材料 と方 法

(1)バ

クテ リア

】.,れ ιヵv″^胸山 IF0 12195、 _Aπ,croじοじじ冴d′

"じ

′♂ IF0 3333、

hcル

′Jcttα  cο′,D22、 Arr力′οttc′￠rッ′∫じο∫

"∫ の入手は第 Ⅱ章 に記載 の ものを用 いた。

(2)直

鎖状 ペ プチ ドグ リカ ンの調製

直鎖 状

PGは

Mirelmanら ^83)の方 法 に従 い、 グ ラム陽性菌 にペニ シ リン

Gを

添加 し 架橋 形成 を阻害す る ことによって直鎖状

PGの

_{調製 を した。}

対 数増殖初期 まで培養 したパ クテ リアを 6,000×_8、

10分

間 の遠心 によ って集菌 し た後 、生理食塩水 によ り

2回

洗 浄遠心 を行 った。次ペー ジに示す最 少生育培地 に 10 μg/mlと な るよ うにペニ シ リン

Gを

加 え、先 に集めた菌体 を懸濁 し一晩 ^37℃で振 と う培養 を行 った。培養後 、遠心 によって菌体 を除去 し得 られ た培養液 を

10分

_{間煮 沸}

した。 この時生 じた沈殿 は再 び遠 心 して除去 した。上澄み をエバ ポ レー ター によ り 37℃ で吸引 しなが ら 1/10量 まで濃縮 した後 、低分子量用透析膜 (MW.8,000)に移 し、

0.01M酢

酸 ア ンモニ ウム緩衡液、pH6.5に_{対 し}4℃で透析 を行 った。透析 内液 を0,01M 酢酸 ア ンモ ニ ウム緩衝液 pH6.5によ って平衡化 した DEAE―^Toyopea■ 650M(東ソー)カ

ラム_(15×40mm)に_{供 した後 、}O.01‐

0,3Mの

酢酸 ア ンモニ ウム緩衝液 pH6.5の_濃度勾配 によ り溶 出を行 い分画 した。各 フラクシ ョンの一部 をMorgan‐EIson法 留)を 用 いてN―

アセ チル ヘキ ソサ ミン定量 を行 い、

PGを

含 む画 分 を集 め凍結乾燥 した。

最 少生育培地 lmWI BIycine

lmM LⅢ81utamic acid O.5mM L‐almine O.2mM L‐lysine

lmM M8C12

0.lmM  lnC12

0.17mヽl llracil 3 μ M thiamin 8.2 μ M nicotinamide 28.5m I BIucosc

0,08mヽI Phosphate buffer  pF1 6.8

(3)細

胞壁 由来ペ プチ ドグ リカ ンの調製

直鎖状

PG調

製 時 に得 られ たバ クテ リア菌体 を回収 し、 これ よ り

Hclmannら

^35jの

方 法 に従 い、細胞壁 由来 の架橋構造 を持つ

PGを

調製 した。

バ クテ リア菌体 を、菌体 湿重 量 の

3倍

量 の蒸 留水 に懸濁 し、等 量 のガ ラス ピーズ (0,lmm径^、GMB‑10)と合 わせ 、Bcads Bcaterを 用 いて菌体 を氷冷 しなが ら破砕 した。

菌体 の破砕 を顕微鏡 にて確認後 、静置す る ことでガ ラス ビーズ を沈降 させた。上澄 を 回収 し 450×g、

10分

間遠心 し、残存す るガ ラス ビーズ と未破砕細胞 を除去 し、さ ら に 4℃で 14,000×_8、

30分

間遠 心す る ことで沈 殿 した 白色層 の

PG画

_{分 を得 た。 この}

PG画

分 を遠 心洗 浄 した後 、約 10倍量 の

2%SDSに

懸濁 し、37℃

.12時

間処 理 した。

これ を蒸留水 にて

2回

遠 心洗浄 す る ことで

SDSを

_{除去 し、次 に}

5mM MgC12を

_{含 む}

0.05M Tris‐Ci緩衛液 、PH7.5に 懸濁 し、 ここへ DNase Iを 5μg′mlとな るよ うに加 え、

37℃、

2時

間処理 し核酸 を除去 した。

DNasc処

_{理後、終濃度 100μ}8/mlの ア クチナー ゼ

Eに

_{て 37℃ 、12時}間処理 し、蒸留水 にて

2回

遠心洗 浄 した後、再び0.05M T s̲CI、

PH7.5に

懸 濁 し、終濃度 200 μ g/mlの トリプシ ンを加 え、^37℃、

2時

間処理す る こと で 除タ ンパ クを行 った。

細胞 壁

PGに

はテイ コ酸 が共 有 結合 して いるため、 これ を除去す る目的で終濃度

10%TCAに

よ り4℃で

24時

間撹 拌 した後、遠心 し、得 られ た沈殿 に再び

10%TcA

を加 え、60℃ で

90分

間加熱 しテイ コ酸 を除去 した。

以上 の操作 の後、蒸留水で

5回

遠 心洗浄 を繰 り返 し、得 られ た沈殿 を細胞壁 由来高

39

分子

PCと

_した。

(4)低

分子 ペ プチ ドグ リカ ンの調製

細胞壁 由来

PG及

び直鎖状

PGを

それぞ れ 10m8′mlとな るよ うに

Ò05M酢

_{酸 ア ンモ}

ニ ウム緩衝液,pH6.5に 懸濁 し、 ここへ卯 白リゾチーム を 100μ8/mlの 濃度 で加 え、振 とう しなが ら 37℃ 、

6時

間イ ンキ ュベー トし加水分解 を行 った。反応液 を _{14,000× 8} で

30分

間遠 心 し、得 られ た上澄み を希釈 したア ンモニ ア水 を用 い pH8,0に_{合 わせ 、} CM―Toyopealカ ラム_(12×15mm)を通 しリゾチー ム を除去 した。未 吸着画 分 を再び 凍 結乾燥 した後 、

0.05M酢

酸 ア ンモ ニ ウム緩衝液

pH7.0に

溶解 し、次 のグル ろ過分画 のための試料 とした。

細胞壁 由来

PCの

_{グル ろ過 は} CcIIttOnne GCL‑90mカラム (生化 学工業

)に

^よって

行 い、分子 量 10,000以 上 の可溶性

PGを

実験 に用 いた。

直鎖状

PCの

場合 、Superdex75HRカ _ラム(10×300mm,フ ァルマ シア)を 用 い、0.05M 酢酸 ア ンモニ ウム緩衝液 pH7.0によ り、流速 0.5m1/minで 溶出 を行 った。ペ プチ ド結 合 に 由来 す る

220mmの

吸収 をモ ニ ター し、

5mlず

つ分取 した。カ ラム のキ ャ リブ レ ー シ ョンはBIuc dextran(フ ァル マ シア

)と

chittn hexamerを 用 いて行 った。

(5)アミノ酸分析

試料 に

4N HCIを

加 え、マイ クロキ ャピラリーチ ュー ブ内に封管 し

.105℃

、

12時

_間 加水 分解 した。キ ャピラ リーチ ュープをエ ッペ ン ドル フチ ュー プに移 し、遠心す る こ とで加水分解後 の試料 を回収 した。 これ を凍結乾燥 とミリポア水 による洗浄 を繰 り返 す ことで

HcIを

除去 した後 、ア ミノ酸試料希釈液 に溶か し、島津 ^LC‐

6Aア

ミノ酸 分 析 シス テ ム によ り分析 した。

(61平均糖鎖長 の測定

PGの

平均糖鎖長 は、還元末端 の N―アセチル ム ラミン酸 を水素化 ホウ素ナ トリウムで 選元 し糖 アル コール にして末端 の N‐アセチル ム ラミン酸含量 を定量す る ことで算 出

した。

凍結 乾燥 した 10μ

8の PGに 0.2M水

素化 ホ ウ素ナ トリウム溶液 を 200 μ l加 え、

室温で 15時間反応 させ た後 、 さ らに^60℃、

30分

間イ ンキ ュベー トし、選元 末端 を糖

アル コール化 した。これ に

2M酔

酸 を^100rを1加 え反力ぷを停止 させ た後 、潔紺乾燥 し、

ア ミノ酸分析のための処理 を行 った。平均糖鎖長 は ^N―アセチル ム ラミン酸 と N―アセ チル ム ラ ミシ トールのモル濃度 を算 出 した後 、以下 の式 によ り求 めた。

平均糖 鎖長 =

N―acetylmuramic acid+  N― acetylmuramititol

×

2

N‐acetylmuranlititol

(7)架橋度 の測定

ペニ シ リン

G存

在下 で調製 した

PGが

架橋 のな い直鎖状 の構造 で ある ことを確認す るため遊離 ア ミノ基 のlysinc含量 を測定 した。10μ

8の PGを

²⁰ μlの

80mM炭

酸水 素 ナ トリウム に溶解 し、 これ に Fluorodinitrobenzcne(H)NB)工 タ ノール 溶液(40 μ^l′ml) を2μl加 え混合 し、室温で

12時

間反応 させ た。 これ を凍結乾燥後 、塩酸で加水分解 し、 ア ミノ酸分析 によ り遊離 の リジ ンを定量 した。架橋度 は

FDNB処

理 した試料 と 無処理 の試 料 中の リジンのモル 比 によ り求 めた。

41

第

3節  

結果

(1)直

鎖状ペプチ ドグリカ ンによる抗菌性タンパク質の誘導

抗菌性タンパク質の誘導因子である

PGを

カイコ幼虫に注射 し、体液中に誘導 され る抗菌活性 を測定す ることで

PG構

造 と誘導効果 との相関性 を推察 した。TaЫ

c 

Ⅲ■

に 示 され る よ う に 高 い 抗 菌 活 性 の誘 導 が 認 め られ る βα^c,′′μ∫J,れθ刃ゎ^r ね と

Ar,力Юbαc′θrッ舵ο∫

"∫ 由来の細胞壁

PGに

比べ 肱 ′滋

"ざ

の細胞壁

PGの

誘導効果は低い ものであった。この誘導効果の異なる三種類の

PG構

造を比較す ると、β.′,c力ι″′胴,∫

とA.vittO∫

"dのペプチ ド鎖は、直接架橋 しているの対 し、肱 ′ガ♂

"∫ の細胞壁

PGの

ペ プチ ド鎖 はペ ンタペプチ ドを介 して架橋 している_(Fig.Ⅲ ^̲1)。 それぞれのパ クテ リア か ら架橋構造 を欠いた直鎖状

PGを

調製 し、細胞壁 由来 の

PGと

_{比較 した場合、β}.

′^,c力θηゎ″^,∫ とス.visGοざ

"∫ は 制胞壁 由来

PGと

同程度の誘導効果 を示 したが、M′

"rg′

♂ の場合 は他のバクテ リアとは異なった結果を示 し、ペプチ ド問架橋を欠 くことによ り、

顕者な誘導効果を持つようになることが明 らか となった。

この結果 は、

PCの

側鎖間架橋 はカイコにおける抗菌性タ ンパ ク質誘導にとって必 ず しも必要ではない ことを示 している。さらには、

M′

,どθ

"ざ の細胞壁

PCの

_場合、架

橋部分 にある リジンを含むベ ンタベプチ ドが逆に認識 を阻害 していると考え られる。

Table Ⅲ̲1. Induction of antibactcnal activity by cross―linkcd and uncross̲linked PCs.

CК)ss―linked PGs from the ceII wa1l or uncross― linkcd lincar PGs(lysOZ)′ mC non―treatcd)frOm the cutture medtum were ittected into larvae at a dose of 10  μ8′larva,Values arc the means 土SE)of 4 deternlinations.

Antibacterial aci ty(unitS/mり

Bacteria      cell walI PG       Linear PG

Bαじ,′′

"∫

′,c力ι りbr"ね

      171± 14        163±

4

Arr力′οbrJθ,9rッ,sじο∫,∫      132± 26       102± 37

Aricrοc。じじ

"∫

′

"r9BI∫

       15± 2      212± 37

43

い

)"GluNAc―

MuINAc‐

￨

L‐Ala

l

D―Glu

l

m‐

Dap̲̲D‐

Ala

l      l

D‐

AIn   m‐ Dap

̲      D‐

￨Glu

￨

L‐Ala

l

―MurNAc‐ GluNAc…

(B)― ^GluNAc‐MurNAc―

￨

L―Ala

￨

DぃGlu‐

Gly       Gly l      l

L―Lys‐D―Ala‐L―Lys‐ DぃGlu‐L―Ala‐D‐Ala

l      l

D‐

Ala       L―

_Lys

I

D―Glu― Gly

￨

L―Ala

l

‐MurNAc―GluNAc‐

(C) 

^{―GluNAc‐MuINAc―}

￨

L‐Ala

l

D‐Gluぃ Gly

￨

L‐Lys

I

D‐Ala

l

D―Ala

H8・ Ⅲ■・ Fra8ments orthe structure of PG.

(A),cell WalI PG with direct cross‐ linking from B.′,c力 ?翼″ ′PPa'Sand A.ッ ねじ0ざ′∫;(B),CCll Wall PG with pentapepttde bridge from tt J"じ

"∫;(C),linear uncross―linkcd PG from V.′

"ι

】∫^. Dap,diFuninOpimelic acidt

(2)抗

菌性 タ ンパ ク質誘導 に必要なペプチ ドグ リカ ン最 小構造 の決定

ペニ シ リン

G存

在下 で培養 したMi luteusか ら培地 中に分泌 された直鎖状

PGは

^Fig,

Ⅲ^‑1(C)に示 され るよ うにペ ンタペプチ ド側鎖 の

C末

端 に ^D―

Alaが

付加 した前駆 体 の 形 とな る。得 られ た直鎖状

PGの

平均糖 鎖長 は

22で

あった。 また、 ア ミノ酸分析 の 結果 よ り約

75%の MurNAcに 6個

のア ミノ酸か らなるヘキサペ プチ ド側鎖 が結合 し た形 を成 して いた (Tablc Ⅲ…2)。

この直鎖状

PGを

37℃ で

3時

間卵 白 リゾチー ム処理 し、Superdcx 75HRのゲル ろ過 によ って分画 した_(Fig.Ⅲ‐_2)。 断片化 され た

PGは

溶 出位 置か らフラ クシ ョンI〜

Vに

分 けた。 フ ラクシ ョンI、 Ⅱ及 びⅣ の

GluNAc,MurNAc,Ala,Glu,Gly,Lysの

_{モル 比 は}

1:lB:1:1■ であ り、 これは典型的なM.luttusの直鎖状

PG前

駆体を構成 しているアミ

ノ糖及びアミノ酸の比率 と一致す る。

最 も大きな ピー クを示す フラクションⅣは、平均糖鎖長が約

2で

_{あ り、溶出位置}

が分子量 1236の chitin hexamerと ほぼ同じであることか ら、Fig.Ⅲ

̲lCに

_{示されるよ} うなGluNAc―

MurNAcを 1ユ

ニ ッ トとした二糖か らなる

PGモ

ノマーであると考 え られる。また、 リゾチーム処理 を延長 し

48時

間処理するとフラクシ ョン

I.Ⅱ

、Ⅲ の ピークが減少 し、フラクシ ョンⅣが増加す るσig.Ⅲ ‐^3)。 これ らの結果 はフラクシ

ョンⅣが

PGの

リゾチーム分解 によって生 じる最終産物であることを示 している。

フラクション

I及

び Ⅱは糖鎖長 と溶出位置か ら推定 される分子量よ り考 えて、二糖 で構成 され る

PGユ

ニッ トの繰 り返 しがそれぞれ

3の

timerと

2の

dimerで あると推 測 される。Table,Ш‐

3に

示す ようにフラクシ ョン皿の

GluNAcと MurNAc含

量は Glu に対 し、約 1.4程 度であった。 これはフラクシ ョンШ中の

MurNAcに

、ヘキサペプチ ド側鎖 を久 いた

PG断

片が含 まれていることを意味す る。さ らにフラクシ ョンⅢの平 均糖鎖長 は4.2であるが溶出位置がフラクシ ョンⅡの後である ことと考 え合わせ ると、

フラクシ ョンⅢはヘキサペプチ ドを

2つ

持つ ^dinlcrとヘキサペプチ ドが一つ欠 けた dimerの混合物であると推測 される。フラクシ ョン

Vは

リゾチーム分解 による最 小単 位であるフラクシ ョンⅣよ りも分子量が小さく、アミノ酸 に比べ糖含量が高い こと、

また、アミノ酸組成はヘキサペプチ ドと一致す ることか らヘキサペブチ ド断片 とペプ チ ド側鎖 を欠いた二糖 との混合物であると推測 され る。

これ らの

PG断

片の誘導効果 を検討す るため、それぞれ 10μ gを カイコ幼虫へ注射 し、

24時

間後 に体液 中に誘導 され る抗菌活性 を測定 した。それぞれのフラクシ ョン

Ъ

ドキュメント内 ペプチドグリカンによる抗菌性タンパク質誘導の分子機構 (ページ 41-50)