1,∞  1.磁 1,00 0.86

185± 72 168± 67 60± 33 44± 16

N.D.

N,D.

1,27   1.34   3.25 1,10   1.12   3.00 1.09   1.05   3,20

1,40 1,Ъ  3.25

1.08  1.12  3,46 3.75   3,91   2.47

0.96 0.74 0.91 0,86 0.騨 0.86

22

6.2 4.7 4.2 2.2 2.3

N.D.:not detected.

η

０ 劇 Ｎ く

lo       20

Elution volume(ml)

Fig. Ⅲ̲2 Superdcx 75HR gclぃfittration chЮmatography oF uncross̲tinked PG fragments.

Uncross■inkcd PG from M′

"9"∫ was digested with iysozyme at 37℃  for 3hr and pu fied as dcscribed in Mcthods.  An aliquot、 vas applicd ontO a Supcrdex 7511R colllmn and etuted

with O。05 M ammoniurl acctatc,pH 7.5。   PG was monitored by mcasuring thc absorbency a仕 220 nm.  Ffactions l to V were coWected and lyophilizcd.  Void vOlumc(VO)and the

etution Position of chitin hcxamer are shown by black and whitc arrows,respcctively.

6 hr. 48 hr.

Elution volume(ml)

Fig.Ⅲ

‑3 Effects oflysozyme treatment on elution Pattem of uncross■ inked PG fragment.  Uncross■

inked PG from 

_ん■ J′彪

"∫

 was digested with hen egg

lysozyme at 37R3 for the indicated time pe

od and chromatographed on a

Superdex 75HR column as descibed in Fig. Ⅲ^‑2

り

GluNAc‐ [urNAc‐

￨

L―Ala

l

D―Glu

l

L―Lys or Dap

￨

D―Ala

n≧ 2

Fig.  Ⅲ ‐4.  Minil■ um PC}structure rcquired for induction of antibactcrial protein synthesis in

】ο

"♭ノズ ο^r,.

第^4節

 

^{考 察}

哺乳 類 にお いて、

PGの

持 つ免疫 学 的効果 につ いての報告 は多 く、マイ トジェン効 果 ^8oゃ

B細

_{胞活性化 舒}^)、 あるい はマ クロフ ァー ジに働 き^IL‑1、 IL‑6、 TNF―αな ど各 種サ イ トカイ ンの誘発 を促す ^{88、 89、 9い}。最近 の報告で はマウス のマ クロファー ジにお いて

PGが

L‐12の合成 を誘導す る ことが示 され た^9り。 この IL‑12の 誘導で は

PG構

造 に特 異性 が認 め られ、B.解 θ^gαr"′μ 由来 の細胞壁

PGで

は誘導効果が認 め られたが 肱 ′"″"∫ 由来 の細胞壁

PGで

は lC10μ _g′

ndの

濃度 にお いて も

IL‑12 mRNAの

発現 は認 め られ なか った。 この結果 は本章で示 した

PG構

造特 異性 と一致 す る。 さ らに、 この マ ウス にお ける^IL‐

12の

_{誘 導 は}

PGを

リゾチー ム によ リー 晩処理 した場合、その効果 が消失す る事か ら、このマウス のIL‐12誘導系 にお いて もある程度 の分子量 を持つ

PG

構 造 が 必 要 で あ る と考 え られ る 。 ま た 、MurNAc‐L―Ala― D‐isoGlu(MDP)は ア ジ ユ バ ン

ト活性 をもつ

PGの

最小構造 として知 られているが、

PGあ

_{るいは可溶性高分子}

_PG

では補体活性化効果が認め られるのに対 し、

MDPや

モノマーの

PGユ

ニ ッ トのでは

そ の 効 果 が 認 め ら れ な い 9D。

そ の 一 方 で 、MDPや mumEdy t pep deで は ア ナ フ ィ ラ

キ シー 反応 の誘発 を起 こす のに対 しテ トラベプチ ドを持つモ ノマー の

PGユ

_{ニ ッ ト以}

上や高分子

PGで

はそ のよ うな効果が認 め られない^99。

カイ コにお いて も第 Ⅱ章で示 したよ うに

MDPで

は抗菌性 タ ンパ タ質誘導 が認 め ら れず 、 さ らに本章 の結果 で は抗菌性 タ ンパ ク質誘導 には一定構造 の

PGが

必要である ことが明 らか とな った。 また、 フェノール オキ ンダーゼカスケー ド系の

PGに

よる活 性化 に高分子 の不溶性

PGが

必 要で あ り、 リゾチーム処理 した低分子

PCで

は活性化 が起 こ らない ^41)。 また、カイ コー 匹当た りlμ

gの

_高分子

PGを

注射 した場合 、体液 の激 しいメラニ ン化 が起 こるが、 フラクシ ョンⅡや リゾチーム処理 した細胞壁

PGで

は50 μ Bの 注射で もメラニ ン化 は認 め られなか った。 これ らの結果 はカイ コにはフェ ノール オキ シダーゼ系 と抗菌性 タ ンパ ク質誘導系の二つの異な った

PC認

識 システム の存在す る可能性が考 え られ る。

51

第Ⅳ章

 

カイ コ抗商性 タンパ ク質誘導におけるペプチ ドグリカン認識 タンパク質について

第1節

 

^緒言

第 Ⅱ章及び第 Ⅲ章 に述べた結果 よ り、カイコ抗菌性タンパク質誘導に特定構造の

PGが

パ クテ リア感染 のシグナル として働 いていることが明 らか となった。また、血球 をほとん ど含 まない ^,η ソデrr9の 脂肪体培養系で、添加 した

PGに

よ り抗菌性 タ ンパ ク質が誘導 され た。

PCが

親水 性であ りそれ 自体が細胞膜 を通過す る とは考 え られない ことか ら、

PGに

よる抗菌性 タンパ ク質 の誘導 には、その細胞外 シグナルを細胞内に伝達する経路が必要 と な り、脂肪体細胞表面 に

Pcを

認識す る レセ プターの存在す る可能性が考 え られ る。また、

脂肪体 はカィ コ体液の血漿 タンパ ク質の合成 を行っていることか ら、脂肪体よ り分泌され た体液成分 の中に

PG認

識 タ ンパ ク質が含 まれている可能性 も考 え られ る。哺乳動物にお いて

LPSは

パ クテ リア感染 のングナル として働き、さまざまな免疫反応 を引き起 こすが、

ここでの

LPS認

識 システム は液性成分であるLPS bindng p「

Otdn(LBP)が LPSと

_{結合 し、}

LPS―

LBP複

合体 を形成 した後 マク ロフ ァー ジ細胞表面 に存在す る

CD14に

_{よって認識 さ}

れ る もので ある ^626)。 も しこれ と同 じ様 な システムがカイ コに存在す るな ら、体液中に ある

PG結

_{合 タ ンパ ク質が}

_PGと

複合体 を形成 した後、脂肪体制胞 に存在す るレセプター に結合す る可能性 も考 え られ る。 これ までに昆虫におけるバ クテ リア構成成分の認識シス テム として明 らか にされているものにはフェノール オキシダーゼ系の β■,3‑グルカ ン認識 タ ンパ クおよび

PG認

識 タ ンパ クが ある^6)。 また、一部の昆虫では体液 中に存在す る レク チ ンが糖 タ ンパ クを認識 しオプソニ ンとして働 くと考え られている。 しか し、前述 したよ うに抗菌性 タンパ ク質の誘導因子で ある

PGを

リゾチーム処理 し低分子化 した場合ではフ ェノール オキンダーゼ系の活性化 は認め られない。 また、 レクチ ンによる糖認識 に比べ、

誘導 に必要な

PG構

造 の特異性が極めて高い ことな どか ら、抗菌性 タンパ ク質誘導系の認 識 システム は これ らのシステム とは明 らか に異なると考 え られる。

PGは

_{哺乳類 の免疫担}

当細胞 にも直接作用 しサイ トカイ ン誘発な ど、さまざまな免疫反応 を活性化する。そのた め、哺乳動物 において も

PG結

合 タ ンパ クの検索 を含 め

PG認

識 システム全般の解明が試 み られて いるが現在 までほ とん ど明 らかになっていない。また、マウスマクロファージの IL‑12誘 導 に必要な

PCが

、カィ コの場合 と似かよった構造特異性 を示す という報告 ^91)が ある ことか らも

PC認

識 システム は昆虫に限 らず哺乳類 にまで共通 して存在する可能性が

考 え られ る。そ こで本章では抗菌性 タ ンパ ク質誘導 に関わるバ クテ リア認識 システムの解 明 を 目的 とし、

PG結

合 タ ンパ ク質 の検 出系の確立な らび に、それ を用 いたカイ コの

PG

認識 タ ンパ クの検索 と同定 を試みた。

53

第^2節

 

材料および方法 2‑1材 料

(1)バ

クテ リア及びペプチ ドグリカン

】. ιgα′射

" NCIMB 12520(】_″p・メン∫つはThc National Collccdon of lndust al and Ma nc Bactetta LTDよ り入 手 した 。 これ 以外 のパ クテ リアは第 Ⅱ章 、第 Ⅲ章 に記 載 した ものを 用 いた。細胞 壁 由来

PG及

_{び直 鎖 状}

PGは

第 Ш章 に記 載 した もの を用 いた。

(21 試 薬

SulfosucccinimidyI  N―_{(Dぃbiodnyl)‐}6‑aminohcxanontc  (BiOtin̲ACs‐ SuifO̲Osu),  6‑(6‑

HydmzidOhexyl) amidohexyl  D―biottnamide  (BiO― Sulfo―Osu), 1‑phemyI̲2‑tiourca, ethylendiamin― N,N,N',N'― tetrttcetic id〕disodium salt,dihydmte(EDTA‐

2Na)以

_{上 の 試 薬 に}

つ い て は 和 光 純 薬 工 業 仰 よ り購 入 した 。 SuIFosuccinimidけ 12‑Φ―azidOS』絶ytamidO)ethメー_1‐

3'‐dihioproPinate,(sASD)及 _び 1,3,4,6‐ tctmchiofo‐3α ^{‑6α ―}dipheny181ycou

I(IoDO̲GEN

Iodinanon Reagent)以 上 の試 薬 につ い て は

PIERCE社

よ り購 入 した 。 3‑(牛Hydfoxyphenyl) pЮPionic acid N‐hydЮ xysuccinimide,(B01tOn̲Hunter Reagcnt)は

  Aldich  chem.∞

.よ り phenylmehylsulfonyIΠ_uo

de(PMSF)は

_{sigma社 よ り} 1,10‑phenanthroline monohydratcは ナ

カ ラ イ テ ス ク 柳 よ り Na[12SI]、 _ピ^SI]―BOlutOn̲Hunttr試_{薬 は} Du Pont,NEN Rescrch PfOducts よ りそれぞれ購入 した。

 

ア フィニティーカ ラムの担体で ある ForlnyI―cellulonncは 生化 学 工 業 儡 よ り 購 入 し た 。

 3‐

[(3‐cholamidoproPyl)dmethylammonio]‑1̲propanesuFonate (CHAPS)は 仰 同仁化学研究所

 

よ り購入 した。

1)方

法

(1)PG‐ Ammity colummの 調製

M′

"セ"∫

直鎖状

PGは

第 Ⅲ章で述べ たよ うにペ プチ ド間側鎖 を欠 いているため、ペプ チ ド側鎖 に含 まれ る リジン残基 は遊離の ε^̲アミノ基 を持 っている。そ こで、

PGと

結合 す るタ ンパ ク質 を得 るために

PGを

リガ ン ドとし、遊離のア ミノ基 を介 して担体 に結合 させ たア フィニティヵ ラムを調製 した。平均糖鎖長

22の M′

"ιヵ∫直鎖状

PGを

使用 し、カ ラ ム の調製 は担体購入時付随のテ クニカル マニ ュアル に従 った。湿重量

7m8の

_{ホル ミルセ}

ル ロファイ ン担体 に

M′

"θ"d直鎖状

PG溶

液 (4mg/ml,0.2Mリ ン酸緩衝液

PH7.0)7mlを

加 え、室温にて

12時

間振 とうしなが らイ ンキュベー トした。還元剤 の Sodium cyano boЮ

hydride(SCBH)を 49mg加

_{え、さらに室温で}

2時

間イ ンキュベー トした。ブフナー 漏斗を用いてグルを蒸留水で洗浄 した後、ブロッキング緩衝液 (0。2M T s̲HCI,pH7.0)を 14mi加 え、再び室温で3時 間振 とうした。グルを蒸留水で洗浄 し

0.lMリ

_{ン酸緩衝液,PH7.0,} に懸濁 した。調製 した担体は^BIO‐

RAD社

のPoly―Prep chЮmatography column(0,8× 4cm)に 充填 し、^4℃にて保存 した。

(2)B.

ι

=α

貯,,μ NCIMB 12520 gη ^‐_{ヵ ざ}^・_{)を 用 い たFH]―}

PGの

調 製

B。 開ι

=″

冽"P4の ジアミノピメリン酸ω^ap)要求性変異株である β_̀PPag=何ι^r'′

NCIMB

12520oη‐,「/d‐)を対数増殖期 まで生育 させた後

PBSに

_{懸濁 した菌体(1.0×} 107∝1に)を

3,7MBqの

_PH]‐

Dapを

_加えた 1000田Iの ペプ トンぃグルコース培地中

(2%ポ

リペプ トン、

0.2%グ_{ル コ ー ス 、}o.5%NaCI、 _20 μ B′

Ru DAP,pH7.2)に

て 一 晩 培 養 し た 。 培 養 後 、 第 Ⅱ章

に記載した方法により細胞壁可溶性

FH]―

PGを 調製した。

(31 F2SI]̲BOltOn― Hunter試薬 に よ る PGの 標 識

F251]標識 した

PGを

用いて結合するタンパク質を検索するために 肱 ′′佗′∫直鎖状

PGを

[1251]̲BoltOn̲Hunter試薬 を用 いて標識 した。Bolton̲Hunter試 薬は水溶液中では不安定で分 解す るため、P251]̲B。ltOn̲Huntcr試薬 はベンゼ ン溶液 として出荷 きれる。まず、ベンゼ ン を留去す るため、乾燥用 Cac12を 充填 した トラップを介 して

N2ガ

スをエ ッペンチュープ

内の『^251]̲B。ltOn̲Hunter試薬 (9。

25MBq)に

吹きかけた。ベ ンゼ ンの留去を確認の後、 こ

こへlm8′ndの濃度で^50m Iホ ウ酸緩衝液 pH8.5に 溶解 した 肱 ′ガじИざ直鎖状

PG溶

液を 50 μI加え、室温にて一晩反応 させた。その後

2Mグ

リシンを50 μI加_{え、反応を停止させ} た。標識された

PGは

Sephadcx G‐25に_{よ り精製 した。}

(4)ASD―

PGの

調 製 斜)

分 子 内 に 活 性 ア ジ ド基 を 持 ち

UV照

射 に よ リ タ ン パ ク 質 と 架 橋 す る Sulfosucci midⅢl

2‑ゅ‐azidOS』icylamidO>thyl‑1‑3'‐dithiopЮ pina俺,(SASD)を用 い て

PG結

合 タ ン パ ク を 検 索 す る た め 、 (2‐P―azid―Salicylamido‑1,3‐ dithiopЮpionate)―PG(ASD― PG)を調 製 し た 。 500 μ lの 肱

′

"セ】s直 鎖状

PG溶

液 (lm8/ml,0,lMホ ウ酸緩衝液〕pH8.5)に 、^10μIの

SASD溶

_液(40mg/mI,

DMSO)を

_{加え、室温にて}

30分

間イ ンキュベー トした。 ここへ再び

SASD溶

液を加え、同

55

様 にイ ンキ ュベー トす る ことで

PGと SASDを

_{反応 させ た。}

lMア

_{ル ギ ニ ン溶液 (0.lMホ}

ウ酸 緩 衝 液

,pH8.5)を

50 μl加_{え未 反応 の}

SASDを

プ ロ ック した後 、20∞×

gで 2分

_間遠

心 を行 い上澄 み を回収 し

21の

PhOsPhate buFfcrcd s』 illc,(PBS)pH7.2に _{対 して透 析 を}

3回

線 り返 した 。透 析 後 、100 μ

lず

つ分注 し、使用 時 まで^‑20℃で 保存 した 。 また、以上 の操 作 は全 て 暗所 、赤色灯下 にて行 った。

15)F2SI]̲ASD"PGの_{調 製}

ASD―

PGを

_醜『^251]にて標識 した。標識の方法はクロラミン

T法

とヨー ドゲ ン法によ

り行ったが、結果的にヨー ドゲ ン法 ^9め によ り比活性の高い標識が可能であったため、以 降の実験で用いたl1251]̲ASD―

PGは

すべてョー ドゲン法によって標識 した。

100 μ lの ヨー ドゲ ン溶液 (40mg/ml,ジ クロロメタン

)を

_{ガラスチュー次}10×75mm)に 入れ

N2ガ

ス置換 しなが ら溶媒のジクロロメタンを留去 し、チュープの底をヨー ドゲンに てコーティングした。予め ¹⁰ μ

l(37MBq)の

NaF251]07GBq/ml)と loo μlの ^ASD―

PG溶

液 (lmg/ml)の混合液をチューブに移 し、室温にて

30分

間反応 させた。未反応のNaF251〕

は Sephadcx G‑25に よるグルろ過によって分離 し、[12SI]̲ASD―

PGの

_{精製を行 った。}

(6)『^251]̲ASD―

PGに

よるフォ トアフィニティラベル

検出対象のタンパク質溶液 とF251]̲ASD‐PG(0.41μ g/tube≒ 1,0× lo6cPm)を エ ッペンド ルフチュープ内にて混合 した後、暗所^27℃で

30分

間インキュベー トした。チュープのふ たを開け、約

5cm上

_{か ら短波長 臥′(260 mm)を 室温にて10分}間照射 した。ここへ等量の SDS sample buffer(679 SDS, 8M urea, 20% 81yccrol, 0.∝ % bromphcnyi blue, o.2M dihi∝_ryh olを_{含 む}125mWI T s―HCi buffcr,pH6.5)を 加 えて

3分

間煮沸 し、 この20 μ^lを

7.5%SDS̲PAGEに

_{供 し、}

_10ovの

定電圧 にて泳動 した。グル は銀染色キ ッ ト (和光純薬⁾ にて染色 した後 、ゲル を乾燥 させ てォー トラジオグラフィー によ り_['51卜ASD―

PCと

_結合

したタンパ ク質 の検 出を行 った。

ドキュメント内 ペプチドグリカンによる抗菌性タンパク質誘導の分子機構 (ページ 50-66)