岐阜県農業技術センター 植物防疫基礎講座：
植物病原菌の薬剤感受性検定マニュアル2016
褐斑病菌の
QoI
剤感受性検定でAOX
阻害剤に没食子酸 n―プロピル（PG）を使用しているが，本剤は葉かび病 菌のアゾキシストロビン（AZ）感受性検定においても 有効であることを確認している（渡辺，2009）。PG
はジ メチルスルホキシド（DMSO
）にあらかじめ溶解してお く（DMSO 2.5 ml
にPG 212 mg
を滅菌チューブ内で溶 解。以下PG
液。）。AZは，市販の20％製剤（アミスタ
ー20
フロアブル）100μlをメスフラスコで100 ml
にな るよう滅菌水で希釈する（AZ液）。葉かび病菌のAZ
に 対するベースライン感受性（最小生育阻止濃度：MIC
） は1 mg/l
と考えられたことから（渡辺，2009
）， AZ
は1 mg/l
の濃度で培地に添加する。200 mlのPDA
培地を 溶解して，60℃以下に冷ましてからPG
液を1 ml（PG
最終濃度：2 mM）
， AZ
液を1 ml（AZ最終濃度：1 mg/l）添加してよく混和し，シャーレに約
30 ml
分注する。な お，対照としてPG
液1 ml
のみ添加した培地を準備する。シャーレはグリッドが入った正方形のものが便利である
（Square Petri Dish，Simport社）。本シャーレ
1
枚で36
菌株が検定できる。また，検定の1
日前に培地を作製し ておくと，菌液を滴下した後の乾燥が速くなるので作業 効率がよい。3 菌叢磨砕液の滴下
前培養しておいたコロニーの先端部分をメスで無菌的 に約
5 mm
角に切り出して，800μlの滅菌水を加えた1.5 ml
容のマイクロチューブ内でペッスルを用いて十分磨砕し，菌叢磨砕液を調製する（図―
3
）。マイクロピペ ットで10μ
lを採取し，AZ添加培地および無添加培地に それぞれ滴下する。グリッドが入ったシャーレは36
マA B
図−1 葉かび病の病斑
A：分生子形成が良好で採取に適する，B：病斑上に寄生菌（矢印）が繁殖して分離に適さない．
図−2 葉かび病菌のコロニー
PDA，25℃，10日間培養後．
図−3 菌叢磨砕液の調製
ペッスルでよく磨砕する．置床時に菌体が沈殿してい る場合には，軽くタッピングして上澄みから採取する
（矢印）．
（13）ト マ ト 葉 か び 病 菌 101
スに境界線が設けられており，菌株ごとに各培地平板の 同じ位置に滴下する。多数の菌株を検定する場合には，
菌株の磨砕作業をすべて済ませてから培地に滴下するほ うが効率的である。磨砕液をしばらく放置するとマイク ロチューブの底に菌体が沈殿するため，指で軽くタッピ ングしてから上澄み液を採取するのがコツである（図―
3）。底に沈んだ粗い菌体を採取すると薬剤添加培地上で
まばらに生育が認められることがあり，判定しづらくな る。培地上の菌液がおおむね乾燥したら，25
℃，暗黒下 で10
日間培養する。4 判定方法
AZ
無添加培地で生育が認められ，添加培地で生育しない菌株をアゾキシストロビン感受性，AZ添加培地で も生育する菌株を耐性とする（図―4，口絵③，表―1）。
5 遺伝子診断
QoI
耐性菌は，本剤の作用点であるミトコンドリアの チトクロームbの遺伝子に変異が認められる場合が多 い。耐性変異型として143
番目の推定アミノ酸がグリシ ンからアラニンに置換したG143A，129
番目のフェニル アラニンがロイシンに置換したF129L
のほか，G137R が報告されている（I
SHII, 2010
）。葉かび病菌のチトクロ ームb遺伝子は，I
SHIIet al.
（2001 ； 2009
）のプライマーBccytF（5ʼ―AGAGGTATGTACTATGGATC―3ʼ）お よ び RSCBR2（5ʼ―AACAATATCTTGTCCAATTCATGG―3ʼ）
0 mg/l 1 mg/l
耐性菌 感受性菌
図−4 葉かび病菌のアゾキシストロビン感受性の判定
表−1 トマト葉かび病菌の薬剤感受性検定方法
薬剤
検定培地
菌の接種
方法 培養条件 判定基準
基本培地 薬剤濃度
（mg/l）
アゾキシストロビン
PDA（没食子
酸n―プロピル
2 mM添加）
1
菌叢磨砕液
（10μl）
25℃
10日
生育なし：感受性（S）
生育あり：耐性（R）
チオファネートメチル
PDA
1，10
1 mg/lで生育なし：感受性（S）
1 mg/lで生育，10 mg/lで生育なし：中等度耐性（MR）
1，10 mg/lで生育：高度耐性（HR）
ジエトフェンカルブ 1，100
1 mg/lで生育なし：感受性（S）
100 mg/lで生育あり：低感受性（LS）または耐性（R）
※チオファネートメチル感受性により異なる ボスカリド
YB 1 生育なし：感受性（S）
生育あり：耐性（R）
ペンチオピラド 0.5
トリフルミゾール PDA 100 菌叢 ディスク
25℃
30日
菌糸伸長量が無添加培地の10％未満：感受性（S）
同 10％以上：耐性（R）
a） 薬剤無添加の培地を対照として準備する．
a）
で増幅可能である（渡辺，2011）。ただし，実験条件に よっては，本プライマーセットで増幅されにくいことが あるため，近藤（2014）の報告も参考にされたい。トマ ト葉かび病菌のアゾキシストロビン耐性菌は，これまで 調べた限りすべて
F129L
変異株である（渡辺，2011 ；
近藤，2014）。F129LやG137R
変異株は，G143A変異株 と比較して耐性程度がやや低いことがPyricularia grisea（KIM