143
144
続いて、フラクションaの逆相HPLC分析の結果、G.Uが 5.0以前のフラクションが5 本、G.Uが5.0以降のフラクションが 1本検出された（Fig. 4-8A）。逆相 HPLC分析にお ける糖鎖標準品のラクト—N—ペンタオース（Galβ1,3GlcNAcβ1,3Galβ1,4Glc-PA）のG.Uは
4.34（Fig. 4-7B）である事から、逆相HPLCにおけるフラクション a1〜a5の溶出位置は
ラクト—N—テトラオースのような N—グリカン以外の構成糖および結合様式を有した分子 であることが考えられた。また、G.Uは 5.20 を示したフラクション a6は、M7A の G.U と一致したが、サイズ分画 HPLC 分析における G.Uが M7A と一致しなかったため、フ ラクション a6 も N—グリカン以外の構成糖および結合様式を有した分子であることが考 えられた。
Fig. 4-8. 逆相 HPLCによる SNC曝露区のフラクション a の構造特性別N—グリカンパタ
ーン
A, フラクションaの逆相 HPLC分析結果
B, ラクト—N—テトラオース（Galβ-1,3GlcNAcβ-1,3Galβ-1,4Glc-PA）の逆相 HPLC 分析結 果
A
3 4 5 6
0 10
Fluorescence intensity
Elution time (min) 5
B
0 15 20
Fluorescence intensity
Elution time (min)
5 10
5 6 34
a1 a2
a3a4 a5a6
145
4.3.3.3フラクションb1の構造解析
フラクションbのサイズ分画HPLCにおけるG.Uは遊離型 GNM3Xのものと一致した が、フラクション b の逆相 HPLC 分析の結果、G.U3.0 付近にフラクション b1 およびフ ラクション b2 の 2 本が確認された（Fig. 4-9A）。フラクション b1 およびフラクション b2が混在した状態では酵素消化に影響を及ぼすため、逆相 HPLC分析において再分取を 行った。再分取したフラクションb1の逆相 HPLC分析結果は Fig. 4-9Bに示した。この フラクション b1 の構成糖を確認するため、β−N−アセチルグルコサミニダーゼおよびα— マンノシダーゼ消化を行った。ポジティブコントロールには糖鎖標準品のアガラクトバ イアンテナを用いた。アガラクトバイアンテナのβ−N−アセチルグルコサミニダーゼ消化 の結果、G.U が 1.92 前にシフトしたフラクションが検出され、非還元末端側の GlcNAc が2残基遊離したことを確認した（Fig. 4-10A-II）。続いてα—マンノシダーゼ消化の結果、
G.Uが 1.04および1.72前にシフトしたフラクションが検出され、非還元末端側のα—マン ノースが2残基遊離したことを確認した（Fig. 4-10A-III）。ポジティブコントロールの結 果を踏まえ。フラクション b1 の酵素消化を行った。まずβ−N−アセチルグルコサミニダ ーゼ消化の結果、G.Uが 1.06前にシフトしたフラクションが検出され、非還元末端側の
GlcNAcが 1残基遊離したことを確認した（Fig. 4-10B-II）。続いてα—マンノシダーゼ消化
の結果、G.Uが 1.04および1.97前にシフトしたフラクションが検出され、非還元末端側 のα-マンノースが2残基遊離したことを確認した（Fig. 4-10B-III）。
146
Fig. 4-9. 逆相HPLCによる SNC曝露区のフラクション bの構造特性別糖鎖パターン
A, フラクションbの逆相 HPLC分析結果 B, フラクションb1の再・逆相 HPLC分析結果
-5 0 5 10 15 20 25 30
3
0 5 10
Fluorescence intensity
Elution time (min)
4 5
A
Elution time (min)
0 10
Fluorescence intensity
b1
B
5 3 4 5
b1 b2
147
Fig. 4-10. フラクション b1 のβ−N−アセチルグルコサミニダーゼおよびα—マンノシダー
ゼ消化産物のサイズ分画HPLC 結果
A-I, アガラクトバイアンテナ、A-II, A-IIの A-Iの β−N−アセチルグルコサミニダーゼ消
化後、A-III, A-IIのα-マンノシダーゼ消化後
B-I, b1、B-II, B-Iの β−N−アセチルグルコサミニダーゼ消化後、B-III, B-IIのα—マンノシ ダーゼ消化後
10 15 20 25
3 4 5 6 7
Fluorescence intensity
Elution time min
*
*
*
*
10 15 20 25
Elution time min
3 4 5 6 7
Fluorescence intensity