本研究では，α-OH FA を構造中に含むOAHFA

（α-OAHFA）が存在する可能性を考慮し，OAHFAと同様の手法で

[(O-C18:1)-α-OH C22:0 FA]も作製し，標準品として用いた。

次に，OAHFAを高感度に検出するために，OAHFAがカルボン酸を構造中に

有することを利用し，一般に FA の誘導体化などに用いられている N-(4-aminomethylphenyl)pyridinium（AMPP）による誘導体化を行い，LC-MS/MSによる多重反応モニタリング（MRM）のメソッドを作製した（表8）。この際に，LC の移動相条件の検討も行い，合成した2つの標準品（OAHFAおよびα-OAHFA）を用いて，両者が分離可能な系を作製した（図20C）。

確立した測定条件を使用してコントロールマウスおよび Tg-Cyp4f39⁻^/⁻マウスのマイボーム腺におけるOAHFAの解析を行った。その結果，OAHFAのみがコントロールマウスで検出され，α-OAHFA は検出されなかった。検出された OAHFAについて，コントロールマウスではC16:1（図20D，G），C18:1（図20E，

G），C18:2（図 20F，G）FA を構造中に有する OAHFA（C16:1 OAHFA，C18:1 OAHFA，C18:2 OAHFA）が検出され，C16:0とC18:0 FAを含むOAHFAはみられなかった（図20G）。また，いずれのOAHFA分子種もC30–36の鎖長のω-OH FAを有することが示された。検出されたOAHFAのうち，C16:1 OAHFAを構成

するω-OH FAはほとんどが一価不飽和型でありC34:1を含む分子種が最も多く

図20. Tg-Cyp4f39⁻^/⁻マウスマイボーム腺におけるOAHFAの減少

（A，B）OAHFA [(O-C18:1)-ω-OH C22:0 FA]のLC-MS/MSを用いたプロダクトイオンスキャン結果。プレカーサ―イオンとして[M–H]^–（m/z 619.5）を選択し，

測定を行った際のMSスペクトルグラム（A）と予想される開裂位置（B）。赤色は水酸化FAを示す。（C）OAHFA構造異性体 [(O-C18:1)-ω-OH C22:0 FAと

(O-C18:1)-α-OH C22:0 FA] のLCによる分離。合成した標準品をAMPP誘導体化し

たのちに MRM で検出を行った。（D–G）12 ヶ月齢のコントロールマウス [Tg-Cyp4f39^+/+（n=3）] とTg-Cyp4f39⁻^/⁻マウス（n=3）のマイボーム腺から脂質を抽出し，AMPP誘導体化を行ったのちに，ω末端にC16:0（G）， C16:1（D，G）， C18:0

（G），C18:1（E，G），C18:2（F，G）FAを有するOAHFA分子種について

LC-MS/MSによるMRM解析を行った。OAHFAを構成するω-OH FAの鎖長および

不飽和度ごとのピーク面積（D–F）とω末端のFA分子種ごとのピーク面積の合計（G）。グラフの下に各 OAHFA の簡略化した構造を示す。グラフの値は平均値±標準偏差を示し，Student’s t-検定によって有意差を求めた。*P<0.05; **P< 0.01;

nd, not detected

検出された一方で，飽和型は一価不飽和型に比べて少量が検出されたのみであった（図20D）。C18:1 OAHFAもC16:1 OAHFAと同様にω-OH FAは一価不飽和型が多く，飽和型は検出されず，C34:1を含む分子種が主要であった（図20E）。 C18:2 OAHFAについては，C16:1，C18:1 OAHFAと異なり飽和型，一価不飽和型いずれのω-OH FAを含むものも検出され，飽和型ではC32:0が，一価不飽和

型ではC34:1を有する分子種が主要であった（図20F）。

Tg-Cyp4f39⁻^/⁻マウスについてもコントロールマウスと同じ測定を行った。その

結果，C16:1 OAHFAについてはすべての分子種でコントロールマウスと比較し

て減少が確認された（図 20D）。また，飽和型の ω-OH FA を有する分子種では

C30とC32:0において，一価不飽和型ではC32–36:1において有意な減少が示さ

れ，C16:1 OAHFAの全体量としてはコントロールマウスの約20%であった（図

20G）。その一方で Tg-Cyp4f39⁻^/⁻マウスでは，コントロールマウスと比較して，

C18:1 OAHFAについては全体で約50%，C18:2 OAHFAについては90%以上が残

存していた。C18:1およびC18:2 OAHFA は，表皮でも発現していることが報告されており²⁹⁾，Tg-Cyp4f39⁻^/⁻マウスで検出されたC18:1およびC18:2 OAHFAは，

混入している表皮に由来するものと考えられる。各OAHFAについて分子種別に解析を行った場合でも，C18:1 OAHFAではC32:1のω-OH FAを有する分子種に減少がみられたものの，その他の分子種については有意な差はみられなかった

（図20E）。C18:2 OAHFAについては，すべての分子種でTg-Cyp4f39⁻^/⁻マウスに

おいて減少はみられなかった（図20F）。したがって，Tg-Cyp4f39⁻^/⁻マウスにおいて明らかな減少の確認されたC16:1 OAHFAが，マウスのマイバム脂質における

主要なOAHFAであると考えられる。

ドキュメント内 ω水酸化脂質による体表面透過性バリア形成機構の解明 (ページ 51-55)