Pathotype 3.1.2.2.3 SSCP法
3.2 弱毒ウイルス株 CMV-CM95 の干渉効果 .1 材料と方法
3.2.2 結果と考察
図 3-8 CM95 (lane 1) と強毒ウイルス株(lane 2-13)の RT-PCR-RFLP バンドパター ン．
StC (lane 2), MbC (lane 3), AdC (lane 4), Mi (lane 5), Fuka 4-4 (lane 6), GC83 (lane 7), MCR
(lane 8), TC1 (lane 9), CMV-Y (lane 10), CMV-O (lane 11), KC8 (lane 12), KN (lane 13) (表3-1
参照). RT-PCR 産物は制限酵素 HhaI により消化し、2%アガロースゲル内で電気泳動を行った。
Lane 14は制限酵素未消化のRT-PCR産物、lane M はDNA サイズマーカ(100 bpラダー)を示す.
3.2.2.2 干渉効果試験
グラジオラス分離株を含む5種類の強毒ウイルス株に対するCM95の干渉効果を調べるために 接種試験を行い、RT-PCR-RFLP 法によりチャレンジ接種後のウイルス検出を行った (表 3-5)。
CM95 接種 3 日後に強毒ウイルス株をチャレンジ接種した場合、その上位葉から強毒ウイルス株 は検出された。これらの上位葉では強毒ウイルス株の病徴と思われるモザイク症状が観察された。
600 bp
100 bp
1 M 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
ラジオラス株を含めた多くの強毒CMV株に対して高い干渉効果を示すと判断された。また、CM95 の干渉効果は接種3日後では認められず、10日後では完全であったことから、CM95は接種後し ばらくの期間を経過した後に、高い干渉効果を発揮すると考えられた。
一般に、遺伝子診断法の一つであるRT-PCR (-RFLP) 法の感度は高いとされている。RT-PCR法 と血清学的診断の一つであるELISA 法についてウイルスの検出感度を比べたところ、RT-PCR法
が ELISA 法に比べて 10,000倍程度感度が高い結果を得ている (データ省略)。したがって、この
ような高感度検出法によってチャレンジウイルスが検出されなかったことは、強毒ウイルス株の 感染が起こらなかったか感染後の増殖や移行が起こらなかった可能性が高く、これは弱毒ウイル スの干渉効果の高さを示すものと考えられる。また、本研究で開発したRT-PCR-RFLP法は、CM95 の弱毒性に関与する特有の遺伝子領域を利用しているため、更に多くの強毒ウイルス株と CM95 を識別して検出できると考えられる。
の干渉効果試験に お け る RT -PC R -R FLP と ジ ュ ウ ロ ク ササゲ を 用い た 戻 し 検定に よ る チ ャ レ ン ジ ウ イ ル ス の検出
icotiana rusticaにCM95を１次接種し、3,10日後に強毒株をチャレンジ接種した．14または30日後の上位葉について と戻し検定によりチャレンジウイルスの検出の有無（+：検出、-：未検出)を調べた. おける病徴: Y =黄化; M =モザイク; Mal = 奇形; mM =軽いモザイク; vmM =極めて軽いモザイク.ンチャレンジ接種－ウ イルス検出間の日数チャレンジ ウイルス
チャレンジ接種葉上位葉 病徴a) RT-PCR-RFLP戻し検定RT-PCR-RFLP戻し検定 14
CMV-Y++++Y,M CMV-O++++mM TC1++++Mal,M GC83++++M KC8++++M 14
CMV-Y- - - - vmM CMV-O- - - - vmM TC1- - - - vmM GC83- - - - vmM KC8- - - - vmM 30
CMV-Y- - - - vmM CMV-O- - - - vmM TC1- - - - vmM GC83- - - - vmM KC8- - - - vmM