︐ ︵
剛 剛 剛 畑 ＯＬ協ロュリ畠
2m
Tine(S)
Fige lV‑7 Dose dependent bindng of solubilized Hlembrane proteins.
Sdubilized menbrane pЮtein(40μ l)of he indicated concentraion was 対 eCted in BIAcore 2000甑 d he binding to low molecular weightlinear
PG was measwed.
71
0.2S
1500
0。
2
0。
lS 1000
0.1
500
0。
05
40 60 80
FHiction No.
100
Figo Ⅳ‑8 PG―fo..ュ lyl―cellulorlne colurm chromatography of solubilized fat body membrtte protein.Ftt body cell membrane was solubilized win l%cHAPS and applied to a column(0。8×
4cd ofPG―
foェ▲▲二yl―celluloine equilibrattd wi血 50mlИ MES buffer,PH5,5,contai ng O.579 CHAPSo The coluIIm was washed witt he sanle buffer and eluted wi血 40mi of a linear gradient forlned with O and O.5M KClinthe same buffere lmu fractions were coll∝ ted.Each fracdon was dluted ttn imes wih tte same buffer,甑d ttalyzed by BIACORE 2000。 (中中),A280;仲 H→
,binding to iIImobilized PG;cttWW山 ),KCI。︵ ︐ 比 ▼ 壼 Ｈｏ 畠 Ｂ 留
日目●史弓く
0 0 0 20
９ ５ Ｍ
． Ｍ Ｋ Ｏ ︒
０
﹁ Ｊ
︵ゞ Ч Ｆ 将 ・ 日 山
60
40
Control cell wall lineFr PG
PG LPS
Chltinng.]v̲9 Effect of various giucans and LPS oal he binding of solubilized membrane protein to immobilized PG.PG― binding pЮtein was pl ied by PG‐afflnity columm chromatogmphy.Cdl wdIPG,hnear PG,LPS or chitin was added to the protein sdution(10μg/ml)and the Ыnding to he immobilized cell wall PG was measured in BIACORE 20CpO.The value was exPttSSed as a percentage ofthe maximum binding in the absence ofadded compeuton cdl wЛ I PG,】,′,clLじ刀ゎ 翻,s cell WaⅡ
PG
c250μ g/ml);Linear PG,M加 ″翼d linear PG(250μ g′ml);LPSfЮ
mユ
6οJ,0111:B4(500μ g′ml),Chiun,(500μ g/ml).
73
第
4節
考察これ まで に知 られて いる昆虫 にお けるバ クテ リア認識 に関わ るタンパ ク質は主に
LPS
の認識 に関す るものが ほ とん どであ り、PGに
関す る報告 は少ない。カイコにおいて このPG認
識 システムの検索 を試みた結果、体液 中と脂肪体細胞膜 にPCと
結合す るタ ンパ ク 質が存在す る ことが明 らか となった。体液 に含 まれるPG結
合性 タ ンパ ク質は[12SI]■sD―PG
とSDS―
PAGEを
用 いた フォ トアフィニティ実験 の結果、70kDa付
近 に存在 していた。Asnda
ら6)の単離 した フェノールオキシダーゼ系のPG認
識 タ ンパ ク質(PGRP)は1lkDaの
分子 量 である ことか ら、今 回検 出された体液のPG結
合 タ ンパ クは フェノール オキシダーゼ系 のPGRPと
は異なるもの と考 え られ る。 しか し、P251]̲ASD―PGの
結合がLPS存
在下で競合 的に阻害 された ことか ら、 このタンパ ク質 は
PGに
特異的 とは言えない。脂肪体制胞膜の
PG結
合 タ ンパ クはRI標
識 したPGを
用 いた検索が困難であった。恐 ら くこのタ ンパ ク質 は極 めて微量 にしか存在 しないか、PGと
の親和性が低 く、一般的な レ セ プター検索方法では検 出され難 いのではないか と考え られた。本研究では無菌飼育 した 健常カイ コの脂肪体 を材料 として検索 を試みたが、最近 β.μοr,よ り見つか ったグラム陰 性 菌結合 タ ンパ ク質(GNBP)の場合 90、 バ クテ リアの注射 によ り免疫化 した体液中か ら検 出 されて いる ことか ら、 目的 とす るPG結
合 タ ンパ ク質 もバ クテ リアの感染 によ り誘導 さ れ、脂肪体細胞表面上の数が増 える可能性が考え られる。最終的 に
BIACOREシ
ステムを用 いた結果、1%CIIAPSに
よ り可溶化 した膜 タンパ ク質 の 中にPGと
相 互 作用す るタ ンパ ク質が検 出 され た。セ ンサ ーチ ップに固定化 した β.θど
'9ri"μ細胞壁
PG及
び平均糖鎖長6と 22の 肱 ′"じ"d由来 の直鎖状
PCの
いずれのPG
に も結合が認め られ、PH 5.5の 酸性条件で高い レスポンスが得 られた。一般的に
BIACORE
で表されるレスポンスは溶媒の
pHや
共存する塩濃度の影響を受けるため、pH 5.5の条件 は この タ ンパ ク質 とPGの
結 合 の至 適pHを
表 す と言 うよ りもBIACOREシ
ステム で高 い検 出感 度 を得 るた め の条件 で ある と考 え られ る。
可溶化 した膜タンパク質か らの精製 を目的とし、
Pcを
リガン ドとしたアフィニティヵ ラムクロマ トグラフィを行った結果、100mMの KClに
よ り単一のピークが溶出された。このタンパク質 とセンサーチ ップに固定化 した
PGと
の結合は遊離の細胞壁PGに
よ り阻害され、
LPSで
は阻害されなかったことか らこの結合がPGに
特異的であることが明 らか となった。本研究 によ り検出された脂肪体細胞膜由来のPG結
合タンパク質は現段階では抗菌性タンパク質誘導 に関与する確証は得 られていない。しかし、少なくともフェノール オキシダーゼヵスヶ― ド系の
PGRPと
は異な り、可溶性の低分子PGに
特異的な結合を示し、脂肪体制胞膜 に存在することか ら、パクテリア感染のシグナルを
PGの
形で認識 し、そのシグナルを細胞内へ伝達する働きを持つと考えられる。
75
総 括
昆虫の生体防御反応の一つである抗菌性タンパク質の誘導は、バクテリアの生体内への 侵入の結果、その細胞壁ペプチ ドグリカン(PC)あるいは リポ多糖●PS)が誘導因子 として 働 くことで生 じる。 これまで様々な昆虫より抗菌性タンパク質が数多く発見され、薬理学 的なアプローチか らその抗菌性や有効性に関する研究が盛んに行われた。その一方で、バ
・ クテ リア感染か ら抗苗性タンパク質合成までの誘導経路に関する分子生物学的な立場から の明確な解明を得るまでには至っていない。
本研究では抗菌性タンパク質誘導機構の解明を目的として、哺乳類免疫系でも
LPSと
は異なる新たな免疫活性化因子 として注 目されている
PGに
ついて、カイコにおける抗菌 性タンパク質誘導効果 とPG構
造の相関性およびカィコ生体内に存在すると考えられるPG
認識システムの特定を試みた。
まず、脂肪体組織を培養 し、加 ッ′施 での抗菌性タンパク質誘導系を確立することか ら 初め、以下のような結果を得た。
これまでカィコ生体内に侵入 したバクテリアは血球による食作用を受け、それにより生 じた
PG断
片が誘導因子 として働 く場合や哺乳類に代表されるような免疫担当細胞による 抗原提示を経た結果、抗菌性タンパク質が誘導される可能性が考えられた。しかし、加ッ′ソο での実験系では血球や体液などの役割を明確にすることが不可能であうた。脂肪体を組織 培養 した 滋 ッirroでの実験結果か ら血球の直接的関与が無くても抗菌性タンパク質が誘導 されたことか ら、 この誘導系に血球は必ず しも必要ではなく、体液中に恒常的に存在する リゾテームによる細胞壁分解を経て誘導因子であるPG断
片が生 じ、 これが直接のエ リシ ター として働 くのではないかと考えられる。故にリゾチームは感染初期の抗バクテリアと しての働きのみ成 らず、誘導性の抗菌性タンパク質誘導に必要なPG分
子の生成に関与する可能性が考えられる。 この可能性を証明するには何 らかの形でリゾチーム活性を特異的 に阻害した条件で、同様にバクテリア菌体による誘導実験を検討する必要がある。
この 加 ッ,Pr9の実験ではさらに抗菌性タンパク質誘導が
PG構
造に依存することを示唆 した。また、その結果をもとにM Prrr9Dばょ り調製した直鎖状の
PGを
用いた一連の実験結果か ら抗菌性タンパク質誘導に必要な
PGの
最小構造が特定された。GhNAc―MurNAc
の糖鎖部分 とテ トラペプチ ドか らなるPGの
最小ユニ ットの繰 り返 しが2で
ある糖鎖長 4 のPG構
造が誘導因子 としての最小構造であることが特定され、さらにM′
trセ′∫のようなグラム陽性苗細胞壁
PCに
認め られるPGユ
ニット間を結ぶ特定の架橋構造が誘導因子 と しての働きを阻害する可育酵性が考えられた。 これらの結果はカイコ生体内にあるPG認
識 システムのPG構
造に対する特異性の高さを裏付けるものであった。哺乳動物においてもPGは
バクテリア感染による発熱や睡眠あるいはサイ トカインの過剰分泌に伴う炎症など の誘発因子 として働き、あるいは補体系の活性化やアジュバント効果を持つことが明らか となっている。さらに、 これまでグラム陰性菌により生 じる感染症の原因がLPSだ
けで。はなくグラム陰J陛及び陽性菌に共通 して存在する
PGも
要因の一つであることが明 らとな り、グラム陽性菌のPG構
造 とそれにより生 じる免疫反応の相関性に着目した報告が最近 にな り見受けられる。 これ らの報告のほとんどはPGを
構成するペプチ ド組成のみに注目 し、架橋構造について触れたものは少ない。M JEtyιμざ由来の
PGに
関 した例に、ネズミマクロファージのIと
12誘
導の効果 に関する報告がある。さらに、種々のグラム陽性菌の 感染によるDrodリカ協の抗菌性タンパク質遺伝子の発現効果を検討した報告もある。これ らの結果はいずれも本論の結果 と一致 し、M′
,′ιμざの
PGに
は生体防御反応の誘発効果 が低いことを示 している。PG認
識システムの特定を目的として[1るI]―標識 したPGを
用いてPGと
特異的に結合する生体分子の検索を試みた結果、体液中に
PCと
結合するタンパク質の存在が確認された。SDS―
PAGEの
結果、 この体液タンパク質は約 70k助 の分子量か ら成 り、ビ蓉I]―PCの
結合が非標識の
PGお
よびLPSに
よって阻害された。この[1密I]―I℃ を用いた実験系では脂肪体組 織か らのPG結
合タンパク質の検出には至 らなかったが、BIACORE2000を
用いることで 存在が確認 された。脂肪体制胞膜を1%CHAPSに
よ り処理 しPC―アフィニティカラムを 用いて精製することで得 られた可溶化膜タンパク質はセンサー上に固定化 したPGと
相互 作用 を示 し、脂肪体細胞膜にPGと
結合する膜タンパク質の存在することが明らかとなっ た。センサーチップ上に固定化 したPGと
の結合は遊離のPGに
よ り阻害され、LPSで
は 阻害効果は認められなかった。抗菌性タンパク質産生器官である脂肪体細胞膜のPG結
合 タンパク質は誘導因子であるPGを
認識 し細胞内へのシグナル伝達に関わるレセプターと して働 く可能性が高いと考えられる。体液中にはフェノールオキシダーゼ系に関わるPG
認識 タンパ クぃ RPJの存在が報告 されているが本研究によって検出されたタンパク質 と は分子量が異なる点及び
LPSと
結合を示す ことか らPGRPと
は異なると考えられる。こ の体液中に存在するPG結
合タンパク質が抗菌性タンパク質誘導に関わるとした場合、哺 乳動物におけるLPS認
識 システムであるLPS bindng pЮttin K■BDと CD14の
ようにPGを
77